Visualiseren van leukocyten rollen en hechting in angiotensine II-geïnfundeerd muizen: technieken en valkuilen

Samenvatting

Dit manuscript beschrijft het gebruik van transgene reporter muizen en andere beheerprogramma routes van fluorescente kleurstoffen in angiotensine II-geïnduceerde hypertensie met behulp van intravital videomicroscopie van bloedvaten te evalueren van de activering van immune cellen en hun mogelijkheid te rollen en zich houden aan het endotheel.

Samenvatting

Epifluorescence intravital videomicroscopie (GODT) van de bloedvaten is een gevestigde methode om te evalueren van de activering van immune cellen en hun vermogen om de rol en zich houden aan de endothelial laag. Visualisatie van circulerende cellen door injectie van fluorescente kleurstoffen of fluorophore-coupled antilichamen wordt vaak gebruikt. Ook kunnen fluorescerende verslaggever muizen worden gebruikt. Interacties van leukocyten, in bepaalde lysozym M⁺ (LysM⁺) monocyten, met de vaatwand spelen een cruciale rol bij het bevorderen van arteriële hypertensie en vasculaire dysfunctie. Hier presenteren we de techniek om te visualiseren en te kwantificeren van leukocyten rollen en hechting in halsslagaderen in angiotensine II (AngII)-geïnduceerde hypertensie in muizen door GODT.

De inplanting van een katheter schaadt de vasculaire muur en leidt tot reacties van de gewijzigde bloedcel. Wij vergeleken verschillende injectie technieken en administratie routes te visualiseren van leukocyten in een LysMCre⁺IRG⁺ muis met wijdverspreide expressie van rode fluorescerende eiwit en voorwaardelijke expressie van groen fluorescent proteïne in LysM ⁺ cellen. Studeren LysM⁺ cel activatie, gebruikten we AngII geïnfundeerd muizen in welke rollen en de hechting van de leukocyten op het endotheel wordt verhoogd. We ofwel geïnjecteerd acridine oranje met behulp van een jugular katheter of direct al de staart ader en ten opzichte van de hoeveelheid rollen en naleven van cellen. We vonden dat jugular katheter implantatie per se steeg het aantal rollen en daaraan vastzittende LysM⁺ cellen in sham-geïnfundeerd LysMCre⁺IRG⁺ muizen in vergelijking met besturingselementen. Deze activering werd opgedreven in AngII-geïnfundeerd muizen. Interessant, injecteren van acridine oranje rechtstreeks via de staart ader niet verhogen LysM⁺ cel adhesie of rollen in sham-geïnfundeerd muizen. We daarmee het belang van transgene reporter muizen uiting van fluorescente proteïnen te niet mengen met in vivo processen tijdens experimenten aangetoond. Bovendien, staart veneuze injectie van fluorescerende traceurs misschien wel een mogelijk alternatief voor jugular katheter injecties.

Inleiding

Arteriële hypertensie verhoogt het risico van hart-en vaatziekten en dood en bevordert de ontwikkeling van atherosclerose, coronaire hart-en vaatziekten en arteriële of veneuze thromboembolisms¹. De ontwikkeling van hypertensie, is afhankelijk van de interactie van milieu, genetische, endocriene en hemodynamische factoren. Momenteel, worden immuniteit en verwante ontsteking gewaardeerd om te spelen een belangrijke rol in de etiologie van hypertensie².

Onder immuuncellen, T lymfocyten en monocyten en macrofagen bleken causaal betrokken in AngII-induced vasculaire ontsteking en hypertensie, gedeeltelijk gerelateerd aan hun vermogen om het activeren van reactieve zuurstof soorten³. Macrophage kolonie-stimulerende factor deficiënte muizen toonde verminderde reactie op AngII met betrekking tot de verhoging van de bloeddruk en vasculaire ontsteking⁴. In een vorige werk, kunnen we laten zien dat LysM + monocyten vasculaire dysfunctie en ontsteking in AngII-geïnduceerde hypertensie⁵rijden. Meer onlangs, beschreven we een nieuwe weg in welke coagulatie factor XI werkt met de bloedplaatjes en de vaatwand samen voor het opwekken van trombine-afhankelijke vasculaire ontsteking⁶. De huidige kennis over de rol van het immune systeem in hypertensie werd onlangs samengevat en beoordeeld door Rodriguez-Iturbe et al. ⁷

Aangezien de betrokkenheid van immuuncellen in de ontwikkeling van hypertensie bleek, modellen en technieken te bestuderen de interactie tussen het schip en de immuuncellen noodzakelijk geworden. Epifluorescence IVM van de bloedvaten is een nuttig instrument om te observeren in vivo interacties tussen het circulerende bloed cellen en het endotheel^8,9,10. Met deze techniek, kan de injectie van kleurstoffen intercalating met DNA (zoals acridine oranje) genucleëerde cellen (circulerende evenals van het endotheel) visualiseren. Geïsoleerde bloedplaatjes gekleurd ex vivo met rhodamin - 6 G of dichlorofluorescein (DCF) kan worden geïnjecteerd om te visualiseren van platelet-rich trombus in arteriële of veneuze letsel modellen.

Meestal een halsslagader katheter wordt gebruikt om te injecteren van verklikstoffen of gemarkeerd bloedplaatjes. Wijziging van het endotheel en verdere activering van de stolling cascade zijn beide bekend dat gevolgen hebben voor monocyt activering. Endothelial letsel leidt onmiddellijk tot bloedplaatjes activering via subendothelial matrix moleculen te verzegelen het weefsel, met de daaruit voortvloeiende monocyt attractie en activering¹¹. Integendeel, is een intact endotheel bekend dat anticoagulatie eigenschappen (bijvoorbeeld via weefsel factor pathway remmer of thrombomodulin)¹² en directe remmende effecten op de monocyt, bijvoorbeelddoor middel van de secretie van extracellulaire blaasjes met microRNAs¹³. Monocyten staan bekend om een factor van weefsel, de extrinsieke activator van de stolling cascade en uitdrukkelijke protease-geactiveerde receptoren (PARs) dat kunnen worden geactiveerd door trombine en deelnemen aan monocyt activering^14,15 . Dus, elke activering van bloedplaatjes of van de stolling cascade als gevolg van vasculaire verwonding wellicht onverwachte effecten op monocyt activering en interfereren met de waargenomen fenomeen. Met de hulp van IRG transgene LysM Cre transgene muizen, een dubbel-belichting fluorescerende Cre verslaggever muis (LysMCre⁺IRG⁺), stellen wij voor om te studeren in detail het effect van injecties met een katheter en alternatieve methoden op LysM⁺ MyeloMonocytaire cellen in een muismodel van arteriële hypertensie¹⁶.

Protocol

Experimenten werden uitgevoerd op mannelijke muizen leeftijd 8 tot 12 weken oud onder de goedkeuring van de ethische commissie dierproeven van Rijnland-Palts (autorisatienummer 23 177-07/G12-1-002 en 23 177-07/G15-1-051).

1. muis anesthesie en operatie voorbereiding

1. Controleer voorafgaand aan de operatie, of de goede gezondheid en conditie van de dieren. Voor de operatie, toezicht op dieren eenmaal per dag gedurende 2-3 dagen voor hun algemene voorwaarde (uiterlijk, houding, spontane gedrag) en lichaamsgewicht, voedsel en waterverbruik.
2. Voorbereiden op de master mix anesthesie met midazolam (5 mg/kg lichaamsgewicht), medetomidine (0,5 mg/kg lichaamsgewicht) en fentanyl (0,05 mg/kg lichaamsgewicht) tot intraperitoneally (i.p.) 200 µL/30 g muis in 1 mL injectiespuit met een naald 26 G injecteren.
3. Osmotische pomp implantatie en dierlijke voorbereiding GODT experimenten worden uitgevoerd op een veld van de operatie met een 39 ° C verwarmen platform. Alle gereedschappen in een bad van desinfectie steriliseren en desinfecteren van de opwarming van de aarde platform.
4. Tijdens de procedures, de dierlijke ogen met oog zalf te beschermen. De vacht verwijderen met scheermessen voordat osmotische pomp implantatie. Gebruik een ontharing crème en katoen-swabs voor isolatie van de carotids en jugular katheter implantatie in GODT experimenten. Desinfecteren van de huid van een proefdier met behulp van twee desinfectiemiddelen van de huid: een antiseptische en ontsmettingsmiddel met Povidon-jodium en een huid antiseptische met octenidine in alcohol gebaseerde oplossing.
5. Voorbereiding van de master mix aan jent verdoving ("antisedan mix") met atipamezol (0,05 mg/kg lichaamsgewicht) en flumazenil (0,01 mg/kgbody gewicht), en bereiden van 200 µL/muis in 1 mL injectiespuit met een naald 26 G worden subcutaan (SC) ingespoten.

2. osmotische pomp voorbereiding en implantatie

Opmerking: De subcutane infusie van de AngII met behulp van osmotische pompen werd in detail beschreven door Lu et al. ¹⁷

1. De AngII door de krachten van het gelyofiliseerd poeder met een steriele zoutoplossing bereiden en aanpassen van de concentratie met het dier gewicht en de levering van de pomp. Houd de gereconstitueerde AngII plastic buizen (gebruik geen glazen buizen).
2. Vul de pompen met de oplossing van de AngII voor het leveren van 1 mg/(kg·d) voor 7 dagen. Na de voorbereiding, houden de pompen in een steriele zoutoplossing gedurende 4-6 uur minimum bij 37 ° C.
3. Test de volledige narcose van de muis na injectie van de verdoving mix met achterkant voet reflexen en plaats deze op het veld van warme werking. Inductie van de anesthesie duurt 10-15 min en werkt beter als dieren worden geplaatst in een donkere omgeving.
4. Scheren van de lagere achterkant van de muis en het ontsmetten met een antiseptisch alcoholische huid.
5. Maak een incisie van 1 cm loodrecht op de wervelkolom met behulp van schaar. Een zak voor de pomp met behulp van een enge hemostat maken en invoegen van de pomp (moderator eerst stromen). De zak moet toestaan dat vrije verkeer van de pomp met geen druk op de wond.
6. Sluit de wond met hechtingen en niet-clips, ter beperking van ontsteking; vervolgens desinfecteren met antiseptische huid.
7. Schrikken van de narcose door s.c. injectie van 200 µL van de antisedan mix en de muis terug naar haar kooi.
8. Verrichten van postoperatieve analgesie met buprenorfine (0.075 mg/kg s.c.) één keer na de operatie en op aanvraag afhankelijk van het dierlijk gedrag.

3. jugular katheter implantatie en Carotids voorbereiding

1. De volledige narcose van de muis testen na injectie van de narcose meng met achterste voedsel reflexen en plaats het narcose dier in dorsale recumbence op de chirurgische plaat 39 ° C met een rectale sonde om te houden van de temperatuur en zet de zalf over de ogen om hen te beschermen tijdens de procedure.
2. Verwijder nek haren gebruiken van de haar verwijdering room. Gebruik een wattenstaafje om te verspreiden en wrijf de crème gedurende 2 minuten, totdat de haren beginnen te vallen uit. Na een extra 2 min, verwijder de room en de haren met een spatel en desinfecteren van de huid met een antiseptische alcoholische huid.
3. Het uitvoeren van de operatie onder een stereomicroscoop. Maak een 1-1,5 cm lange incisie in de huid overlangs in de nek, 1 cm naast de luchtpijp. Breng twee andere insnijdingen loodrecht aan beide uiteinden van de eerste insnijdingen.
4. Zorgvuldig verwijderen van weefsels naast de huid en verwijder het stukje huid die betrekking hebben op de linker halsslagader en de luchtpijp.
5. Zorgvuldig het isoleren van de klieren parotide; sublinguaal en onderkaak klieren van de zone van belang met 2 gebogen pincet. Niet knippen of beschadigen van de klieren, plaats hen om de beste toegang tot de halsslagader en de carotids.
6. Om te isoleren van de halsslagader, dunne pincet gebruiken en langzaam open en sluiten om te voorzichtig gratis het schip van het omringende weefsel. Zodra de ader helemaal schoon is, het plaatsen van de verlostang onder het schip en plaats twee 7-0 hechtingen van 10 cm eronder.
7. Sluit de hechtdraad proximale op het hoofd met twee knopen. Op de andere hechtdraad, bereiden van één knoop, maar sluit het niet.
8. Houd de katheter (0,28 mm binnendiameter, 0.61 mm buitendiameter) gevuld met 37 ° C steriele zoutoplossing met een tang met één hand; terwijl met de andere hand, maakt een kleine incisie in het vaartuig met een dunne schaar of een gebogen 26 G naald. Vervolgens steek de katheter in de halsslagader en sluit de knoop twee keer. Sluit de hechtdraad proximale aan het hoofd over de katheter met het oog op een volledige immobilisatie.
9. Ontleden om te isoleren en bereiden de halsslagaderen, het gebied dat de luchtpijp met behulp van dun gebogen pincet.
10. Zodra de carotids vrij zijn van de omringende weefsels, de nervus vagus (het ziet eruit als een witte lijn grenzend aan de halsslagader) uit het schip verwijderen (maar niet doen knippen). De dunne Tang kunnen worden gesloten en langzaam geopend te voorzichtig het mobiliseren van de zenuw.
11. Zodra beide slagaders helemaal schoon zijn, plaatsen van de verlostang onder de eerste halsslagader en een kleine zwarte 3 mm breed x 2,5 cm lengte plastic stuk onder het schip te plaatsen. Het is zeer belangrijk niet te overstretch van het vaartuig en te controleren dat de doorbloeding aanwezig is wanneer de houder van het schip is geplaatst. Plaats de tweede slagader boven de houder van het vaartuig. Als de muis niet onmiddellijk onder de Microscoop wordt geplaatst, zet terug de klieren via de luchtpijp en de steriele zoutoplossing 37 ° C om te voorkomen dat het drogen van de zone van toepassing.

4. beoordeling van het rollend en naleven van leukocyten / LysM + cellen met GODT

1. Bereiden van acridine oranje van een stamoplossing van 2 mg/mL, opgeslagen bij-20 ° C en Verdun het 1:4 in steriele zoutoplossing (0,5 mg/mL eindconcentratie) in een 1 mL spuit.

De spuit beschermen tegen licht en 200 µL per één muis gebruiken.

1. Verschillende testomstandigheden: (1) injectie van acridine oranje met de jugular katheter; (2) injectie van acridine oranje rechtstreeks in de ader staart laterale (met deze aandoening die geen jugular katheter was geïmplanteerd); (3) meting zonder acridine oranje met behulp van de fluorescentie LysMCre⁺IRG⁺ muizen (hier opnieuw geen jugular katheter was geïmplanteerd).

Zodra de katheter op zijn plaats is en de twee carotids geïsoleerd zijn, plaatst u de muis onder de Microscoop. Uitvoeren van metingen met een high-speed breed-gebied fluorescentie Microscoop gebruiken van een interlokaal condensator en een 10 X (NA 0,3) water onderdompeling doelstelling met een monochromator, een balk splitter en een camera van de charge - coupled apparaat. Beeldacquisitie en analyse met real-time imaging systeem uitvoeren.

Concentreren van de Microscoop doelstelling in het midden van de halsslagader aan de oppervlakte van het endotheel. Langzaam injecteren 50 µL van acridine oranje (0,5 mg/mL) (rekening te houden met het dode volume van de katheter voor de eerste injectie). De software voor het registreren van 100 beelden met een belichtingstijd van 120 milliseconden per afbeelding instellen

Vier video's per halsslagader (links en rechts) op verschillende locaties op de slagader voor elke video te maken. Als het signaal van de fluorescentie afneemt, injecteren een andere 50 µL van acridine oranje.

Na het opnemen van alle video's euthanaseren het dier door cervicale dislocatie.

De snelheid van de video instellen op 10 beelden per seconde en kwantificeren van de cellen van het glooiende en aanhangend volgens een 200 µm x 250 µm rechthoek geplaatst in het midden van het schip voor elke video. De rollende en Adherente cellen tellen; Adherente cellen worden gedefinieerd als de cellen die niet bewegen of losmaken van het endotheel binnen de 10 s-video. Om te vereenvoudigen kwantificering, verwijder het kanaal met de rode fluorescentie en gebruik alleen de groene fluorescentie te rollen en daaraan vastzittende cellen tellen.

Voor experimenten met behulp van acridine oranje, maken een manuele drempel van de fluorescentie te verwijderen van de achtergrond gemaakt door endotheliale cellen

Resultaten

Carotids van LysMCre⁺IRG⁺ muizen doordrenkt met AngII werden waargenomen met behulp van GODT. Acridine oranje werd geïnjecteerd met behulp van een jugular katheter. Wij gericht te kijken naar het aantal LysM⁺ cellen in contact met de vasculaire muur ten opzichte van alle genucleëerde circulerende cellen (die kunnen ook samenwerken met het schip omdat discriminatie van het celtype interactie met het schip bleef een open vraag uit onze eerdere werk). Op de basislijn veroorzaakt de aanwezigheid van een jugular katheter hechting van LysM⁺ cellen (figuur 2A, D). Na injectie van acridine oranje, waren dezelfde cellen TL, maar ook de endotheliale cellen waren TL (figuur 2B, E). Nadat de vermindering van de achtergrond te beperken endothelial gerelateerd fluorescentie, de gegevens aan te geven dat alle genucleëerde daaraan vastzittende cellen zijn LysM⁺ (figuur 2C, F); deze resultaten gelden na AngII infusie om onze eerdere resultaten te bevestigen en aan te tonen dat de LysMCre⁺IRG⁺ is een goed model om te kijken wat het effect van AngII op LysM⁺ cel activatie.

We geëvalueerd de rol van de administratie routes van acridine oranje op activering van de cel van de LysM⁺ na AngII infusie in LysMCre⁺IRG⁺. Na een week van AngII infusie, leukocyten endotheel interacties in halsslagaderen van LysMCre⁺IRG⁺ muizen waren beeld en gevisualiseerd door GODT met of zonder acridine oranje injectie via een jugular katheter of via de ader van de staart. Zonder katheter of injectie, was rollen van LysM⁺ cellen aanzienlijk verhoogd na AngII infusie in vergelijking met onbehandelde muizen, hechting aan en de toegenomen (Figuur 3). Muizen injectie van acridine oranje met een hechting jugular katheter verhoogd en rollen in AngII getrakteerd op een grotere mate in vergelijking met muizen zonder een katheter (Figuur 3). Injectie van acridine oranje in de ader van de staart leidt tot soortgelijke hechting en rollen in vergelijking met de muizen die geen injectie van acridine oranje (Figuur 3).

Figuur 1. Regeling voor de angiotensine II infusie en beoordeling van LysM⁺ cellen rollen en hechting in muizen. LysMCre⁺IRG⁺ muizen 7 dagen waren doordrenkt met AngII en vast te houden, alsmede het rollend LysM⁺ over de carotids cellen werden gekwantificeerd met of zonder injectie van acridine oranje via een jugular katheter of staart ader injectie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2. Beoordeling van LysM⁺ cel adhesie en rollen in de halsslagaderen van LysMCre⁺IRG⁺ muizen. Hechting van LysM⁺ cellen in LysMCre⁺IRG⁺ muizen vóór (A, D) en na (B, E) acridine injectie via een jugular katheter. Rode en groene fluorescentie waren opgenomen, LysM⁺ cellen (in groen) en de zachte spiercellen (in rood) zichtbaar waren. Na injectie van acridine oranje, endotheliale cellen zijn ook zichtbaar in het groen, maar verwijderen achtergrond fluorescentie kunt enige circulerende nucleated cel visualisatie (C, F). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 3. Evaluatie van administratie routes van fluorescente kleurstoffen in angiotensine II geïnfundeerd LysMCre⁺IRG⁺ muizen. Kwantificering van het rollend (A) en (B) LysM⁺ vasthouden cellen in sham geëxploiteerd of AngII-geïnfundeerd dieren en met of zonder injectie van acridine oranje met behulp van een jugular katheter of door staart veneuze injectie. Representatieve foto's van de verschillende omstandigheden (C). Resultaten zijn gemiddelde ± standaardafwijking van het gemiddelde. 2-way ANOVA werd uitgevoerd en Bonferroni van post hoc test, n = 3-12/groepen; p < 0.05. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussie

LysM⁺ monocyten werden eerder vertoond te worden betrokken bij de ontwikkeling van hypertensie⁵. Hier laten we zien dat LysM⁺ immuuncellen rollen en zich aan de endothelial laag in reactie op AngII infusie houden. Deze bevinding werd verkregen met behulp van LysMCre⁺IRG⁺ muizen uit onze eerdere studies verkenning van de rol van immuuncellen in hypertensie in vivo door leukocyten met injectie van acridine oranje^6,10te visualiseren. Discriminatie van celtypes vast te houden aan het endotheel was dus niet mogelijk.

De GODT is een zeer nuttig hulpmiddel voor vasculaire studies en in vivo waarnemingen van cellen rechtstreeks in de therapieën, maar het effect van het injecteren van kleurstoffen met de hulp van een chirurgisch ingevoegde katheter in de inflammatoire context van hypertensie blijft onbekend. Voor de evaluatie van het potentiële effect van katheter en acridine oranje injectie we profiteerde van de LysMCre⁺IRG⁺ muizen. AngII infusie steeg het nummer van het rollend LysM⁺ cellen aan het endotheel. Inbrengen van een katheter in de halsslagader versterkt het effect en meer etappen te verwezenlijken, daaraan vastzittende leukocyten werden ontdekt in AngII-geïnfundeerd muizen geïnstrumenteerd met een katheter in vergelijking met muizen zonder katheter implantaten. Dit geeft aan dat het implanteren van een carotis katheter wordt een systemische inflammatoire reactie in het kader van wondheling die als overlay met de immune reactie gezien in hypertensie¹⁸. Bovendien, als gevolg van de nabijheid van de halsslagader aan de halsslagader zou kunnen een extra immuunactivatie hebben voorgedaan door het beïnvloeden van de halsslagader. Aangezien dit effect niet aanwezig was toen injecties rechtstreeks in de ader van de staart zijn aangebracht, kunnen we ervan uitgaan dat het effect te wijten was niet naar de kleurstof maar naar de procedure voor het invoegen van de katheter. We hier het belang van transgene reporter muizen uiting van fluorescente proteïnen te niet mengen met in vivo processen tijdens experimenten aangetoond. Bovendien, staart veneuze injectie van fluorescerende traceurs misschien wel een mogelijk alternatief voor jugular katheter injecties.

Een kritische stap van de procedure is de AngII infusie. Staart kan manchet de bloeddruk worden beoordeeld om te bepalen van de effectiviteit van AngII levering door de pomp. Bloed druk moet toenemen na 2−3 dagen van infusie. Om te beperken ontsteking die LysM⁺ cellen activering kan beïnvloeden, moet de sluiting van de incisie waar de pomp is geïmplanteerd met hechtingen in plaats van clips worden gemaakt. Een beperking dient te worden opgemerkt over staart veneuze injectie: om de beste mogelijke data-acquisitie, 4 video's zijn meestal genomen voor elke halsslagader. Als het fluorescent signaal afneemt, 50 µL van acridine oranje worden geïnjecteerd maar met staart injectie is het moeilijker om verschillende injecties en de carotids om stabiel te houden onder de Microscoop doelstelling. De duur van de aanwezigheid van een katheter in de halsslagader misschien ook de activering van de immune cellen moduleren het invloed heeft op de activering van de stolling in platelet-rich plasma bereid 4 h na de katheter implantatie¹⁹. Dit aspect van de katheter implantatie moet verder onderzoek.

Ten slotte, zelfs als we de impact van jugular katheter implantatie op activering van de cel van de LysM⁺ na AngII infusie waarderen, kan niet volledig schatten we de rol van de voorbereiding, verwijdering van de huid en carotis isolatie op een potentiële LysM⁺ -cel activering. We concluderen dat het gebruik van fluorescentie reporter muizen zoals de LysMCre⁺IRG⁺ muis wordt aanbevolen om onderbrekingen van de integriteit van het schip tijdens de dierlijke voorbereiding voor in vivo imaging te voorkomen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Midazolam	Ratiopharm GmbH		Anesthesiegemeng
Medetomidine	Pfizer Deutschland GmbH		Anesthesiegemeng
Fentanyl	Janssen-Cilag GmbH		Anesthesiegemeng
Alzane	Zoetis		Antisedan-gemeng
Flumazenil	Hikma pharma		Antisedan-gemeng
Braunol	B Braun
Octeniderm	Schülke
Osmotische pompen	Alzet	1007D	Implantatie van osmotische pomp
Angiotensine II	Sigma-Aldrich		Implantatie van osmotische pomp
7-0 proleennaad	Ethicon		Implantatie van osmotische pomp
Acridine oranje	Sigma-Aldrich
Katheter	Smiths Medical Deutschland GmbH		Binnendiameter, 0,28 mm; buitendiameter, 0,61 mm
Microscoop	Olympus	BX51WI fluorescentiemicroscoop
Beam Splitter	Photometrics	CMR-DV2-SYS - DualView2 MicroImager
Objectief	Olympus	UMPLFLN10X	Water-immersieobjectief met een monochroom
Camera	Hamamatsu Photonics	ORCA-R2
Beeldverwervings- en analysesoftware	Olympus	Realtime Imaging System eXcellence RT
Muizen	The Jackson Laboratory	Jax 008705	B6.Cg-Tg(CAG-DsRed,-EGFP)5Gae/J
Muizen	The Jackson Laboratory	Jax 004781	LysM Cre (B6.129P2-Lyz2tm1(cre)Ifo/J )