Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Enzymatische Cascade reacties voor de synthese van chirale Amino alcoholen van L-lysine

11.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/56926

⸱

16 februari 2018

 ,  , 
1Génomique Métabolique, Genoscope, Institut François Jacob, CEA, CNRS, Univ Evry, Univ Paris-Saclay

In dit artikel

Samenvatting

Chirale amino alcoholen zijn veelzijdige moleculen voor gebruik als steigers in de organische synthese. Vanaf L-lysine, synthetiseren we amino alcoholen door een reactie van de enzymatische trapsgewijs combineren diastereoselective C-H oxidatie gekatalyseerd door dioxygenase gevolgd door splitsing van het carbonzuur deel van het overeenkomstige aminozuur van de hydroxyl door een decarboxylase.

Samenvatting

Amino alcoholen zijn veelzijdige verbindingen met een breed scala van toepassingen. Bijvoorbeeld, zijn zij als chirale steigers in de organische synthese gebruikt. Hun synthese door conventionele organische chemie vereist vaak vervelend scriptingregel syntheseprocessen, met moeilijk controle van de stereochemische uitkomst. We presenteren een protocol bij enzymatisch synthetize amino alcoholen vanaf de beschikbaar L-lysine in 48u. Dit protocol combineert twee chemische reacties die zeer moeilijk uit te voeren door conventionele organische synthese. In de eerste stap, de regio- en diastereoselective oxidatie van een unactivated obligatie van de C-H voor de lysine wordt zijketen gekatalyseerd door een dioxygenase; een tweede regio- en diastereoselective oxidatie gekatalyseerd door een regiodivergent dioxygenase kan leiden tot de vorming van de 1,2-diolen. In de laatste stap, de carboxylic groep van het Alfa-aminozuur is gekloofd door een decarboxylase pyridoxal-fosfaat (PLP) (DC). Deze decarboxylative stap is alleen van invloed op de alpha koolstof van het aminozuur, behoud van de hydroxy-gesubstitueerde stereogenic center in een beta/gamma positie. De resulterende amino alcoholen zijn daarom optisch verrijkt. Het protocol werd met succes toegepast op de semipreparative-schaal synthese van vier amino alcoholen. Monitoring van de reacties werd uitgevoerd door hoge prestatie vloeibare chromatografie (HPLC) na bewerking door 1-fluoro-2,4-dinitrobenzeen. Eenvoudige zuivering door solid-phase extraction (SPE) geboden de amino alcoholen met uitstekende rendementen (93% tot > 95%).

Inleiding

Ondanks de voordelen aangeboden door biokatalyse, blijft de integratie van biokatalytische stappen in synthetische trajecten of totale Biokatalytische routes meestal beperkt tot enzymatische kinetische resoluties. Deze routes hebben op grote schaal gebruikt als een eerste stap in asymmetrische chemo-enzymatische reacties, maar biokatalyse biedt veel meer mogelijkheden in functionele groep interconversies met hoge stereoselectiviteit1,2,3 . Bovendien, zoals Biokatalytische reacties zijn uitgevoerd in vergelijkbare omstandigheden, daarom is het haalbaar is voor het uitvoeren van trapsgewijze reacties in een één-pot mode4,5.

Chirale amino alcoholen zijn veelzijdige moleculen voor gebruik als assistenten of steigers in organische synthese6. De amino alcohol deel daarvan wordt vaak gevonden in secundaire metabolieten en in actieve farmaceutische ingrediënten (API). Primaire β-amino alcoholen zijn gemakkelijk beschikbaar van de bijbehorende α-aminozuren door conventionele chemische synthese, maar toegang tot chirale γ-amino alcoholen of secundaire amino alcoholen vereist vaak vervelend synthetische trajecten samen met gevoelige controle van de stereochemie7,8,9,10. Als gevolg van de hoge stereoselectiviteit, kan biokatalyse bieden een superieure synthetische route naar deze chirale bouwstenen11,12,13,14.

We eerder gemeld de synthese van mono - en di-hydroxy-L-lysines door enzymatische hydroxylatie diastereoselective gekatalyseerd door dioxygenases van het ijzer (II) / α-ketoacid-afhankelijke oxygenase familie (αKAO) (Figuur 1)15. In het bijzonder vanaf L-lysine, de KDO1 dioxygenase katalyseert de vorming van de (3S) - hydroxy derivaat (1), terwijl de (4R) - derivaat (2) wordt gevormd door de reactie met KDO2 dioxygenase. Opeenvolgende regiodivergent hydroxyleringen door KDO1 en KDO2 leiden tot de vorming van de (3R, 4R) - dihydroxy - L-lysine (3) in optisch zuivere vorm. Het bereik van de beperkte substraat van deze enzymen belemmert echter hun grote gebruik in de chemische synthese, met name in de hydroxylatie van eenvoudige amines, zoals een carbonzuur deel daarvan in de α-positie van de aminogroep essentieel voor de activiteit16 is.

figure-introduction-1
Figuur 1: Biokatalytische conversies van L-lysine. Omzetting in (3S) - hydroxy - L-lysine (1) gekatalyseerd door KDO1 de dioxygenase; (4R) - hydroxy - L-lysine (2) gekatalyseerd door KDO2 de dioxygenase; en 3R, 4R- dihydroxy - L-lysine (3) door cascade-reactie achtereenvolgens gekatalyseerd door KDO1 en KDO2 dioxygenases. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Decarboxylering is een gemeenschappelijke reactie in metabolisme17. In het bijzonder, aminozuur DCs (EG 4.1.1) cofactor-vrij (pyruvoyl-afhankelijk) of PLP-afhankelijke enzymen en katalyseren de decarboxylering van aminozuren in de overeenkomstige polyaminen in bacteriën en hogere organismen18,19 , 20 , 21 , 22. het mono- en dihydroxy verbindingen (Figuur 3) 4-7, 10-11 correspondeert gehydroxyleerde cadaverine, de diamine verkregen door decarboxylering van L-lysine. Cadaverine is een belangrijke bouwsteen voor de chemische industrie, specifiek zijn een onderdeel van polyamide en polyurethaan polymeren. Daarom, bio-gebaseerde productie deze orthofenyleendiamine uit hernieuwbare bronnen heeft de aandacht getrokken als alternatief voor de aardolie gebaseerde route en verschillende micro-organismen hebben ontworpen voor dit doel. In deze stofwisselingsroutes is lysine DC (LDC) het belangrijkste enzym. LDC is een PLP-afhankelijke enzym die behoren tot de alanine racemase (AR) structurele familie23. De PLP-afhankelijke DCs (PLP-DCs) staan bekend als zeer substraat-specifieke. Echter, een paar enzymen eigen het vermogen van lichte promiscuïteit, het actief naar de aminozuren L-ornithine zowel L-lysine, als bijvoorbeeld de LDC van Selenomonas rumirantium (LDCSrum), die heeft soortgelijke kinetische constanten voor lysine en ornithine decarboxylering24,25. Dit uitgebreide substraat specificiteit maakt dit enzym een goede kandidaat voor de decarboxylering van mono - en di-hydroxy-L-lysine. Daarnaast vind je DCs actief naar de hydroxyl-afgeleiden van lysine, onderzochten we de genomic context van de genen coderend voor de αKAO enzymen. Inderdaad, in prokaryotische genomen de genen coderend voor enzymen die betrokken zijn bij de dezelfde biosynthetic traject zijn over het algemeen mede gelokaliseerd in gen clusters. Het gen KDO2 (vanaf Chitinophaga pinensis) werd gevonden samen met een codering van vermeende PLP-DC (Figuur 2) gen gelokaliseerd. Daarentegen is geen gene codering voor DC gebleken bij het analyseren van de genomic context van de KDO1 dioxygenase. Het eiwit PLP-DC van C. pinensis (DCCpin) werd daarom gekozen een veelbelovende kandidaat te katalyseren de decarboxylering stap van de cascade-reactie.

figure-introduction-2
Figuur 2: Genomic context van KDO2 gen in C. pinensis. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Dus ontworpen we trapsgewijs enzymatische reacties met dioxygenases en DCs te bereiken van de synthese van alifatische chirale β - en γ-amino alcoholen van aminozuren (Figuur 3). Zoals eerder gemeld introduceert de oxidatie van de C-H gekatalyseerd door de αKAO de hydroxy-gesubstitueerde stereogenic center met totale diastereoselectivity; de Cβ/γ chiraliteit zal worden bewaard in de decarboxylative stap, die alleen van invloed op de koolstof van de Cα van het aminozuur groep16.

figure-introduction-3
Figuur 3: analyse van Retrosynthetic. (A) Retrosynthese analyse van β - en γ-amino alcoholen (R) - 1,5 - diaminopentan-2-ol (4) (5R) - hydroxy - L-Lysine, en (S) - 1,5 - diaminopentan-2-ol (5) en 1,5-diaminopentan-3-ol (6) uit L-lysine. (B) Retrosynthese analyse van β, γ- en δ-amino diolen (2S, 3S), β - 1,5 - diaminopentane-2,3-diol (10) en (2R, 4S) - 1,5 - diaminopentane-2,4-diol (11) vanaf (5R)- Hydroxy-L-lysine, en 2R, 3R- 1,5 - diaminopentane-2,3-diol (7) vanaf L-lysine. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Vanaf L-lysine en haar 5R-hydroxy derivaat, rapporteren we hierin een twee/drie stap één pot, enzymatische procedure combineren dioxygenases en PLP-DCs te verkrijgen het doel amino alcoholen. Voorafgaande de synthese duurzaame laboratorium van de moleculen van het doel, de methode is ontwikkeld op de analytische schaal aan te passen de voorwaarden van de reactie, bijvoorbeeld, de concentraties van het enzym, nodig om volledige conversie van de grondstoffen; presenteren wij deze procedure zo goed.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. de enzympreparaat

  1. Express en zuiveren van eiwitten als eerder beschreven26.
    Opmerking: Recombinante eiwitten werden verkregen met de volgende eindconcentraties: αKAO van Catenulispora acidiphila, UniProtKB-ID: C7QJ42 (KDO1), 1,35 mg/mL; ΑKAO van C. pinensis, UniProtKB-ID: C7PLM6 (KDO2), 2,29 mg/mL; PLP-DCs van S. rumirantium, UniProtKB-ID: O50657 (LDCSrum), cel gratis uittreksel met totale enzym 12.44 mg/ml; PLP-DC van C. pinensis, UniProtKB-ID: C7PLM7 (DCCpin), 2,62 mg/mL.

2. bereiding van de oplossingen

Opmerking: Alle onderstaande oplossingen zijn bereid in gedeïoniseerd water.

  1. Bereiden van 1 M HEPES-buffer, pH 7.5; aanpassen met 5 M NaOH.
    Opmerking: Tijdens de pH aanpassing stap, Draag beschermende handschoenen, beschermende kleding en oogbescherming bescherming voor het gezicht (P280). Bij aanraking met de ogen (P305, P351, P338), voorzichtig spoelen met water voor verscheidene min. verwijderen contactlenzen indien mogelijk. Blijven spoelen en onmiddellijk bellen een vergif center of Arts (P310). De P-code verwijst naar de verklaring van het voorzorgsbeginsel (gevaren klasse en categorie; zie, bijvoorbeeld, pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ghs/).
  2. Bereiden van 100 mM L-lysine, 100 mM (5S) - hydroxy - L-lysine, 150 mM α-ketoglutaric zuur, 100 mM natrium ascorbaat, 10 mM ammonium ijzer(II) sulfaat-hexahydraat (Mohr zout), 100 mM pyridoxal 5-fosfaat (PLP) en 100 mM dithiothreitol (DTT).
  3. Bereiden 1 M, 2M en 6M zoutzuur (HCl) van een 37% HCl-oplossing (ongeveer 12 M oplossing), na de dezelfde veiligheidsvoorschriften als beschreven in punt 2.1.
    Opmerking: De oplossingen van α-ketoglutaric zuur, natrium ascorbaat en ammonium ijzer(II) sulfaat-hexahydraat moeten geschieden vers op de dag van gebruik. De lysine-oplossing kan maandenlang bij kamertemperatuur worden opgeslagen. De PLP oplossing kan worden opgeslagen voor een maand bij 4 ° C. De DTT-oplossing kan worden opgeslagen voor een maand bij-20 ° C.

3. analytische-schaal reacties

  1. Het ontwikkelen van methoden voor de reactie van de decarboxylering (5R) - hydroxy - L-lysine
    1. Voeg 11 µL van 1 M oplossing van HEPES-buffer pH 7.5 (eindconcentratie 50 mM) tot een 2 mL microtube. Voeg vervolgens 22 µL van 100 mM (5S) - hydroxy - L-lysine (eindconcentratie 10 mM), 2.2 µL van 100 mM PLP (eindconcentratie 1 mM), en 2.2 µL van 100 mM DTT (eindconcentratie 1 mM).
      Opmerking: In het geval van reactie met LDCSrum, de toevoeging van DTT is niet nodig.
    2. Toevoegen van de gezuiverde PLP-DC (definitieve concentratie van 0,1 mg/mL). Compleet met H2O voor een eindvolume van 220 µL.
    3. Schud het reactiemengsel bij kamertemperatuur, met een open deksel in open lucht, bij 300 omwentelingen per minuut gedurende 3 uur.
      Opmerking: Het reactiemengsel met een open deksel schudden in open lucht zorgt voor een goede oxygenatie van de media van de reactie. Het is niet daarom moet bubble zuurstof in de media reactie.
    4. Het verzamelen van 10 µL van het reactiemengsel worden onderzocht volgens de controleprocedure van reactie beschreven in stap 6. De monsters worden bij voorkeur derivatized en geanalyseerd onmiddellijk na de monsterneming.
  2. Het ontwikkelen van methoden voor de reactie van de enzymatische trapsgewijs combineren een hydroxylatie stap gekatalyseerd door αKAO met decarboxylering gekatalyseerd door PLP-DC
    1. Voeg 11 µL van 1 M HEPES-buffer pH 7.5 (eindconcentratie 50 mM) tot een 2 mL microtube. Voeg vervolgens 22 µL van 150 mM van α-ketoglutaric zuur (eindconcentratie 15 mM), 5,5 µL van 100 mM van natrium ascorbaat (eindconcentratie 2.5 mM), 22 µL van 10 mM van Mohr de zout (eindconcentratie 1 mM), en 22 µL van 100 mM van L-lysine (eindconcentratie 10 mM).
    2. Compleet met H2O voor een eindvolume van 220 µL, rekening houdend met het volume van de oplossing van het enzym te worden toegevoegd in stap 3.2.3.
    3. Toevoegen van de vereiste gezuiverde αKAO enzym volgens de gerichte regioselectiviteit: KDO1 voor de hydroxylatie in positie C-3 of KDO2 voor de C-4 positie van L-lysine. De uiteindelijke concentratie van het gezuiverde enzym (0,05-0,5 mg/mL) was vastbesloten om een volledige omzetting in ongeveer 3 h.
    4. Schud het reactiemengsel bij kamertemperatuur, met een open deksel in open lucht, bij 300 omwentelingen per minuut gedurende 3 uur.
    5. Voeg 2.2 µL van 100 mM voor de PLP (eindconcentratie ~ 1 mM) en 2.2 µL van 100 mM van DTT (eindconcentratie ~ 1 mM).
      Opmerking: In het geval van reactie met LDCSrum, de toevoeging van DTT is niet nodig.
    6. De gezuiverde PLP-DC toevoegen bij een concentratie waardoor volledige conversie in 18 h: LDCSrum op een geschatte uiteindelijke concentratie van 0,1 mg/mL voor de cascade-reactie met KDO1 en DCCpin op een geschatte eindconcentratie van 0,5 mg/mL voor de Cascade-reactie met KDO2.
    7. Schud het reactiemengsel bij kamertemperatuur, met een open deksel in open lucht op 300 rpm voor 18u.
    8. Een controle uitvoeren zoals in stap 3.1.4.
  3. Het ontwikkelen van methoden voor de reactie van de enzymatische trapsgewijs combineren twee hydroxylatie stappen gekatalyseerd door αKAOs met decarboxylering gekatalyseerd door PLP-DC
    1. Voer stappen 3.2.1-3.2.2.
    2. Voeg KDO1 aan een eindconcentratie van 0,05 mg/mL. Schud het reactiemengsel bij kamertemperatuur, met een open deksel in open lucht, bij 300 omwentelingen per minuut gedurende 3 uur.
    3. KDO2 op een geschatte eindconcentratie van 0,5 mg/mL, berekend op basis van het volume van de eerste reactie toevoegen. Schud het reactiemengsel bij kamertemperatuur, met een open deksel in open lucht, bij 300 omwentelingen per minuut gedurende 18 uur.
    4. Voer stap 3.2.5.
    5. De gezuiverde PLP-DC-DCCpin op een geschatte eindconcentratie van 0,5 mg/mL, berekend op basis van het volume van de eerste reactie toevoegen. Schud het reactiemengsel bij kamertemperatuur, met een open deksel in open lucht, bij 300 omwentelingen per minuut gedurende 18 uur.
    6. Voer de controleprocedure zoals in stap 3.1.4.

4. semi-preparatieve One-pot Biokatalytische reactie

Opmerking: Enzymatische reacties worden uitgevoerd op 0.1 mmol van L-lysine in een openlucht 250 mL glas conische kolf voor een totaal volume van 10 mL.

  1. Synthese van de monohydroxylated-derivaten
    1. Voeg 0,5 mL 1 M HEPES-buffer, pH 7.5 (eindconcentratie 50 mM) in de kolf. Voeg vervolgens 1 mL van 100 mM L-lysine (eindconcentratie 10 mM), 1 mL 150 mM α-ketoglutaric zuur (eindconcentratie 15 mM), 0,25 mL voor 100 mM natrium ascorbaat (eindconcentratie 2.5 mM), en 1 mL 10 mM Mohr's zout (eindconcentratie 1 mM).
    2. Compleet met H2O voor een eindvolume van 10 mL, rekening houdend met het volume van de oplossing van het enzym te worden toegevoegd in stap 4.1.3.
    3. Toevoegen van de vereiste gezuiverde αKAO enzym volgens de gerichte regioselectiviteit: KDO1 op een eindconcentratie van 0.075 mg/mL voor hydroxylatie in positie C-3 of KDO2 op een eindconcentratie van 0,5 mg/mL voor positie C-4 van L-lysine. De uiteindelijke concentratie van het gezuiverde enzym was vastbesloten om een volledige omzetting in ongeveer 3 h.
    4. Schud het reactiemengsel bij kamertemperatuur op 300 rpm voor de passende duur. Wanneer de controle van de reactie aangeeft een reactie van de voltooide hydroxylatie (alle stappen beschreven in stap 6 voor de reactie controle protocol worden uitgevoerd), gaat u verder met stap 4.1.5. Een typische reactietijd is 3 h.
    5. Voeg 100 µL van 100 mM PLP aan het reactiemengsel αKAO (eindconcentratie ~ 1 mM). Dan, voeg 100 µL van 100 mM DTT (eindconcentratie ~ 1 mM), behalve bij gebruik van LDCSrum.
    6. Toevoegen van gezuiverde PLP-DC: LDCSrum op een geschatte eindconcentratie van 0,05 mg/mL voor de cascade-reactie met KDO1 of DCCpin op een geschatte eindconcentratie van 0,5 mg/mL voor de cascade-reactie met KDO2.
    7. Het reactiemengsel schudden bij kamertemperatuur, 300 rpm, voor 18 h en rechtstreeks naar de stappen die zijn beschreven in stap 4.3 blijven.
  2. Synthese van de afgeleide van de dihydroxylated
    1. Voeg 0,5 mL 1 M HEPES-buffer, pH 7.5 (eindconcentratie 50 mM), 1 mL van 100 mM L-lysine (eindconcentratie 10 mM), 1 mL 150 mM α-ketoglutaric zuur (eindconcentratie 15 mM), 0,25 mL voor 100 mM natrium ascorbaat (eindconcentratie 2.5 mM) , en 1 mL 10 mM Mohr's zout (eindconcentratie 1 mM). Compleet met H2O voor een eindvolume van 10 mL, rekening houdend met het volume van de oplossing van het enzym te worden toegevoegd in stap 4.2.2.
    2. KDO1 toevoegen aan een eindconcentratie van 0.075 mg/mL. Schud het reactiemengsel bij kamertemperatuur, op 300 rpm voor de passende duur.
    3. Wanneer de controle van de reactie geeft een voltooide hydroxylatie reactie (zie stap 6 voor de reactie monitoring protocol), gaat u verder met stap 4.2.5. Een typische reactietijd is 3 h.
    4. Voeg vervolgens 1 mL van 150 mM α-ketoglutaric zuur (eindconcentratie 15 mM), 0,25 mL voor 100 mM natrium ascorbaat (eindconcentratie 2.5 mM), en 1 mL 10 mM Mohr's zout (eindconcentratie 1 mM).
    5. KDO2 toevoegen aan een geschatte eindconcentratie van 0,5 mg/mL, berekend op basis van het volume van de eerste reactie. Schud het reactiemengsel bij kamertemperatuur op 300 rpm voor 18u.
    6. Wanneer de controle van de reactie geeft een voltooide dihydroxylation reactie (zie stap 6 voor de reactie monitoring protocol), gaat u verder met stap 4.2.7. Een typische reactietijd is 18 h.
    7. Voeg 100 µL van 100 mM van DTT (eindconcentratie ~ 1 mM), behalve bij gebruik van de LDCSrum.
    8. De gezuiverde DC-Cpin op een geschatte eindconcentratie van 0,5 mg/mL, berekend op basis van het volume van de eerste reactie toevoegen.
    9. Schud het reactiemengsel bij kamertemperatuur op 300 rpm voor 18u.
  3. Blussen
    1. Het reactiemengsel afkoelen door het plaatsen van het glas van 250 mL conische kolf in een ijsbad.
    2. Voeg zorgvuldig, over ongeveer 1 min, 0,25 mL 6 M HCl door de afgekoelde reactiemengsel handmatig zachtjes te schudden. Volg de veiligheidsinstructies op dezelfde als die welke zijn beschreven in stap 2.1.
    3. Overdracht de zure mengsel in een centrifuge van de conische bodem 50 mL tube met behulp van een glazen pipet van Pasteur uitgerust met een lamp, centrifugeer dan bij 1,680 x g- en 4 ° C gedurende 15 minuten.
    4. Trekken het supernatant en houd het opzij in een rondbodemkolf van 250 mL.
    5. Voeg 10 mL gedeïoniseerd water aan de conische bodem centrifugebuis met de pellet. Vortex aan resuspendeer de pellet.
    6. Centrifuge op 1680 x g, 4 ° C, gedurende 15 minuten.
    7. Trekken van het supernatant en toevoegen aan de 250 mL Rondbodemkolf met het eerste supernatant (stap 4.3.4).
    8. De verzamelde supernatant bevriezen door onderdompeling van de kolf in vloeibare stikstof met constante hand zwenken en de kolf direct overbrengen in een benchtop variëteit freeze-droger om te voorkomen dat het materiaal ontdooien.
    9. Nadat de freeze-drying is voltooid ('s nachts), verwijdert u de kolf uit de freeze-droger.

5. reiniging van Amino alcoholen uit ruwe enzymatische reactiemengsel

  1. Ionenwisseling hars
    1. Het gevriesdroogd product los in de minimale hoeveelheid waterige 0,1 M HCl (ongeveer 4 mL) tot vaste deeltjes niet langer zichtbaar voor het blote-oog zijn.
    2. Voorwaarde van een sulfonzuur functiegroep cation exchange hars, 200-400 gaas, in een glazen kolom (20 x 250 mm) door eluerende bij atmosferische druk 1 M HCl (4 kolom volumes) gevolgd door 0,1 M HCl (4 kolom volumes; kolom volume = 10 mL).
    3. Het monster zorgvuldig bij de bovenkant van de hars op de muren van de glazen kolom met een 1.000 µL micropipet laden. Spoel vervolgens de conische bodem centrifugebuis die het ruwe product driemaal met 1 mL 0,1 M HCl waterige oplossing per wassen, en de resulterende spoelen volumes op de kolom op dezelfde manier laden.
    4. Elueer met een niet-lineaire kleurovergang: 4 kolom volumes van 0,1 M HCl, 4 kolom delen water, 4 kolom volumes van 5% NH4OH, 4 kolom volumes van 10% NH4OH, 4 kolom hoeveelheid 15% NH4OH, 4 kolom volumes van 20% NH4OH , 4 kolom delen van 25% NH4OH en tot slot 4 kolom volumes van 28% NH4OH.
    5. Controleren van de zuivering door HPLC (zie stap 6).
    6. Zwembad de breuken met de compound (NH4OH 20-28%) en freeze-dry zoals beschreven in stappen 4.3.8-4.3.9.
      Opmerking: De ionenwisseling kolom kan worden hergebruikt na elutie met gedeïoniseerd water tot neutralisatie van elutie water (ongeveer 50 mL) gevolgd door reconditionering door eluerende met 50 mL 1 M HCl.
  2. SPE
    1. Solubilize de gevriesdroogde compound in ongeveer 2 mL H3PO4/water (20 µL/mL).
    2. Plaats een gemengde modus catie-exchange SPE 6 mL-patroon op een variëteit van extractie verbonden aan een waterpomp. Voorwaarde de patroon door tekening via 4 mL methanol onder verlaagde druk geboden door de variëteit. De cartridge equilibreer door te tekenen door middel van 4 mL van H3PO4/water (20 µL/mL).
    3. Laden van het monster op de cartridge met behulp van een 1.000 µL micropipet bij de bovenkant van de hars op de muren van de glazen kolom, en spoel de flacon met het product driemaal met 0,75 mL H3PO4/water (20 µL/mL) per wasbeurt. Het resulterende spoelen volume op de kolom op dezelfde manier laden.
    4. Wassen van de cartridge door eluerende onder verlaagde druk, geboden door de variëteit, 4 mL 2% CH3OH in water en daarna met 4 mL water. Elueer met een gradiënt van NH4OH in water (4 mL voor elke elutie, vanaf 4% NH4OH: 10%, 15%, 15%, 20% en 28%).
    5. De zuivering door HPLC controleren door het analyseren van elke fractie volgens de reactie controle protocol beschreven in stap 6. Houd alle breuken met zuivere gewenste afgeleide volgens chromatogram van ultraviolet (UV) en gaat u verder met stap 5.2.6.
    6. Zwembad de breuken met de gewenste samengestelde in een 100 mL ronde onderkant kolf, de buizen met de breuken met water spoelen en het volume van de spoelen aan de 100 mL toevoegen ronde onderkant kolf.
    7. Verwijder het oplosmiddel onder verminderde druk met behulp van een rotatieverdamper voorzien van een waterkoker Bad thermostaat bij 40 ° C en verbonden met een vacuümpomp vastgesteldop 10 mbar.
    8. Solubilize van de vaste stof in een minimale hoeveelheid water en breng de oplossing kwantitatief over in een gewogen 25 mL ronde onderkant kolf. Spoel de kolf met een minimale hoeveelheid water, het volume van de spoelen in de maatkolf van 25 mL toevoegen en gaat u verder met stap 5.2.9.
    9. Het gezuiverde product wegen en het rendement te berekenen.
    10. Los van het gezuiverde product in het minimale volume van 2M HCl tot vaste deeltjes niet langer zichtbaar voor het blote oog zijn- en freeze-dry zoals beschreven in stappen 4.3.8-4.3.9.
      Opmerking: De amino alcoholen zijn gevoelige verbindingen en worden gehouden als hydrochloride zouten.

6. reactie Monitoring en productanalyse

  1. Bewerking van substraten en producten vóór de HPLC analyse
    Opmerking: De substraten en producten moeten worden derivatized als aromatische derivaten te verhogen hun chromatografische UV-detectivity. We gebruikten 1-fluoro-2,4-dinitrobenzeen (DNFB). Elk monster werd geïnjecteerd in de HPLC onmiddellijk na bewerking.
    1. Neem 10 µL van de enzymatische reactie en de overdracht naar een 1,5 mL microtube. 10 µL van 0,25 M van NaHCO3 waterige oplossing, 100 µL van ethanol en 30 µL van 2,5 mg/mL van de oplossing van de DNFB in ethanol toevoegen.
    2. Sluit de microtube en schudden van de resulterende oplossing gedurende 1 uur bij 65 ° C, bij 1000 omwentelingen per minuut. Doven met 10 µL 1 M HCl.
    3. Filteren via een 4 mm diameter niet-steriele injectiespuit filter met een membraan met hydrofiele Polyvinylideenfluoride (PVDF) fluoride van 0,22 µm porie grootte is met behulp van een spuit van 1 mL Luer.
  2. Controle van de reactie van de dioxygenase met behulp van elk systeem staat van het scheiden van derivatized aminozuren uitvoeren Dit protocol omvat UV detectie van derivatized door de dinitrobenzeen (DNB) chromofore groep27aminozuren.
    1. Passen de HPLC met C18 met een trimethyl silyl endcapping reversed-phase kolom (5 µm, 3 x 150 mm).
    2. De C18-kolom met (30:70) Eluens B equilibreer (acetonitril + 0,1% TFA) naar Eluens A (H2O + 0,1% TFA) op een debiet van 1 mL/min en 35 ° C gedurende 15 minuten staan (wat overeenkomt met ongeveer 20 kolom delen).
    3. Injecteren van 10 µL van het reactiemengsel derivatized (zie stap 6.1) op de HPLC C18-kolom. Gebruik een mengsel van acetonitril, 0,1% TFA/H2O en 0,1% TFA als eluens met een lineaire gradiënt (verhouding 30:70 tot 70:30 in 9 min, temperatuur 35 ° C, flow 1 mL/min).
    4. Gebruik van UV-detectie vastgesteldop 400 nm tot het analyseren van de producten op de chromatografische kolom geëlueerd. DNB-lysine GC meestal ongeveer 6.5 min, gehydroxyleerde DNB-lysine ongeveer 5.5 min dihydroxylated DNB-lysine ongeveer 4.2 min en DNB-aminodiol ongeveer 5,3 min.

7. NMR analyse van gezuiverde Amino alcoholen

  1. Ontbinden van gezuiverde amino alcoholen in D2O (700 µL) en breng de oplossing over in een nucleaire magnetische resonantie (NMR) buis.
  2. 1H en 13C-NMR spectra volgens passende NMR facility-protocollen28verwerven.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

We hebben eerder de synthese van mono - en di-hydroxy-L-lysines gemeld door enzymatische hydroxylatie diastereoselective gekatalyseerd door dioxygenases van het ijzer (II) / αKAO familie (Figuur 1)16. Voor het optimaliseren van het protocol voor de gehele cascades gepresenteerde, die het combineren van één of twee hydroxylatie stappen gekatalyseerd door een αKAO gevolgd door een stap van de decarboxylering gekatalyseerd door een PLP-DC...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Chirale amino alcoholen en derivaten hebben een breed scala van toepassingen, gaande van chirale assistenten voor organische synthese op farmaceutische therapie. Meerstaps synthese voor de productie van amino alcoholen door conventionele organische synthese zijn talrijk, maar kan niet altijd efficiënt vanwege vervelende bescherming/deprotection stappen samen met een gevoelige controle van de stereochemie16. Een Biokatalytische aanpak die met de bescherming/deprotection stappen uitdeelt en is meest...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs bedanken Véronique de Berardinis voor vruchtbare discussie en Alain Perret, Christine Pellé en Peggy Sirvain voor technische ondersteuning.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
HEPESSigma AldrichH3375
L-lysine hydrochlorideSigma AldrichL5626
(5S)-hydroxy-L-lysineSigma AldrichGPS NONHOut sourcing
α-ketoglutaric acidSigma Aldrich75892
Sodium ascorbateSigma AldrichA7631
Ammonium Iron(II) sulfate hexahydrateAcros201370250
Pyridoxal phosphate (PLP)Sigma Aldrich82870
3,4-dimercaptobutane-1,2-diol (DTT)Sigma AldrichD0632
1-fluoro-2,4-dinitrobenzene (DNFB)Sigma AldrichD1529
EthanolVWR20825.290
Sodium hydrogen carbonateSigma Aldrich71631
HCl 37%Sigma Aldrich435570
HCl 0.1MFluka35335
Acetonitrile HiPerSolv CHROMANORM for LC-MSVWR83640.320
2,2,2-trifluoroacetic acidVWR153112E
Ammonia 28%VWR21182.294
Methanol HiPerSolv CHROMANORM for LC-MSVWR83638.32
Formic acidAcros270480010
Phosphoric acid 85%Acros201145000
Deuterium oxideAcros320,710,075
NaOHSigma AldrichS5881
C18 HPLC columnPhenomenex00F-4601-Y0
Accela UHPLC SystemThermoFisher Scientific
Accela PDA detectorThermoFisher Scientific
4mm syringe filters - 0,22µm - PVDFMerckSLGVR04NL
Single-use tuberculin syringe with ml graduation, Luer tipVWRHSWA5010.200V0
Cation exchange resin 100-200 meshSigma Aldrich217506
Mixed mode cation-exchange solid-phase extraction cartridge 6 mLWaters186000776
Extraction manifoldWatersWAT200609
Rotary evaporatorBüchi531-0103
Lyophilizer alpha 1-2 LDplusChristL083302
Micropipette 20 µLEppendorf3121000031
Micropipette 100 µLEppendorf3121000074
Micropipette 500 µLEppendorf3121000112
Micropipette 1000 µLEppendorf3121000120
300 MHz spectrometerBruker
2 mL microtubeCLEARLineCL20.002.0500
50 mL conical-bottom centrifuge tubeFischer Scientific05-539-8
25 mL round-bottom flask 14/23Fischer Scientific10353331
100 mL round-bottom flask 29/32Fischer Scientific11786183
250 mL round-bottom flask 29/32Fischer Scientific11786183
250 mL erlenmeyer flaskFischerbrand15496143

Referenties

  1. Nestl, B. M., Hammer, S. C., Nebel, B. A., Hauer, B. New Generation of Biocatalysts for Organic Synthesis. Ang. Chem. Int. Ed. 53 (12), 3070-3095 (2014).
  2. Reetz, M. T. Biocatalysis in Organic Chemistry and Biotechnology: Past, Present, and Future. J. Am. Chem. Soc. 135 (34), 12480-12496 (2013).
  3. Turner, N. J., O'Reilly, E. Biocatalytic retrosynthesis. Nat. Chem. Biol. 9 (5), 285-288 (2013).
  4. Oroz-Guinea, I., Garcia-Junceda, E. Enzyme catalysed tandem reactions. Curr. Opin. Chem. Biol. 17 (2), 236-249 (2013).
  5. Ricca, E., Brucher, B., Schrittwieser, J. H. Multi-Enzymatic Cascade Reactions: Overview and Perspectives. Adv. Syn. Catal. 353 (13), 2239-2262 (2011).
  6. Ager, D. J., Prakash, I., Schaad, D. R. 1,2-Amino Alcohols and Their Heterocyclic Derivatives as Chiral Auxiliaries in Asymmetric Synthesis. Chem. Rev. 96 (2), 835-876 (1996).
  7. Abiko, A., Masamune, S. An improved, convenient procedure for reduction of amino acids to aminoalcohols: Use of NaBH4-H2SO4. Tet. Lett. 33 (38), 5517-5518 (1992).
  8. McKennon, M. J., Meyers, A. I., Drauz, K., Schwarm, M. A convenient reduction of amino acids and their derivatives. J. Org. Chem. 58 (13), 3568-3571 (1993).
  9. Singh, P., Samanta, K., Das, S. K., Panda, G. Amino acid chirons: a tool for asymmetric synthesis of heterocycles. Org. Biomol. Chem. 12 (33), 6297-6339 (2014).
  10. Colomer, I., et al. Aminomethylhydroxylation of alkenes: Exploitation in the synthesis of scaffolds for small molecule libraries. Bioorg. Med. Chem. 23 (11), 2736-2740 (2015).
  11. Steinreiber, J., et al. Synthesis of Aromatic 1,2-Amino Alcohols Utilizing a Bienzymatic Dynamic Kinetic Asymmetric Transformation. Adv. Syn. Catal. 349 (8-9), 1379-1386 (2007).
  12. Steinreiber, J., et al. Overcoming Thermodynamic and Kinetic Limitations of Aldolase-Catalyzed Reactions by Applying Multienzymatic Dynamic Kinetic Asymmetric Transformations. Ang. Chem. Int. Ed. 46 (10), 1624-1626 (2007).
  13. Kohls, H., et al. Selective Access to All Four Diastereomers of a 1,3-Amino Alcohol by Combination of a Keto Reductase- and an Amine Transaminase-Catalysed Reaction. Adv. Syn. Catal. 357 (8), 1808-1814 (2015).
  14. Sehl, T., Maugeri, Z., Rother, D. Multi-step synthesis strategies towards 1,2-amino alcohols with special emphasis on phenylpropanolamines. J. Mol. Cat. B: Enzymatic. 114 (0), 65-71 (2015).
  15. Martinez, S., Hausinger, R. P. Catalytic Mechanisms of Fe(II)- and 2-Oxoglutarate-dependent Oxygenases. J. Biol. Chem. 290 (34), 20702-20711 (2015).
  16. Baud, D., et al. Synthesis of Mono‐and Dihydroxylated Amino Acids with New α‐Ketoglutarate‐Dependent Dioxygenases: Biocatalytic Oxidation of C-H Bonds. ChemCatChem. , (2014).
  17. Suzuki, H., Kurihara, S. Ch. 4. Polyamines. Kusano, T., Suzuki, H. 4, Springer Japan. 47-59 (2015).
  18. Kind, S., Wittmann, C. Bio-based production of the platform chemical 1,5-diaminopentane. Appl. Microbiol. Biotechnol. 91 (5), 1287-1296 (2011).
  19. Schneider, J., Wendisch, V. F. Biotechnological production of polyamines by bacteria: recent achievements and future perspectives. Appl. Microbiol. Biotechnol. 91 (1), 17-30 (2011).
  20. Qian, Z. -G., Xia, X. -X., Lee, S. Y. Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of cadaverine: A five carbon diamine. Biotechnol. Bioeng. 108 (1), 93-103 (2011).
  21. Shin, J. H., Lee, S. Y. Metabolic engineering of microorganisms for the production of L-arginine and its derivatives. Microb. Cell. Fact. 13, (2014).
  22. Nguyen, A., Schneider, J., Reddy, G., Wendisch, V. Fermentative Production of the Diamine Putrescine: System Metabolic Engineering of Corynebacterium Glutamicum. Metabolites. 5 (2), 211(2015).
  23. Kidron, H., Repo, S., Johnson, M. S., Salminen, T. A. Functional Classification of Amino Acid Decarboxylases from the Alanine Racemase Structural Family by Phylogenetic Studies. Mol. Biol. Evol. 24 (1), 79-89 (2007).
  24. Takatsuka, Y., Onoda, M., Sugiyama, T., Muramoto, K., Tomita, T., Kamio, Y. Novel Characteristics of Selenomonas ruminantium Lysine Decarboxylase Capable of Decarboxylating Both L-Lysine and L-Ornithine. Biosci. Biotechnol. Biochem. 63 (6), 1063-1069 (1999).
  25. Takatsuka, Y., Tomita, T., Kamio, Y. Identification of the Amino Acid Residues Conferring Substrate Specificity upon Selenomonas ruminantium Lysine Decarboxylase. Biosci. Biotechnol. Biochem. 63 (10), 1843-1846 (1999).
  26. Baud, D., et al. Biocatalytic Approaches towards the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from Lysine: Cascade Reactions Combining alpha-Keto Acid Oxygenase Hydroxylation with Pyridoxal Phosphate- Dependent Decarboxylation. Adv. Syn. Catal. 359 (9), 1563-1569 (2017).
  27. Ilisz, I., Berkecz, R., Peter, A. Application of chiral derivatizing agents in the high-performance liquid chromatographic separation of amino acid enantiomers: a review. J. Pharm. Biomed. Anal. 47 (1), 1-15 (2008).
  28. JoVE Science Education Database. Organic Chemistry. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy. , Cambridge, MA. Available from: https://www.jove.com/science-education/5680/nuclear-magnetic-resonance-nmr-spectroscopy (2017).
  29. Hibi, M., Ogawa, J. Characteristics and biotechnology applications of aliphatic amino acid hydroxylases belonging to the Fe(II)/alpha-ketoglutarate-dependent dioxygenase superfamily. Appl. Microbiol. Biotechnol. 98 (9), 3869-3876 (2014).
  30. Hüttel, W. Biocatalytic Production of Chemical Building Blocks in Technical Scale with α-Ketoglutarate-Dependent Dioxygenases. Chem. Ing. Tec. 85 (6), 809-817 (2013).
  31. Kourist, R., Guterl, J. -K., Miyamoto, K., Sieber, V. Enzymatic Decarboxylation-An Emerging Reaction for Chemicals Production from Renewable Resources. ChemCatChem. 6 (3), 689-701 (2014).
  32. Lee, J., Michael, A. J., Martynowski, D., Goldsmith, E. J., Phillips, M. A. Phylogenetic diversity and the structural basis of substrate specificity in the beta/alpha-barrel fold basic amino acid decarboxylases. J. Biol. Chem. 282 (37), 27115-27125 (2007).
  33. Porter, J. L., Rusli, R. A., Ollis, D. L. Directed Evolution of Enzymes for Industrial Biocatalysis. ChemBiochem. 17 (3), 197-203 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

L-lysinesynthesedioxygenasecatalysePLP-decarboxylaseHPLC-monitoringvastestofextractieenzymatische zuiveringregio- en diastereoselectieve oxidatievriesdrogingsproces
Enzymatische Cascade reacties voor de synthese van chirale Amino alcoholen van L-lysine
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.