Visualiseren van Lignification Dynamics in planten met Klik op chemie: Dual Labeling is BLISS!

Samenvatting

BLISS, een dubbele labeling protocol voor het bestuderen van de dynamiek van de lignification, werd ontwikkeld. Synthetische monolignol Klik verslaggevers en een sequentiële combinatie van SPAAC en CuAAC bioorthogonal met reacties, deze methodologie baant de weg naar diepgaande analyse van de factoren die de biogenese van Ligninen in plantaregelen.

Samenvatting

Lignine is een van de meest voorkomende biopolymeren op de planeet en een belangrijk onderdeel van lignocellulose biomassa. Dit fenolische polymeer speelt een vitale structurele en beschermende rol in de ontwikkeling en de levensduur van hogere planten. Hoewel de ingewikkelde mechanismen tot regeling van lignification processen in vivo sterk de industriële valorisatie van vele plantgerelateerde producten beïnvloeden, heeft de wetenschappelijke gemeenschap nog steeds een lange weg te gaan om te ontcijferen hen. In een eenvoudige werkstroom van drie-stap kunnen de dubbele labeling protocol hier vermelde bioimaging studies van actief lignifying zones van plantaardige weefsels. De eerste stap bestaat in de metabole omzetting van twee onafhankelijke chemische verslaggevers, surrogaten van de twee inheemse monolignolen die aanleiding tot lignine H - en G-eenheden geven. Na opneming van de groeiende lignine polymeren, elke verslaggever vervolgens specifiek heet met eigen fluorescente sonde via een sequentiële combinatie van bioorthogonal SPAAC/CuAAC Klik op reacties. In combinatie met lignine autofluorescence, deze aanpak leidt tot het genereren van kaarten van de drie kleuren lokalisatie van lignine binnen plantaardige celwanden door confocal fluorescentie microscopie en precieze ruimtelijke informatie over de aanwezigheid of afwezigheid van actieve lignification machines op de schaal van plantaardige weefsels, cellen en verschillende celwand lagen.

Inleiding

In de afgelopen twee decennia, heeft de chemische verslaggever strategie ontpopt als een krachtige in twee stappen methodologie voor het onderzoeken van de dynamiek en de functies van niet-genetisch gecodeerde biomoleculen. ^{1 , 2 , 3} in deze strategie een synthetische analogon van de Biomolecuul van belang met een kleine modulatie – de chemische verslaggever – eerste menselijk organisme worden gemetaboliseerd door het levend organisme, waarna een chemische sonde (bv., een fluorophore voor fluorescentie de weergave van de confocal microscopie) is covalent gekoppeld aan de opgenomen verslaggever via bioorthogonal Klik op chemie. De sonde moet reageren snel en in het bijzonder met de ingevoerde chemische modificatie terwijl het inerte aan elke biomoleculen in het leven-systeem aanwezig. In menig opzicht overwint deze methode de beperkingen van het gemeenschappelijk bioconjugation technieken door het gebruik van zeer specifieke Klik chemie ligations waardoor de mogelijkheid om spoor van metabolieten of biomacromoleculen die eerder niet toegankelijk waren in levende systemen^4,5,6.

Ondanks de snel groeiende populariteit van deze krachtige methode in bacteriële en dierlijke cellen zijn rapporten beschrijven het gebruik ervan in plantenbiologie verrassend weinig en ver tussen^{7,8,9,10, 11,12}. We waren vooral geïnteresseerd in de toepassing van deze strategie in de planten te bestuderen van de vorming van lignine, een van de meest voorkomende biopolymeren op de planeet en een belangrijk onderdeel van lignocellulose biomassa. ^{13 , 14} lignine is een fenolische polymeer dat een vitale structurele en beschermende rol in de ontwikkeling en de levensduur van hogere planten speelt.

Het is over het algemeen samengesteld uit drie 4-hydroxyphenylpropanoid wordt: H (p- hydroxyfenyl), G (guaiacyl) en S (syringyl) eenheden respectievelijk afgeleid van drie 'monolignolen' (p- coumaryl, coniferyl en sinapyl alcoholen) die zijn gesynthetiseerd via de Fenylpropanoïde-pathway in het cytoplasma van de cel (Figuur 1). Na wordt geëxporteerd naar de celwand, monolignolen worden geoxideerd aan radicalen door Peroxidasen of Laccasen waarna ze ondergaan puur chemisch radicaal-koppeling reacties op polymeriseren te lignine polymeren, een proces genoemd lignification. ^{15 , 16} hoewel Ligninen sterk beïnvloeden de industriële valorisatie van veel plantgerelateerde producten, de wetenschappelijke gemeenschap moet nog een lange weg te gaan om te ontcijferen van de ingewikkelde mechanismen tot regeling van de lignification.

Figuur 1: het lignification-proces in plantencellen. Monolignolen zijn levende van fenylalanine in het cytosol. Na wordt geëxporteerd naar de celwand, monolignolen worden geoxideerd aan radicalen door Peroxidasen of Laccasen waarna ze ondergaan puur chemisch radicaal-koppeling reacties op polymeriseren te lignine polymeren, een proces genoemd lignification. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Hoewel de verslagen over het gebruik van bioorthogonal reacties voor glycan analyse zijn talrijk,^2,3,17 hun toepassingsvoorbeelden voor andere soorten biomoleculen zijn er minder. Het gebruik van bioorthogonal chemie lignine bioimaging oog werd pas onlangs gepionierd door Tobimatsu et al. ⁸ in Arabidopsis thaliana om informatie te verstrekken over de opneming van coniferyl alcohol surrogaten in het polymeer van de lignine waar vormt de G-eenheden,^8,9 dus aantonen het bewijs van concept dat chemische verslaggever strategieën zijn van toepassing in deze context. Het gebruik van CuAAC werd ook geïllustreerd met behulp van een verschillende coniferyl alcohol afgeleide een paar maand later door Bukowski et al. ⁹ lignine bevat echter ook H en S eenheden en een dieper begrip van het lignification-proces vereist meer kennis over hoe alle van de monolignolen in het polymeer worden opgenomen en welke factoren kan het bepalen van de samenstelling. Nieuwe ontwikkelingen op dit gebied is momenteel afhankelijk van de ontwikkeling van efficiënte methoden voor het bijhouden van meerdere chemische verslaggevers gelijktijdig in levende systemen. Hoewel een paar artikelen over glycanen hebben de basis gelegd in de afgelopen jaren^18,19,blijven^20,21,22, dubbele etikettering benaderingen een belangrijke uitdaging in bioorthogonal chemie. Als een reproduceerbare single-labeling Klik protocol is moeilijk te ontwikkelen, dan dubbele labeling benaderingen waarvoor de optimalisatie in tandem van twee onderling zijn compatibel bioorthogonal reacties op twee afzonderlijke chemische verslaggevers nog moeilijker. De weinige voorbeelden die dit aspect een pionier gebruikt een combinatie van spanning-bevorderd azide-alkyn cycloadditie (SPAAC) en alkeen-tetrazine inverse elektronische vraag Diels-Alder (DA_inv) reacties te bestuderen van glycanen in dierlijke cellen. Echter, we dachten dat de bioorthogonality van de DAinv reactie niet kan worden gegarandeerd in deze toepassing als gevolg van de structurele kenmerken van lignine (die bestaat uit een elektron-rijke gesubstitueerde cinnamyl-type monomeren die met elektron-armen reageren kunnen dienes zoals de tetrazine-sondes gebruikt in DAinv reacties) en dat dit aspecifieke labeling genereren kan. Bovendien, de DA_inv reactie vereist chemische grepen die synthetisch moeilijk te toegang, maar ook als omvangrijk en lipofiele waardoor het verhogen van de mogelijkheid dat het tempo van de opname, het transport en/of de lokalisatie van de chemische stof verslaggever in vivo kan worden beïnvloed. Als wij van mening dat dit laatste aspect bijzonder relevant in het geval van een klik-chemie benadering voor het bestuderen van de lignification, we koos een andere richting en ontwikkeld met behulp van een Bioorthogonal afbinding Imaging sequentiële strategie (BLISS) een combinatie van Strain-Promoted Azide-alkyn cycloadditie (SPAAC) en koper gekatalyseerd Azide-alkyn cycloadditie (CuAAC) in vivo. ²³

Deze twee reacties zijn inderdaad de twee belangrijkste bioorthogonal Klik op reacties die tot nu toe zijn gebruikt, en meer in het bijzonder de weinige voorbeelden van lignine imaging dat onlangs verschenen. ^{8 , 9} onze tweeledige labeling strategie maakt het gebruik van een azide groep op één monolignol verslaggever en een terminal alkyn anderzijds, twee chemische handvatten die i) onreactieve naar biologisch relevante structuren en ii) zeer klein is in omvang (Figuur 2 ). Dientengevolge, de gevolgen van deze synthetische wijzigingen op de fysisch-chemische eigenschappen van de Biomolecuul bestudeerde is geminimaliseerd waardoor de mogelijke verschillen tussen de substraten onnatuurlijk en natuurlijke monolignol op het gebied van vervoer en de tarieven van de metabolization tijdens de stap van de metabole omzetting. Hoewel de combinatie van SPAAC en CuAAC op het eerste gezicht zeer intuïtief lijkt, is het aan onze kennis alleen het tweede voorbeeld van dubbele markering met behulp van deze strategie en de eerste toepassing op structuren dan glycanen. ^{12 , 23}

Figuur 2: BLISS dubbele strategie labeling. Chemische verslaggevers H_AZ en G_ALK zijn tagged analogen van de inheemse H en G monolignolen. Ze worden voor het eerst opgenomen in de groeiende lignine polymeren van de celwanden door exogene voeding (stap 1). Cyclooctyne - en azide-matiemaatschappij fluorescerende sondes ligatuur dan achtereenvolgens aan de opgenomen verslaggevers door bioorthogonal verbonden zijn Klik op chemie: de reactie van de SPAAC (stap 2) is zeer specifiek van H_AZ eenheden en wordt gevolgd door een CuAAC reactie ( stap 3) dat is specifiek van G_ALK eenheden (stap 3), waardoor de specifieke lokalisatie van beide verslaggevers onafhankelijk in hetzelfde monster. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Wij in de eerste plaats ontworpen de azide-gelabeld monolignol verslaggever H_AZ (surrogaat van p- coumaryl alcohol) en voorloper van lignine H eenheden gevalideerd en vervolgens bedacht de BLISS tweeledige labeling strategie waarin het wordt gebruikt in combinatie met de eerder gemeld alkyn-gelabeld G_ALK,⁹ (surrogaat van coniferyl alcohol) en voorloper van lignine G eenheden. In dit reproduceerbare protocol ontwikkeld en getest in vlas, bereikte een economisch belangrijke plantensoorten, de dubbele metabole omzetting van H_AZ en G_ALK in lignine is eerst vóór sequentiële SPAAC/CuAAC labeling. Hier, worden tagged H_AZ eenheden eerst specifiek aangeduid via de afbinding van de SPAAC van een cyclooctyne-matiemaatschappij fluorophore, gevolgd door CuAAC-gemedieerde Afbinding van een tweede fluorescente sonde op tagged G_ALK eenheden. Deze methode werd gebruikt voor het onderzoeken van de dynamiek van lignification processen binnen plantaardige celwanden en kan worden toegepast in vivo voort te vloeien dwarsdoorsneden, zowel de stengels als de zaailingen van verschillende plantensoorten leven.

Protocol

Opmerking: Vloeibare en vaste ½ MS media moet bereid zijn vooraf zoals beschreven in de aanvullende tabel 1.

1. plant cultuur

1. Cultuur van 2 maand-oude vlas planten
   1. Vlas (Linum usitatissimum L.) zaaien in kunststof potten met potgrond.
   2. Groeien vlas in groei kamers bij 22 ° C met een fotoperiode van 16 h/8 h dag/nacht.
   3. Planten met verticale steun na 1 maand uit te rusten en groeien totdat ze 2 maanden oud.
2. Cultuur van 2 weken oude vlas zaailingen
   1. Wikkel 12 lijnzaad in een stuk kaasdoek en herstellen met een rubberen band om een bundel.
      Opmerking: Voer de volgende stappen uit onder steriele omstandigheden onder een laminaire flow zuurkast.
   2. Plaats de zaad-bundel in een eerder gesteriliseerde met autoclaaf 250 mL glazen fles.
   3. Voeg 70 mL 70% EtOH in de fles en zachtjes roer gedurende 1 minuut.
   4. Verwijder voorzichtig de EtOH door decanteren terwijl het verlaten van de bundel in de fles.
   5. Voeg 100 mL 2% natriumhypochloriet en roer gedurende 10 min zachtjes.
   6. Verwijder de natriumhypochloriet-oplossing door decanteren terwijl het verlaten van de bundel in de fles.
   7. Herhaal stappen 1.2.5-1.2.6.
   8. Voeg 100 mL steriele ultrazuiver water en roer gedurende 1 minuut.
   9. Herhaal stap 1.2.8 3 keer, op steeds meer spoeldouche voor elke spoeling (5, 10 en 15 min).
   10. Warm solide ½ MS medium, giet het in een steriele plant cultuur vak tot een hoogte van 2 cm en laat het afkoelen tot stollen.
   11. Fijn plaats elk zaad op solide medium gebruik steriel pincet.
   12. Sluit het steriel.
   13. Het vak overbrengen in een kamer van de groei bij 22 ° C met een fotoperiode van 16 h/8 h dag/nacht en vlas zaailingen groeien voor 2 weken.

2. de metabole omzetting van chemische verslaggevers

Opmerking: Drie experimentele modellen zijn hieronder weergegeven: i) metabole etikettering van dwarsdoorsneden van de stengel, ii) hele stengels en iii) plant de zaailingen. Elk protocol wordt gepresenteerd voor een biologische repliceren en hoeveelheden kunnen worden aangepast aan het aantal vereiste biologische replicatieonderzoeken. De monolignol oplossingen zijn bereid uit voorraad oplossingen die zijn gemaakt, zoals beschreven in tabel 2 voorafgaand aan het experiment. De voorraadoplossingen kunnen worden opgeslagen enkele maanden bij-20 ° C. De H_AZ: G_ALK of H:G verhoudingen kunnen aangepast worden aan alle op maat gemaakte experimentele designs.

1. Chemische verslaggever opneming in 2 maand-oude vlas stam dwarsdoorsneden
   1. Bereid een 300 µL chemische verslaggever oplossing met 10 µM van G_ALK en 10 µM voor H_AZ in steriele ½ MS vloeistof.
   2. Vortex de H_AZ/G_ALK oplossing en het overbrengen naar één putje van een 48-well-plaat met een micropipet.
   3. Bereid een 300 µL negatieve controle oplossing met 10 µM van G en 10 µM van H in steriele ½ MS vloeistof.
   4. Vortex de H/G oplossing en overbrengen naar een tweede put van de dezelfde plaat van 48-well.
   5. Snij de stengel van een 2 vlas plant van de maand-oude op 10 cm boven de bodem met behulp van een nieuwe scheermesje.
   6. Fijn bereiden 50 freehand transversale dwarsdoorsneden van de stengel met behulp van het scheermesje (ongeveer 150-250 µm dik).
   7. Onmiddellijk plaats de dwarsdoorsneden in steriele ½ MS vloeistof in een horlogeglas.
   8. Inspecteer het instrument visueel Selecteer intact hele dwarsdoorsneden en willekeurig verdelen 10 van hen in de goed gevulde met H_AZ/G_ALK oplossing.
   9. Herhaal stap 2.1.8 voor de goed gevulde met H/G oplossing (als negatieve controle).
   10. Herhaal stap 2.1.8 voor een derde goed gevuld met 300 µL van ½ MS medium (als achtergrond controle aan te passen van de basislijn van de fluorescentie tijdens de latere verwerking van beelden van de confocal microscopie).
   11. Incubeer de plaat in continu licht in een kamer van de groei bij 20 ° C gedurende 20 h.
   12. Verwijder de monolignol oplossing in elk putje met een micropipet.
   13. Voeg 500 µL van ½ MS medium aan elk putje, roer voorzichtig gedurende 10 minuten en verwijder dit spoelen oplossing met een micropipet. Herhaal 4 keer en overgaan tot etikettering onmiddellijk BLISS (sectie 3).
2. Chemische verslaggever opneming in 2 maand-oude vlas hele stengels
   1. Bereid een 5 mL chemische verslaggever oplossing met 10 µM van G_ALK en 10 µM voor H_AZ in steriele ½ MS vloeistof.
   2. Vortex de H_AZ/G_ALK oplossing en de overdracht het aan een test van 20-cm hoge glazen buis met een pipet.
   3. Bereid een 5 mL negatieve controle oplossing met 10 µM van G en 10 µM van H in steriele ½ MS vloeistof.
   4. Vortex de H/G oplossing en de overdracht het aan een test van 20-cm hoge glazen buis.
   5. Een derde glas reageerbuis met 5 mL van ½ MS medium (als achtergrond controle aan te passen van de basislijn van de fluorescentie tijdens de latere verwerking van beelden van de confocal microscopie) voor te bereiden.
   6. Snij de stengel van een 2 vlas plant van de maand-oude op 10 cm boven de bodem met behulp van een nieuwe scheermesje. Negeren van het root systeem en het onderste deel van de stengel en gaat u verder met de volgende stap met het bovenste gedeelte van de stengel van de plant.
   7. De basis van de hele gesneden stam in de buis met de H_AZonderdompelen /G_ALK oplossing. Plaats de stengel in haar incubatie-oplossing onmiddellijk na verwijdering van het wortelsysteem om te voorkomen dat het drogen.
      Opmerking: Als de methode wordt toegepast op jongere/oudere planten en/of andere soorten, moet het volume van oplossingen van de monolignol worden aangepast volgens de grootte / leeftijd van de plant en de diameter van de stam.
   8. De stengel aan een verticale steun recht te houden het koppelen.
   9. Het zegel van de glazen buis met parafilm om verdamping van de oplossing.
   10. Herhaal de stappen 2.2.6-2.2.9 voor de negatieve controlemonster met de H/G oplossing.
   11. Herhaal de stappen 2.2.6-2.2.9 voor de fluorescentie achtergrond controlemonster met het ½ MS-medium.
   12. Incubeer elke stam voor 20u in continu licht met behulp van een neon licht.
   13. Na 20u metabole statuten, het verwijderen van de stengel geïncubeerd in de H_AZ/G_ALK oplossing en spoel het met ½ MS medium.
   14. Gooi de bodem 1 cm van de stam met een scheermesje te knippen en dan een hoge cilinder in 1 cm vanaf de basis van de resterende stengel voorbereiden.
   15. Zorgvuldig voorbereiden 20 freehand dwarse dwarsdoorsneden (ongeveer 150-250 µm dik) van deze cilinder en plaats ze onmiddellijk in een horlogeglas gevuld met ½ MS medium.
   16. Zet 500 µL van ½ MS medium in een putje van de plaat van een 48-well.
   17. Inspecteer het instrument visueel Selecteer intact hele dwarsdoorsneden en willekeurig verdelen 10 van hen in de put gevuld met ½ MS oplossing.
   18. Herhaal stap 2.2.13-2.2.17 voor de negatieve controle stengel geïncubeerd met de H/G oplossing.
   19. Herhaal stappen 2.2.13-2.2.17 voor de fluorescentie achtergrond controle stengel geïncubeerd met medium ½ MS.
   20. Verwijder voorzichtig de oplossing in elk putje met een micropipet.
   21. Voeg 500 µL van ½ MS medium aan elk putje, roer voorzichtig gedurende 10 minuten en verwijder dit spoelen oplossing met een micropipet. Herhaal 4 keer en overgaan tot etikettering onmiddellijk BLISS (sectie 3).
3. Chemische verslaggever opneming in 2 weken oude vlas zaailingen
   Opmerking: De volgende stappen worden allemaal uitgevoerd onder steriele omstandigheden.
   1. Bereid een 2 mL chemische verslaggever oplossing met 10 µM van G_ALK en 10 µM voor H_AZ in steriele ½ MS vloeistof.
   2. Vortex de H_AZ/G_ALK oplossing en de overdracht het aan een test van 20 cm hoge glazen buis met een pipet.
   3. Bereid een 2 mL negatieve controle oplossing met 10 µM van G en 10 µM van H in steriele ½ MS vloeistof.
   4. Vortex de H/G oplossing en de overdracht het aan een test van 20 cm hoge glazen buis.
   5. Een derde 20-cm hoge glazen reageerbuis met 2 mL van ½ MS medium (als achtergrond controle aan te passen van de basislijn van de fluorescentie tijdens de latere verwerking van beelden van de confocal microscopie) voor te bereiden.
   6. Fijn een 2-week-oude vlas zaailing uit het solide ½ MS medium met behulp van een lange paar pincet te verwijderen (in punt 1.2. hierboven).
   7. De zaailing zachtjes overbrengen in de buis met de H_AZ/G_ALK oplossing, ervoor te zorgen dat zijn wortels in de oplossing worden ondergedompeld.
   8. Sluit de glazen buis met een plastic kapje om te voorkomen dat de verdamping.
   9. Herhaal de stappen 2.3.6-2.3.8 voor de negatieve controle-buis met de H / G oplossing.
   10. Herhaal de stappen 2.3.6-2.3.8 voor de fluorescentie achtergrond controle buis met het ½ MS-medium.
   11. Incubeer elke zaailing in continu licht in een kamer van de groei gedurende 20 uur bij 20 ° C.
   12. Fijn verwijderen de zaailing geïncubeerd in de H_AZ/G_ALK oplossing en spoel het met ½ MS medium.
   13. Fijn bereiden 20 freehand dwarsdoorsneden (ongeveer 150-250 µm dik) van de hypocotyl.
   14. Zet 500 µL van ½ MS medium in een putje van de plaat van een 48-well.
   15. Inspecteer het instrument visueel Selecteer intact hele dwarsdoorsneden en willekeurig verdelen 10 van hen in de put gevuld met ½ MS oplossing.
   16. Herhaal stap 2.3.12-2.3.15 voor de negatieve controle zaailing geïncubeerd met de H/G oplossing.
   17. Herhaal stappen 2.3.12-2.3.15 voor de fluorescentie achtergrond controle zaailing geïncubeerd met medium ½ MS.
   18. Verwijder voorzichtig de oplossing in elk putje met een micropipet.
   19. Voeg 500 µL van ½ MS medium aan elk putje, roer voorzichtig gedurende 10 minuten en verwijder dit spoelen oplossing met een micropipet. Herhaal 4 keer en overgaan tot etikettering onmiddellijk BLISS (sectie 3).

3. dual fluorescentie Labeling van Plant dwarsdoorsnede monsters door SPAAC en CuAAC

Opmerking: De BLISS labeling protocol is identiek voor alle 3 experimentele modellen (sectie 2).

1. Stam-bevorderd labeling Azide-alkyn cycloadditie (SPAAC)
   1. Bereiden 1 mL van de oplossing van een SPAAC met 5 µM van DBCO-PEG₄-5/6-carboxyrhodamine 110 in steriele ½ MS vloeistof. Vortex de oplossing en bewaar deze in het donker.
   2. Na het laatste wassen stappen van het protocol van de metabole omzetting [2.1.13, 2.2.21 of 2.3.19 afhankelijk van de gekozen proefopzet], verwijder het medium ½ MS en voeg 300 µL van de SPAAC oplossing per putje met een micropipet.
   3. De 48-well plaat boven licht beschermen door bekleding met aluminiumfolie of door deze te plaatsen in een doos.
   4. Roer voorzichtig de plaat op een mechanische schudinrichting gedurende 1 uur in het donker bij kamertemperatuur.
2. Labelen van koper-gekatalyseerde Azide-alkyn cycloadditie (CuAAC)
   1. Wassen elk goed 4 keer zoals beschreven in stap 2.1.13 terwijl het houden van de plaat in het donker.
   2. Bereiden 1 mL van de oplossing van een CuAAC met 2.5 mM natrium ascorbaat, 0.5 mM CuSO₄ en 5 µM van 5-TAMRA-PEG₃-azide in steriele ½ MS vloeistof. Vortex de oplossing en bewaar deze in het donker.
      Opmerking: Deze oplossing CuAAC moet de vóór gebruik vers worden bereid en kan niet worden opgeslagen meer dan een paar dagen bij 4 ° C.
   3. Verwijder het medium van de ½ MS in elk putje en direct Voeg 300 µL van de CuAAC oplossing per goed met behulp van een micropipet.
   4. Roer voorzichtig de plaat op een mechanische schudinrichting gedurende 1 uur in het donker bij kamertemperatuur.
   5. Verwijder de CuAAC oplossing met behulp van een micropipet.
   6. Met behulp van een micropipet, voeg 500 µL van ½ MS, roer in het donker gedurende 10 minuten vervolgens deze wassen oplossing verwijderen. Herhaal dit twee keer.
   7. Voeg 500 µL van een 7:3 MeOH/water oplossing, roer in het donker gedurende 1 uur dan verwijderen van de oplossing
      Let op: Methanol giftig is door contact met de huid of bij inademing en is aangewezen als een menselijk carcinogeen. Het gebruik vereist chemische fume hoods en handschoenen.
   8. Voeg 500 µL van ½ MS, roer in het donker gedurende 10 minuten vervolgens verwijderen van de oplossing. Herhaal 4 keer.

4. montage van monsters op Microscoop dia 's

1. Plaats 5 druppels van montage medium op een microscoopglaasje van glas.
2. Zorgvuldig storten elke H_AZ/G_ALKgetagd dwarsdoorsnede op de dia.
3. Nagellak op twee tegenovergestelde kanten van de dia toepassen.
4. Betrekking hebben op de dia met een dekglaasje aan. Wees voorzichtig om luchtbellen te voorkomen.
5. Verwijder overtollige montage medium gebruik van een papieren handdoek.
6. Zegel van het monster met nagellak op alle 4 zijden. Laat de nagel lak droog, bij kamertemperatuur (ongeveer 30 min).
7. Herhaal stap 4.1-4.6 voor de negatieve controle H/G dwarsdoorsneden.
8. Herhaal stap 4.1-4.6 voor de fluorescentie achtergrond controle dwarsdoorsneden.
9. Het bewaren van de dia's bij 4 ° C in het donker tot observatie onder een confocal microscoop.
   Opmerking: Voorbereide dia's kunnen worden opgeslagen voor enkele weken tot enkele maanden duren afhankelijk van de kwaliteit van het preparaat. Als een nieuwe opmerking na opslag worden gemaakt, zorgen ervoor dat de monsters niet opgedroogd.

5. image aquisition door fluorescentie confocale microscopie

1. Schakel alle noodzakelijke onderdelen van het systeem van de confocal microscopie in de juiste volgorde volgens de instructies van de fabrikant.
2. Selecteer de gewenste doelstelling met maximale numerieke diafragma en aangepast excitatie en emissie golflengten (bijvoorbeeld obj. 60 x, N.A. 1.2. Autofluorescence kanaal: λ_ex 405 nm, λ_em 450 nm /25; SPAAC H_AZ kanaal: λ_ex 488 nm, λ_em 525 nm /25; CuAAC G_ALK kanaal: λ_ex 561 nm, λ_em 595 nm /25; sequentiële modus).
3. Selecteer de gewenste parameters voor generatie van beelden in de software (12 - of 16-bits vereist, pixelgrootte aangepast aan de Nyquist-criterium).
4. Plaats van de H_AZ/G_ALK dia in het werkgebied van de Microscoop en plaats het monster onder het objectief.
5. Observeren en vinden van het gewenste gebied van het weefsel van de plant.
6. Verwerven van de confocal afbeeldingen van hoge kwaliteit van dubbel gelabelde H_AZ/G_ALK monster.
   1. Selecteer het meest fluorescerende vliegtuig in de z-as.
   2. Aanpassen van winst, offset en laser macht te bereiken optimale signaal distributie langs het hele grijze niveau bereik voor elk kanaal (autofluorescence, H_AZ en G_ALK). Dezelfde parameters moeten gelden voor alle volgende overnames.
   3. Start van de verwerving van de geselecteerde afbeelding en sla het bestand op. Herhaal voor elke betrokken gebied van het monster.
      Opmerking: 3D-reconstructies van de Z-stack kunnen ook worden verkregen indien nodig.
7. Met dezelfde instellingen, verwerven beelden van niet-gecodeerde monster alleen geïncubeerd in ½ MS om te bepalen van het niveau van de autofluorescence (fluorescentie achtergrond controle zoals beschreven in sectie 2).
8. Met dezelfde instellingen, verwerven beelden voor de negatieve controlemonsters geïncubeerd met inheemse monolignolen H/G om niet-specifieke fluorophore hechting aan het monster.
9. Gegevens behandeling toepassen op de verworven beelden aftrekken achtergrond autofluorescence signalen in H/G negatieve controle beelden zowel H_AZ/G_ALK afbeeldingen.

Resultaten

Met behulp van de gepresenteerde BLISS-protocol met betrekking tot synthetische monolignol-analogen en bioorthogonal Klik op chemie, is het mogelijk om te visualiseren van de dynamiek van het proces van de lignification in levende planten. In tegenstelling tot gevestigde technieken voor lignine richt visualisatie (zoals histochemische kleuring, immunolocalization of autofluorescence), dit 'Dubbelklik' protocol uitsluitend zich op de lignine geproduceerd DOVO tijdens de metabole integratie stap en het onderscheidt van de bestaande lignine van het monster met triple-channel cellulaire beeldvorming door confocal fluorescentie microscopie (Figuur 3). H _AZ-eenheden worden gedetecteerd met behulp van de excitatie en emissie golflengten van de DBCO-PEG-₄-5/6-carboxyrhodamine 110 dat specifiek wordt geklikt op azide functies van H_AZ moleculen tijdens de stap van de SPAAC (λex opgenomen 501 nm /λ_em 526 nm, groene kanaal), overwegende dat G_ALK-eenheden worden op dezelfde manier gedetecteerd op de karakteristieke golflengten van de azidefluor 545-sonde die specifiek op de ingebouwde terminal alkyn afsluitcodes van G wordt geklikt _ALK tijdens de stap van de CuAAC (λex 546 nm /λ_em 565 nm, rode kanaal); het derde kanaal komt overeen met de reeds bestaande lignine, dat wordt vastgesteld met behulp van haar intrinsieke autofluorescence op 405 nm (blauwe kanaal). Deze benadering leidt tot de generatie van de drie kleuren lokalisatie kaarten van lignine in celwanden van planten waarmee nauwkeurige ruimtelijke informatie over de aanwezigheid of afwezigheid van actieve lignification machines tussen verschillende weefsels van een orgaan (figuur 3A ), tussen verschillende soorten cellen binnen de dezelfde weefsel (figuur 3B-C) en binnen verschillende muur lagen van dezelfde cel (figuur 3D). Met andere woorden, deze methode stelt ons in staat om te markeren en specifiek de 'actieve' lignification sites (H_AZ en G_ALK kanalen) lokaliseren door te differentiëren hen uit zones waar lignine werd gevormd in een vroeger stadium van de ontwikkeling van de planten (autofluorescence kanaal). Bovendien, de gevoeligheid van de techniek is drastisch verbeterd in vergelijking met autofluorescence, en veel kleinere hoeveelheden vers gesynthetiseerde lignine kunnen worden waargenomen (figuur 3B).

Figuur 3: Imaging van opgenomen monolignol chemische verslaggevers in vlas stengels. (A) de helft van een handgemaakte transversale gedeelte van een vlas stam, gereconstrueerde beeld. (B) Close-up van de eerste lagen van de differentiatie van xylem. Links paneel: lignine autofluorescence (blauw, 405 nm), middelste deelvenster: samengevoegde lignine autofluorescence (blauw) en H_AZ fluorescentie (groen, 526 nm) kanalen, rechter paneel: samengevoegde lignine autofluorescence (blauw) en G_ALK fluorescentie (rood, 565 nm) kanalen. De pijl geeft de eerste gelabelde celwand van het cambium ter illustratie van de toegenomen gevoeligheid van BLISS in vergelijking met autofluorescence. (C) labelen in verschillende cel soorten secundaire xylem en (D) Close-up op secundaire xylem cellen illustreren de labeling variaties in verschillende lagen van de dezelfde celwand. Links paneel: samengevoegde lignine autofluorescence (blauw) en H_AZ fluorescentie (groen, 526 nm) kanalen, middelste deelvenster: samengevoegde lignine autofluorescence (blauw) en G_ALK fluorescentie (rood, 565 nm) kanalen, rechts paneel: samengevoegd lignine autofluorescence (blauw), H_AZ (groen) en G_ALK (rood) fluorescentie kanalen. H_AZ en G_ALK co lokalisatie is afgebeeld in geel. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Chemische verslaggever strategieën, zoals de methode van de BLISS hier gepresenteerd of de single-labeling procedures eerder gepubliceerd door Tobimatsu et al. ⁸ kunnen daarom een veel fijnere studie dan eerder toegankelijke methoden zoals immuno- of histochemische kleuring terwijl ze zeer eenvoudig te implementeren. Bijvoorbeeld, Figuur 4 illustreert dat de signaalsterkte voor H_AZ/G_ALK opneming in vezel tracheids/schepen (FT) van het vlas secundaire xylem is zeer hoog in de eerste paar celwanden van de cambium maar geleidelijk afneemt in oudere cellen. Dit profiel is tegengesteld aan die van de autofluorescence en geeft aan dat maximale lignification is zeer snel bereikt in de eerste twee tot drie FT cel lagen van het cambium. In tegenstelling, straal (R) cellen lijken te blijven lignification te veel latere stadia van hun ontwikkeling als H_AZ/G_ALK opneming is veel constanter in de muren van alle cellen van het cambium aan het merg. Het is niet verwonderlijk dat FT en R celtypes de dynamiek van de contrasterende lignification, weergeven aangezien deze celtypes verschillende biologische rollen met bijbehorende verschillen in hun ontwikkelings programma hebben. FTs zijn inderdaad een verlengde buizen die oudere en snel sterven, verlaten dood lege cellen met dikke lignified muren die spelen een essentiële rol in zowel mechanische ondersteuning en verticale transport van water en mineralen, overwegende dat de smalle rijen van R cellen die componeren het xylem stralen zijn levend in hun volwassen en functionele staat zonder dikke lignified muren.

Figuur 4: cel-specifieke monolignol verslaggever opneming in vlas xylem. Bright-veld confocale microscopie weergave (A) deel van een freehand dwarsdoorsnede van een vlas stam. Roze (ray parenchym cellen, R) en geel (vezel tracheid cellen, FT) pijlen geven aan vectoren variërend van de cambial zone naar de merg en gescand op lignine autofluorescence op 405 nm (B), H_AZ fluorescentie bij 526 nm (C) en G _ALK fluorescentie bij 565 nm (D). (E) weergave van de secundaire xylem. Links paneel: samengevoegd lignine autofluorescence (blauw), H_AZ (groen), en G_ALK (rood) fluorescentie kanalen. H_AZ en G_ALK co lokalisatie is afgebeeld in geel. Rechter paneel: Schematische afbeelding van de secundaire xylem structuur in de vlas stengel. V, vaartuig; FT, vezel tracheid; R, ray parenchym cel. Dit cijfer is gewijzigd van Lion et al. ²³ Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Verder is het gebruik van twee verschillende chemische verslaggevers overeenkomt aan H - en G-eenheden met twee bioorthogonal reacties in het BLISS-protocol staat meer kwantitatieve resultaten worden verkregen. Multiplexed labeling strategieën zoals BLISS aanvullende inzichten over de controle van monolignol opneming ratio's in verschillende omstandigheden geven zou en bijdragen kan tot het ontcijferen van de ongrijpbare lignification proces. Als de relatieve percentages van G, H en S monolignolen in Ligninen inderdaad zeer variabele volgens de soort, de weefsel, de leeftijd of de milieuomstandigheden van de plant zijn, zijn de ingewikkelde mechanismen die deze compositie regelen nog steeds niet volledig begrepen. De dual-labeling technologie vertegenwoordigt een krachtige manier om sommige van de parameters die lignine samenstelling regelen te onderzoeken. Bijvoorbeeld, variërend van de H-_AZ: G_ALK verhouding met BLISS konden we aantonen dat de lignine samenstelling in secundaire xylem weefsels is rechtstreeks afhankelijk van de beschikbaarheid van de monolignol binnen de celwanden, in plaats van op peroxidase/laccase specificiteit (Figuur 5).

Figuur 5: Effect van het broeden van vlas stam secties met verschillende Percentage ratio's van H_AZ en G_ALK. H_AZ: G_ALK% verhoudingen worden gegeven boven elke kolom van cijfers. Top: samengevoegd H_AZ en G_ALK kanalen. Bodem: histogrammen die gemiddelde fluorescentie intensiteit van H_AZ en G_ALK voor de verhoudingen van de verschillende % aangeeft. Waarden worden uitgedrukt als gemiddelde van de gemiddelde fluorescentie-intensiteit in grijsniveaus ± SD. schaal bar = 100 µm. dit cijfer van Lion et al. is gewijzigd ²³ Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Vlas wordt verbouwd voor de bast vezels (BF) die worden gebruikt voor de vervaardiging van textiel, luxe papieren of milieuvriendelijke composietmaterialen. Een belangrijk aspect van hun industriële valorisatie is dat ze zeer lage niveaus van lignine in hun celwanden, die worden gekenmerkt door een zeer dikke S2/G secundaire laag^19,24bevatten. BLISS kunt markeren lignification dynamics verschillen tussen de verschillende lagen van de dezelfde celwand. Figuur 6A blijkt dat H_AZ en G_ALK verslaggever opname zijn beperkt tot de cel hoeken en Midden lamel/primaire celwand van sommige maar niet alle vezels van de bast. De totale afwezigheid van lignification in de dikke bast fiber secundaire muur cellaag zelfs wanneer monolignol chemische verslaggevers exogenously kopen blijkt dat de staat van hun hypolignified vloeit voort uit het ontbreken van een moleculaire omgeving geschikt voor enzymatisch-gemedieerde oxidatie en integratie van de monolignolen in een groeiende keten van polymeer, en dat er niet alleen te wijten aan transcriptionele regulering van de monolignol biosynthese genen zoals eerder gemeld²⁵. Deze observatie correleert ook goed met het feit dat vlas peroxidase genen zijn omhoog-geregeld in het weefsel van de buitenste stam van de vlas chemische lbf1 mutant die lignified bast vezels^{26 bezit}.

Figuur 6: BLISS hoogtepunten celwand onderbouw - of laag-specifieke verschillen. (A) linker paneel: helder-veld afbeelding van een sectie vlas stam. Het rondje geeft aan dat een vezelbundel. Rechter paneel: Close-up op bast vezels. Samengevoegd H_AZ en G_ALK kanalen (met en zonder heldere-veld) waaruit blijkt dat lignification is beperkt tot cel hoeken () en Midden lamel/primaire celwand van sommige bast vezels. BF, bast fiber; Par, parenchym cel; M, Midden lamel; P, primaire celwand; S1, eerste laag van secundaire celwand; S2/G, secundaire laag/gelatine-achtige laag van secundaire celwand. (B) 2D segment en 3D reconstructie van confocal z-stack zoom van vlas wortel endodermis regio. De strip Casparian () alleen worden autofluorescence weergegeven en zijn niet opgenomen H_AZ of G_ALK. De bijbehorende fluorogram toont een G_ALK/H_AZ anti-correlatie: hoge groene fluorescentie is gekoppeld aan lage rood signaal (cortex) en vice-versa (endodermis). Pericycle (P), Endodermis (E), Cortex (C). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Ten slotte, deze twee kleuren methodologie kan ook waardevolle informatie verschaffen over "lignification staat' van de celwand substructuren op verschillende ontwikkelingsstadia en in de organen van de plant dan de stengel. Bijvoorbeeld, wordt de endodermis van vlas wortels gekenmerkt door het bestaan van een Casparian band in de radiale en transverse celwanden tijdens de vroege stadia van ontwikkeling. Deze band van hydrofobe biopolymeer, gemaakt van suberine en/of lignine, voorkomt dat water en opgeloste stoffen in beslag genomen door de wortel uit het invoeren van passief via de apoplast en dwingt hen om het plasma-membraan passeren via een route van de symplastisch aldus bij te dragen aan de selectieve opname capaciteit van plantenwortels. Wanneer toegepast op vlas wortels, bleek onze strategie dat H_AZ en G_ALK zijn opgenomen in de tangentiële muren van endodermal cellen ook in delen van de radiale muren waar de band van de Casparian afwezig (figuur 6B is). Echter totale afwezigheid van monolignol verslaggever opneming in de Casparian band zelf geeft aan dat het volwassen stadium deze ontwikkelingsstoornissen terwijl de andere muren nog steeds de site van verdere biopolymeer afzetting zijn. De gereconstrueerde 3D-weergave van een z-stapel brengt de Casparian band duidelijk aan het licht. Interessant is dat de muren van enkele corticale cellen grenzend aan de endodermis ook geroepen, erin geslaagd H_AZ bij voorkeur opnemen (daardoor met vermelding van de aanwezigheid van lignine/suberine in de cortex vlas wortel) maar niet G_ALK. Co lokalisatie analyse toonde een anti-correlatie tussen H_AZ en G_ALK, die het bestaan van de muur van de cel-specifieke structuur/enzymatische machines in deze twee aangrenzende celtypen suggereren.

Aanvullende tabel 1: bereiding van solide ½ MS Medium Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 2: voorbereiding van de stamoplossingen chemische verslaggever Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Zoals eerder vermeld is de dubbele labeling BLISS-protocol gepresenteerd in dit document een van de eerste voorbeelden van een SPAAC/CuAAC combinatie in vivo^12,23. Elke stap werd zorgvuldig geoptimaliseerd en gevalideerd, en het is zeer belangrijk dat de volgorde waarin de twee klik op chemie labeling reacties worden opeenvolgend uitgevoerd wordt nageleefd (dat wil zeggen, SPAAC eerste, gevolgd door CuAAC). Alle cross-controles is gebleken dat elke labeling stap specifieke wanneer het BLISS-protocol toegepaste^{23 is} : eerste uitvoering van de SPAAC stap leidt tot de zeer chemoselective labeling van H_AZ azide functies door de cyclooctyne-matiemaatschappij fluorophore door een reactie van de [3 + 2] cycloadditie met snelle kinetiek. Zodra H_AZ eenheden zijn gecodeerd, kan de CuAAC stap copper(I) gekatalyseerd activering van G_ALK terminal alkynen te genereren van triazool links door reactie met de 545 azide-fluor-sonde vergend worden uitgevoerd. In contrast, de omgekeerde volgorde (dat wil zeggen, CuAAC eerste, gevolgd door SPAAC) mag niet worden gebruikt omdat het leidt tot G_ALK en H_AZ eenheid Kruis-koppeling, die concurreert met fluorophore afbinding en induceert een dramatisch verlies van signaal . Het is ook belangrijk om te benadrukken de noodzaak van de tussenliggende wassen stappen om te voorkomen dat niet-specifieke kleuring.

We hebben aangetoond dat onze methode kan worden toegepast op verschillende biologische experiment ontwerpen. De BLISS labeling protocol werd voor het eerst toegepast op freehand dwarsdoorsneden van vlas stengels (ongeveer 150-250 µm dik) die eerder werden gesneden en geïncubeerd met het klik-klaar monolignolen. Hoewel dit ontwerp het voordeel heeft van het minimaliseren van de benodigde hoeveelheid chemische verslaggever (zoals incubatie volumes worden verlaagd) en vergemakkelijking van de productie van statistische wordt gerepliceerd, is het niet, strikt genomen, een systeem in vivo en in sommige gevallen kunnen niet alle aspecten van echte spatio-temporele lignification dynamiek weerspiegelen. In een tweede proefopzet aangepast we daarom het BLISS-protocol, een methode die eerder werd gebruikt om te bestuderen van de opneming van radiolabeled monolignolen in pine en gingko²⁷. In deze benadering, de wortels en de stam van de plant zijn fysiek van elkaar gescheiden en de basis van de hele stengel is uitgebroed in de oplossing van de monolignol in wat kan worden gesynchroniseerd met de aanpak van 'bloemenvaas'. Na het verlaten van de stelen de gewenste (incubatietijd), zijn de dwarsdoorsneden knippen en het protocol van de BLISS uitgevoerd. Hierdoor konden wij tonen (i) dat de gewijzigde monolignolen worden getransporteerd via de levende stam en zijn opgenomen in het kweken van lignine polymeren binnen de celwanden en (ii) dat de lokalisatie patroon in wezen identiek is aan die van de dwarsdoorsnede was aanpak. Dit type experiment heeft de verdienste wordt uitgevoerd in een echte levende plant / levende cel aanpak waardoor langere experimenten en meer diepgaande studies, maar vereist grotere hoeveelheden chemische verslaggever. Ten slotte werd ook het BLISS-protocol gebruikt met vlas plant de zaailingen, vertegenwoordigen een echte levende plant model waarin de chemische verslaggevers geabsorbeerd door de wortels zijn moeten voordat het wordt vervoerd van de stengel. Terwijl dit model heeft het duidelijk voordeel wordt uitgevoerd in levende planten, in de praktijk is het beperkt tot jonge zaailingen en is niet echt geschikt is voor het onderzoeken van de dynamiek van de lignification in oudere planten om praktische redenen (lange incubatietijd, verhoogde hoeveelheid chemische verslaggevers). Echter deze drie experiment ontwerpen zijn complementair en hebben allemaal hun voor- en nadelen met betrekking tot de praktische aspecten en de biologische betekenis afhankelijk van het soort biologische vraag te worden beantwoord.

Ontwikkeld om te bestuderen van de dynamiek van de lignification in vlas, ons protocol is hoogst aanpasbaar, niet alleen in termen van biologische experiment design, maar ook op het gebied van de toepassing ervan op andere planten soorten en organen/weefsels. Bijvoorbeeld, kan BLISS gemakkelijk worden overgedragen aan de Arabidopsis of de Populus geslachten die meer vatbaar voor studies met knock-out of knock-down mutanten voor verschillende genen zijn. In principe, kunnen dual labeling studies met onze aanpak ook worden uitgebreid tot andere biomoleculen met behulp van twee afzonderlijke gewijzigde precursoren van plant celwand polymeren - met inbegrip van alle drie belangrijkste monolignolen of hun metabole precursoren en diverse monosacchariden die de polysacharide matrix vormen. Sinds haar oprichting, is bioorthogonal-chemie inderdaad voornamelijk ontwikkeld om onderzoeken van glycanen/polysacchariden door metabole oligosaccharide engineering (MOE)^4,5,17,28, maar verrassend genoeg zijn er slechts zeer weinig applicaties te planten biologie tot nu toe^{7,8,9,10,11,12}. In termen van verenigbaarheid van de reacties was de studie van lignine inderdaad een complexe zaak op te lossen als beide chemische verslaggevers zijn opgenomen in de dezelfde reticulated polymeer. De mogelijkheid voor labelloze H_AZ-G_ALK kruislings gekoppelde formatie was het grote probleem te overwinnen als gevolg van de ruimtelijke nabijheid van G_ALK en H_AZ eenheden binnen de 3D structuur van lignine²³, een beperking die mogelijk niet aanwezig als de twee chemische verslaggevers zijn niet opgenomen in de dezelfde soort biopolymeer of in dezelfde ruimtelijke regio van een bepaalde cel.

In een ruimer toepassingsgebied kan de BLISS-methodologie in wezen voor elke twee kleuren fluorescentie beeldvorming studie in bacteriële of dierlijke modellen met behulp van twee verschillende chemische verslaggevers, rekening houdend met een azide en terminal alkyn tag, respectievelijk worden toegepast.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
(E)-4-(3-(2-(2-(2-azidoethoxy)ethoxy)ethoxy)prop-1-en-1-yl)fenol (HAZ)			Gezegd als in Lion et al. Cell Chem. Biol. 2017, 24, 3, 326-338
(E)-4-hydroxy-3-propargyloxycinnamyl alcohol (GALK)			Gezegd als in Lion et al. Cell Chem. Biol. 2017, 24, 3, 326-338
2% natriumhypochloriet
20 cm hoge glazen buis
250 mL Schott-glasfles
48-well Plate
5/6-TAMRA-PEG3-Azide	Jena Bioscience	CLK-AZ109-1
Aluminiumfolie
Kaasdoek
Compost met klei
Coniferyl alcohol (G)	Sigma Aldrich	MFCD00002922
Koper (II) sulfaat pentahydraat
DBCO-PEG4-5/6-Carboxyrhodamine 110	Jena Bioscience	CLK-A127-1
Milli-Q Ultrapure water
Eppendorf 1,5 mL
EtOH
Linnenzaden (L. usitatissimum L.)
Fluoromount-G™ Slide Montage Medium	Electron Microscopy Sciences	17984-25
Glazen deksel
Glazen microscoopglas
Groeikamerbehuizing	CLF-Plant Climatics		Voor 2 weken oude plantencultuur
Groeikamerbehuizing	Angelantoni Life Sciences		Voor 2 maanden oude plantencultuur
Magenta plantcultuurdoos			Voor 2 weken oude zaailingcultuur
Methanol			Toxisch (SGH02, SGH06, SGH08), werk met handschoenen onder een kap
Micropipet
Nail polish
Nikon A1R confocale microscoop	Nikon
Orbitale shaker
Parafilm
p-Coumaryl alcohol (H)	Carbosynth	FC145653
Kunststof dop
Kunststof pipette
Kunststof pot			Voor 2 maanden oude plantencultuur
Veiligheidsmes
Rubberen band
Natrium ascorbaat
Steriele klem
Verticale steun
Vortex
Reagentia voor vloeibaar en vast ½ MS medium
KH2PO4
KNO3
NH4NO3
MgSO4.7H2O
CaCl2.2H2O
MnSO4.H2O
ZnSO4.7H2O
H3BO3
KI
Na2MoO4.2H2O
CuSO4.5H2O
CoCl2.6H2O
Na2EDTA.2H2O
FeSO4.7H2O
Thiamine.HCl
Pyridoxine.HCl
Glycine
Nicotinezuur
Myo-inositol
Saccharose
MES-hydraat
Agar