Dit protocol wordt beschreven hoe het opzetten van een enteroid cultuur systeem van neonatale muis of voortijdige menselijke darm, alsmede een efficiënte methode voor het verzamelen van melk van muizen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Moedermelk verbetert groei van Enteroids: een Ex Vivo Model van celproliferatie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Menselijke kleine intestinale enteroids zijn afgeleid van de crypten en als volwassen in een cel van de stam niche bevatten alle epitheliale celtypen. Het vermogen om menselijke enteroid ex vivo cultuur systemen zijn belangrijk model intestinale pathofysiologie en onderwijs van de betrokken specifieke cellulaire reacties. In de afgelopen jaren worden enteroids van muizen en mensen worden gekweekt, gepasseerd en dwarshelling weg voor toekomstig gebruik in verschillende laboratoria over de hele wereld. Dit enteroid-platform kan worden gebruikt om de effecten van verschillende behandelingen en drugs en wat de gevolgen zijn uitgeoefend op verschillende soorten cellen in de darm te testen. Hier, een protocol voor de vaststelling van primaire stamcel afkomstige kleine intestinale enteroids afgeleid van neonatale muizen en voortijdige menselijke darm wordt verstrekt. Bovendien werd dit enteroid cultuur systeem gebruikt om te testen van de effecten van soortspecifieke moedermelk. Muis moedermelk kan worden verkregen voor het efficiënt gebruik van een gemodificeerde menselijke borst pomp en uitgesproken muis melk kan vervolgens worden gebruikt voor verder onderzoek experimenten. We laten nu zien de gevolgen van uitdrukkelijke muis, menselijke, en donor moedermelk op de groei en de verspreiding van enteroids afgeleid van neonatale muizen of voortijdige menselijke dunne darm.
Inleiding
Necrotiserende enterocolitis is (NEC) de belangrijkste doodsoorzaak van gastro-intestinale aandoeningen bij premature zuigelingen, bijna 1 op 10 baby's geboren vóór 29 weken zwangerschap1,2,3te beïnvloeden. De helft van de zuigelingen met NEC vooruitgang aan de meest ernstige vorm, waar overleven slechts 10-30%4,5 is. In de Verenigde Staten, een geschatte 2-3 miljard USD per jaar zijn uitgegeven behandeling van zuigelingen met NEC6,7, maar noch de therapie de ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dierlijke procedures in deze studie werden goedgekeurd door ofwel de Washington University in St. Louis institutionele Animal Care gebruik Comité (20160187 Protocol) of institutionele dierenverzorgers van de Universiteit van Pittsburgh en gebruik Comité (Protocol 14103918). Menselijke foetale dunne darm op minder dan 24 weken zwangerschap is verkregen overeenkomstig de richtsnoeren voor het verkrijgen van de Universiteit van Pittsburgh anatomische weefsel na institutionele Review Board goedkeuring (protocol PRO14100537) aan de University of Pittsburgh Health Sciences weefselbank via een bemiddelaar-systeem. De geïdentificeerde menselijke moedermelk of gepasteuris....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Wij willen eerst onderzoeken of de menselijke moedermelk uitgedrukt of gepasteuriseerde donor moedermelk een effect gehad op de kleine intestinale enteroids. Inderdaad, menselijke moedermelk en donor moedermelk steeg de groei van neonatale muis (figuur 1A) en voortijdige menselijke afgeleide enteroids (figuur 1B).
Omdat menselijke moedermelk steeg de groei van kleine in.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het intestinaal epitheel bestaat uit vele cellulaire subtypen die verantwoordelijk zijn voor het verstrekken van host afweer tegen ziekteverwekkers, behoud van de integriteit van de barrière van de darm, en in de pathogenese van verschillende ziekten kunnen worden geschonden. Hoewel diermodellen sommige facetten van de ziekte recapituleren kunnen, biedt de ex vivo -model van enteroids die zijn afgeleid van de dunne darm van muizen en mensen een platform om te testen van de effecten van verschillende behandelinge.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen en geen belangenconflicten.
Dankbetuigingen
MG wordt ondersteund door subsidies, K08DK101608 en R03DK111473 van de National Institutes of Health, maart van dubbeltjes Stichting Grant No. 5-FY17-79, het Children's Discovery Institute of Washington University en St. Louis Children's Hospital en de afdeling Kindergeneeskunde aan de Washington University School of Medicine, St. Louis. CJL wordt ondersteund door R01DK104946 (PI: Silverman), het Children's Discovery Institute of Washington University en St. Louis Children's Hospital.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) with 4.5 g/L Glucose and L-Glutamine | Lonza | 12-604F | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Humulin N (Insulin) | Eli Lilly And Company | 0002-8315 | |
| 1x Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290-026 | |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0 | Invitrogen | 15575-020 | |
| 1x Advanced DMEM/F-12 | Invitrogen | 12634-028 | |
| 200 mM L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| 1 M N-2-Hydroxyethylpiperazine-N-2-Ethane Sulfonic Acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3537 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| 100x N-2 Supplement | Gibco | 17502-048 | |
| 50x B-27 Supplement Minus Vitamin A | Gibco | 08-0085SA | |
| 100x ROCK Inhibitor Y-27632, Dihydrochloride | Sigma-Aldrich | Y0503 | |
| Recombinant Mouse Wnt3a Protein | R&D Systems | 1324-WN | |
| Murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Recombinant Mouse R-Spondin 1 | R&D Systems | 3474-RS | |
| Recombinant Murine Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 315-09 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | |
| 35 x 10 mm Cell Culture Petri Dish | Eppendorf | 0030700112 | |
| 24-Well Cell Culture Plate | Eppendorf | 0030722116 | |
| 48-Well Cell Culture Plate | Eppendorf | 0030723112 | |
| 8-Well Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System | Thermo Scientific | 154534 | |
| 50 mL Conical Tube | Corning | 352070 | |
| 100 μM Sterile Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-549 | |
| 70 μM Sterile Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| 1x Phosphate-Buffered Saline (PBS), pH 7.2 | Invitrogen | 20012-027 | |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Normal Donkey Serum (NDS) | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-D | |
| Confocal Microscope Leica TCS SP8 X | Leica Microsystems | N/A | |
| Photoshop CS6 | Adobe Systems | N/A | |
| 18 G 1.5 Inch Needle | Becton Dickinson | 305196 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | 792632 | |
| Oxytocin | Sigma-Aldrich | O3251 | |
| Human Double Electric Breast Pump | Lansinoh | 044677530163 | |
| 5 mL Round Bottom Test Tube | Corning | 352058 | |
| Rubber Stoppers | Frey Scientific | 560761 | |
| Ki67 Antibody | Abcam | AB15580 | |
| Human Mki67 primer F: 5'-GACCTCAAACTGGCTCCTAATC-3' R: 5'-GCTGCCAGATAGAGTCAGAAAG-3' | Integrated DNA Technologies | N/A |
Referenties
- Patel, R. M., Denning, P. W. Therapeutic use of prebiotics, probiotics, and postbiotics to prevent necrotizing enterocolitis: what is the current evidence? Clin Perinatol. 40 (1), 11-25 (2013).
- Caplan, M. S., Jilling, T. New concepts i....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
