Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Muismodellen van Helicobacter infectie en maag pathologieën

20.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/56985

⸱

18 oktober 2018

 ,  ,  , 
1Centre for Innate Immunity and Infectious Diseases, Hudson Institute of Medical Research, 2Infection and Immunity Program, Monash Biomedicine Discovery Institute and Department of Microbiology, Monash University

In dit artikel

Samenvatting

Muizen vertegenwoordigen een onschatbare waarde in vivo -model om te studeren van besmetting en ziekten veroorzaakt door gastro-intestinale micro-organismen. Hier beschrijven we de methoden gebruikt bij het bestuderen van bacteriële kolonisatie en histopathologische veranderingen in muismodellen van Helicobacter pylori-gerelateerde ziekte.

Samenvatting

Helicobacter pylori is een maag ziekteverwekker die aanwezig is in de helft van de wereldbevolking en is een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit bij de mens. Verschillende Muismodellen van maag Helicobacter infectie zijn ontwikkeld om te bestuderen van de moleculaire en cellulaire mechanismen waarbij H. pylori bacteriën koloniseren de maag van menselijke gastheren en ziekte veroorzaken. Hierin beschrijven we protocollen: 1) bacteriële schorsingen voorbereiden op de infectie in vivo van muizen via intragastric maagsonde; 2) bepalen bacteriële kolonisatie niveaus in muis maag weefsel, door de Kettingreactie van de polymerase (PCR) en levensvatbare tellen; en 3) beoordelen pathologische veranderingen, door histologie. Om vast te stellen HelicobactTranslator infectie bij muizen, specifieke pathogenen vrije (SPF) dieren worden eerst geïnoculeerd met suspensies (met ≥105 kolonie-vormende eenheden, CFUs) van muis-koloniseren stammen van beide Helicobacter pylori of andere maag Helicobacter spp. van dieren, zoals Helicobacter felis. Op de juiste tijdstippen na infectie, zijn magen weggesneden en ontleed sagittally in twee gelijke weefsel fragmenten, elk bestaande uit het antrum en lichaam regio's. Een van deze fragmenten wordt vervolgens gebruikt voor levensvatbare tellen of DNA-extractie, terwijl de andere histologische verwerking is onderworpen. Bacteriële kolonisatie en histopathologische veranderingen in de maag kunnen routinematig in maag weefselsecties gekleurd met Warthin-Starry Giemsa of Haematoxylin en eosine (H & E) vlekken, als passend worden beoordeeld. Extra immunologische analyses kunnen ook worden uitgevoerd door immunohistochemistry of immunofluorescentie op muis maag weefselsecties. De hieronder beschreven protocollen zijn speciaal ontworpen om de beoordeling in muizen van maag pathologieën die lijkt op die in de mens-gerelateerde H. pylori ziekten, waaronder ontstekingen, klier atrofie en lymfoïde follikel vorming. De bereiding van het entmateriaal en intragastric maagsonde protocollen kunnen ook worden aangepast aan het bestuderen van de pathogenese van andere zuurbestendige menselijke pathogenen die muizen, zoals Salmonella Typhimurium of Citrobacter rodentiumkoloniseren.

Inleiding

Helicobacter pylori is een spiraal-vormige, gramnegatieve, menselijke maag pathogen aanwezig in alle bevolkingsgroepen over de hele wereld, met infectieniveaus in ontwikkelingslanden naar schatting in de orde van 80%1. Hoewel de meeste H. pylori-geïnfecteerde individuen zijn asymptomatisch, sommige meer ernstige ziekten, variërend van peptic ulceratie aan maagkanker2te ontwikkelen. H. pylori-geassocieerde kankers zijn over het algemeen gekenmerkt door kwaadaardige veranderingen in epitheliale cellen (GECs) of door de vorming van extra knooppunten lymfoïde weefsels in de maag, resulterend in maag adenocarcinoom of mucosa-geassocieerde lymfoïde weefsel (mout) lymfoom, respectievelijk. H. pylori is zeer geschikt om te overleven in de strenge ecologische niche van de maag als gevolg van de aanwezigheid van verschillende virulentiefactoren en mechanismen te vergemakkelijken zijn aanhankelijkheid, de groei en het metabolisme in deze niche. In het bijzonder bezitten virulente stammen van H. pylori de 40 kb cag pathogeniteit eiland (cagPAI) dat ongeveer 30 genen benodigd voor de productie van een Type 4 secretie systeem (T4SS)3,4 codeert . CAG PAI-positieve H. pylori -stammen zijn geassocieerd met de inductie van hogere niveaus van chronische ontsteking in de host, die als een essentiële voorloper van maag adenocarcinoom5heeft zijn betrokken.

In vivo diermodellen, vooral muizen, zijn zeer informatief geweest doordat onderzoekers te onderzoeken van de relatieve bijdragen van host, bacteriële en ecologische factoren op H. pylori infectie en ziekte resultaat6. Studies hebben eerder aangetoond dat langdurig H. pylori infectie van muizen op de resultaten van de C57BL/6-genetische achtergrond in de ontwikkeling van chronische gastritis en klier atrofie, beide kenmerken van H. pylori infectie7. Bovendien is besmetting met de verwante katachtige/canine bacteriesoorten, H. felis, gebleken voor het opwekken van mout vorming in muizen met soortgelijke pathologie en progressie van de ziekte zoals gezien in de menselijke MALT lymfoom-8,9. De meest gebruikte H. pylori isolaat in muis kolonisatie studies is de "Sydney stam 1" (SS1) stam10, dat is cagPAI+ , maar heeft een niet-functionele T4SS (T4SS−)11. Andere gebruikte stammen omvatten H. pylori B128 7.13 (cagPAI+/T4SS+)12 en X47-2AL (cagPAI-/T4SS−)13. Voor H. felis infecties, de stam CS1 ('kat spiraal 1" cagPAI-/T4SS−) is over het algemeen gebruikte14.

Hierin bieden wij een protocol met een beschrijving van de voorbereiding van Helicobacter entmateriaal voor in vivo infectie, de procedure voor intragastric maagsonde van muizen, alsmede methoden voor de verwerking van weefsels voor de studie van histopathologische veranderingen in de maag. Met name dit artikel zal zich richten op de histologische methoden gebruikt voor het visualiseren van bacteriële kolonisatie en beoordelen van histopathologische veranderingen, met inbegrip van de vorming van de mout, in het maagslijmvlies van geïnfecteerde muizen. Sommige van de hier beschreven methoden kunnen worden aangepast aan de studie van andere darm-pathogenen zoals S. Typhimurium of C. rodentium.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. groei en voorbereiding van bacteriële entmateriaal

  1. Ontdooien glycerol voorraden van H. pylori of H. felis15 uit-80 ° C en subcultuur op paard bloed agar (HBA) platen bestaande uit: bloed Agar Base No.2 (Zie Tabel van materialen); een gemodificeerde "Skirrow van antibiotica selectieve supplement" (bestaande uit vancomycine, 10 μg/mL; Polymyxine B, 25 ng/mL trimethoprim, 5 µg/mL; amfotericine B, 2.5 μg/mL); en 5 – 10% (v/v) paard bloed15,16. De bacteriën groeien goed onder microaerobe voorwaarden in 2.5 of 3.5 L anaërobe potten de juiste gas verpakkingen bevatten (Zie Tabel of Materials), bij 37 ° C.
    Opmerking: H. pylori stammen gegroeid onder deze omstandigheden moeten worden overgeënt na 1-1,5 dagen incubatie, overwegende dat voor H. felis, ten minste 2 dagen incubatie is in het algemeen vereist. Geschikte cultuur en opslag media zijn beschreven in detail eerder15.
  2. Bacteriële entmateriaal voorbereiden muis besmetting van begin-tot-mid logaritmische fase culturen. De bacteriën van de oogst voorzichtig uit agar platen door overstromingen van elke plaat met 1-2 mL hersenen hart infusie (BHI) Bouillon. Gecombineerd schorsingen van platen Pasteur pipetten.
    1. U kunt ook bereiden entmateriaal uit Helicobacter bacteriën die hebben doorgegeven in BHI bouillon voor 16-18 h15. In dit geval, het verzamelen van bacteriën door lage snelheid centrifugeren bij 2200 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
  3. Het beoordelen van de levensvatbaarheid en de beweeglijkheid van de bacteriën door de behandeling van natte mount preparaten onder fase contrast microscopie (100 X doelstelling). Bereiden van natte mounts door resuspending een entoog van bacteriën in een droplet 10 – 20 μL van BHI Bouillon op een microscoopglaasje van glas. In het geval van H. felis, oftewel een veel grotere bacterie dan H. pylori, gebruikt u een haemocytometer om nauwkeurig te tellen het aantal levensvatbare bacteriën. Bevestig cultuur zuiverheid door het uitvoeren van een Gramkleuring.
    Opmerking: Gebruik alleen H. pylori entmateriaal als de meerderheid van de bacteriën een shape van het pleiotrope of spiraal hebben (de morfologie kan variëren afhankelijk van de spanning). H. felis entmateriaal dient voornamelijk spiraalantennes-vormige bacteriën. Gebruik geen entmateriaal als de meeste bacteriën een coccoid morfologie, hebben zoals deze formulieren niet rendabel zijn en niet tot stand te voor een infectie in muizen brengen zal.
  4. Schatten van het aantal bacteriën in het entmateriaal door te tellen onder fase contrast microscopie het benaderende aantal bacteriën per veld (100 X doelstelling) en met behulp van de volgende gids: 1 bacterie per veld = ongeveer 106 kolonie-vormende eenheden () CFU) van Helicobacter/mL; 10 bacteriën per veld = ongeveer 107 CFU/mL; 100 bacteriën per veld = ongeveer 108 CFU/mL, enz.
    1. Bij het gebruik van een haemocytometer, berekenen CFU/mL met behulp van de volgende formule:
      CFU/mL (gemiddelde aantal bacteriën in een veld van 4 x 4) = x (verdunningsfactor) x (104).
  5. Pas de dichtheid van de bacteriële cel van het entmateriaal tot ongeveer 107–108 CFU/mL door verdunning in BHI Bouillon, indien nodig.
    1. Om ervoor te zorgen maximale bacteriële levensvatbaarheid, door entmateriaal voor intragastric maagsonde zo spoedig mogelijk na de bereiding te gebruiken.
    2. Bevestig altijd H. pylori celdichtheid en levensvatbaarheid door het uitvoeren van levensvatbare tellen van entmateriaal onmiddellijk na de maagsonde procedure (zie hieronder). Dit is niet altijd mogelijk voor H. felis, zoals het vormt meestal geen geïsoleerde kolonies op voedingsbodems. Het aantal levensvatbare Helicobacters in entmateriaal kan niet worden bepaald door de optische dichtheid meting (een600) alleen als deze methode geen onderscheid tussen levensvatbare maakt (d.w.z., bacillaire/spiraal/helical) en niet-levensvatbare ( dat wil zeggen, coccoid) bacteriën.
    3. Optische dichtheid waarden gebruiken als een middel voor het schatten van het aantal levensvatbare H. pylori bacteriën in entmateriaal, maar in dit geval, is het eerst nodig om te genereren een groeicurve. Hiervoor, worden de waarden van de600 A van H. pylori culturen gecontroleerd na verloop van tijd en gecorreleerd direct tegen het aantal levensvatbare bacteriën, bepaald door optelling van de plaat.
      Opmerking: Een handige methode voor het uitvoeren van zulke vaststellingen groei curve is naar de bacteriën van de cultuur in vloeistof (punt 1.2), met behulp van standaard platte bodem weefselkweek kolven in een 10% CO2 incubator geplaatst. Het aantal CFUs, bepaald op basis van de hoeveelheden van de culturen verkregen elke 4-6 h meer dan 2-3 dagen, worden dan vergeleken met de corresponderende een600 waarden17. Nog belangrijker is, is dat de groeikrommes moeten worden gegenereerd voor elke stam van H. pylori , zoals deze tegen verschillende tarieven groeien kunnen en, bovendien, niet alle stammen goed in 10% CO2 groeien.

2. intragastric maagsonde van muizen met Helicobacter

Opmerking: Deze methode van intragastric maagsonde kan worden toegepast op andere bacteriesoorten die de darm b.v. S. koloniseren TyphimuriumC. rodentium, Listeria monocytogenes.

  1. Gebruik 6-8 weken oude, van specifieke pathogenen vrije (SPF) en Helicobacter-gratis mannelijk of vrouwelijk muizen. Gebruik maken van dieren met een genetische achtergrond van C57BL/6 voor infectie met H. pylori of H. felisexperimenten. In de huidige studie, wij gebruikte wild-type (WT) en genetisch gemodificeerde C57BL/6 muizen ontbreekt een belangrijke aangeboren immuun receptor (knock-out of KO dieren genoemd).
    Opmerking: Muizen op een andere genetische achtergrond kunnen ook worden gebruikt voor Helicobacter infecties, echter kolonisatie niveaus en de ernst van de ziekte kunnen worden beïnvloed door het soort host achtergrond18,19.
  2. De bacteriële entmateriaal (stap 1.5) gecombineerd in wegwerp 1 mL spuiten en vervang de meegeleverde naalden met 23 meter naalden waarop aangebrachte wegwerp polyethyleen katheters (lengte 6-8 cm, inwendige diameter, 0.58 mm zijn). Fast katheters aan de naalden door toepassing van kleine reepjes van plastic film (Zie Tabel van materialen). Als alternatief, vervang de naald/catheter vergadering met behulp van steriele kunststof buizen voeding (20 gauge x 38 mm).
  3. Fysiek bedwingen muizen met een stevige grip op het nekvel van de hals en de staart.
    Opmerking: Deze procedure kan worden uitgevoerd zonder verdoving, of als alternatief, met het gebruik van een geïnhaleerde verdoving, zoals methoxyflurane of Isofluraan15.
  4. Katheter invoegen in het centrum van de open kaak en gids in een caudal richting de slokdarm. De nek van de muis om gemakkelijke toegang tot de maag via de slokdarm (en weg van de luchtpijp) te verlengen tot en met de meeste of alle van de katheter is niet meer zichtbaar en een weerstand wordt gevoeld, overeenkomt met de basis van de maag. Leveren van een bepaalde hoeveelheid, meestal 100 μl per inenting (Figuur 1).
    Opmerking: Muizen moeten worden gavaged met ≥ 105 CFU om optimale kolonisatie en ziekte pathologie.
  5. Huis muizen in een SPF dier faciliteit voor de duur van het experiment.
    Opmerking: Ernstige pathologie en adenocarcinoom in WT C57BL/6 muizen is alleen waargenomen op ongeveer 24 maanden na infectie20. Dit effect kan echter worden versneld in sommige genetisch gemodificeerde dieren of in muizen met andere genetische achtergronden.
  6. Na voltooiing van de maagsonde-procedure, het uitvoeren van een wijziging van de Miles en Misra techniek om te bepalen van het aantal levensvatbare H. pylori bacteriën toegediend aan muizen. Hiervoor wordt het entmateriaal serieel verdund (vanaf 10−1 aan 10−5) in BHI met behulp van de methode beschreven in detail eerder15.
    Opmerking: Met het oog op een isolatie van enkele kolonies, HBA platen moeten worden opgewarmd en gedroogd in een biologische veiligheid kabinet of 37 ° C incubator voor 10 – 15 minuten vóór gebruik.

3. het oogsten van weefsels van muizen na experiment

  1. Euthanaseren muizen door kooldioxide inademing of cervicale dislocatie, volgens de desbetreffende ethische commissie voor dierproeven.
  2. Open de buikholte en accijnzen van de maag met behulp van fijne, gebogen schaar.
    Opmerking: Sera kunnen ook worden verzameld door cardiale punctie om te helpen bij het onderzoek van systemische reacties op Helicobacter infectie. Bovendien, de collectie van milt en lymfklieren van paragastric zijn nuttig bij het bestuderen van adaptieve immuunresponsen.
  3. Snij de maag langs de grotere kromming en verwijder residuele voedsel door zachte wassen in steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) in een 50 mL-buizen.
  4. Wassen van de maag weer in steriele PBS en noteer het natte gewicht met behulp van het plastic petrischaaltjes getarreerde 6 cm.
  5. Afvlakken van de maag en ontleden sagittally in twee gelijke weefsel fragmenten, elk bestaande uit: het antrum, het lichaam en de niet-klierweefsel voormaag regio's (Figuur 2). Verwijder de niet-klierweefsel regio en weeg een helft van elk maag alvorens toe te voegen aan beide 1 mL steriele BHI (voor het tellen van de levensvatbare) of magnetisch ingevroren in vloeibare stikstof (voor DNA/RNA extractie).
    Opmerking: Buizen met weefsel in BHI moeten worden opgeslagen op ijs totdat ze klaar om te worden verwerkt. Snap bevroren maag weefsels kunnen ook worden gebruikt om uit te pakken van RNA of eiwitten voor qPCR (kwantitatieve PCR) of westelijke bevlekkende analyses, respectievelijk.
  6. Voeg de andere maag de helft tot een tube van 15 mL met 10% formaline. Onderdompelen van weefsels in 10% formaline voor 10 s en vervolgens plat tot de bovenzijde van de buizen. Het toestaan van weefsels te herstellen voordat u opnieuw onder te dompelen in 10% formaline-oplossing voor een minimum van 24 uur.
    Opmerking: Weefsels kunnen in 10% formaline blijven voor vele weken vóór verwerking voor histologie. Langdurige opslag van weefsel kan echter invloed op de architectuur en/of de antigenicity leidt tot suboptimale resultaten in downstream analyses.

4. bevestiging van bacteriële kolonisatie in de maag na infectie

  1. Levensvatbare Counting van H. pylori in de maag
    1. Supplement steriele HBA platen met extra antibiotica (200 μg/mL zinkbacitracine en 10 μg/mL naladixic zuur) vóór het uitvoeren van de graven van de kolonie van besmette muis magen16.
    2. Meng maag secties ofwel handmatig, met behulp van autoclaaf polypropyleen micropestles, of met behulp van een mechanische dissociatie-instrument (Zie Tabel van materialen).
    3. Maak dubbele seriële verdunningen (10−1 aan 10−2) van de resulterende maag homogenates in steriele BHI.
      Opmerking: Verdunningen moeten geschieden op basis van de typische bacteriële belasting verkregen voor een bepaalde H. pylori stam voor infectie, evenals de duur van de infectie. Onverdund monsters kunnen ook worden gebruikt.
    4. Vooraf gedroogd HBA platen (zie bovenstaande opmerking) in drie of vier segmenten verdelen. Met behulp van een aanpassing van de Miles en Misra techniek, voeg 10-100 mL elke verdunning op een segment van de agarplaat en verspreid met behulp van steriele kunststof lussen15.
    5. Laat de platen te droog en plaats ze in een omgekeerde positie (deksel zijde naar beneden) in anaeroob gas potten. Als u wilt behouden van vochtigheid in de potten, omvatten een petrischaal met water.
    6. Incubeer potten bij 37 ° C tot kolonies vormen (meestal 4 – 7 dagen).
    7. Opsommen segmenten de betreffende bedrijfsactiviteit die tussen 10 en 100 geïsoleerde kolonies.
      Opmerking: H. pylori koloniën en de H. felis groei op platen kunnen worden onderscheiden van die van andere leden van de lymfkliertest maag microbiota met behulp van urease, katalase en oxidase standaardtests. H. pylori en H. felis zijn positief voor alle drie tests.
    8. Bereken de bacterietelling ladingen als (CFU/g weefsel), met de volgende formule:
      [(Gemiddelde aantal kolonies geteld) × (verdunningsfactor) x (volume verguld)] / (maag gewicht).
  2. Detectie van H. felis infectie in de maag weefsels door de Polymerase Chain Reaction (PCR)
    1. Het uittreksel van DNA van muis magen met behulp van de protocollen van de isolatie van de DNA van het standaard of een commercieel beschikbare kit.
    2. Bepaal de concentratie van de DNA van monsters met behulp van een techniek fluorimetrische kwantificatie (Zie Tabel van materialen).
    3. PCR reacties gericht op een 325-basenparen (bp) fragment van de H. felis urease B gen (ureB)21instellen. Elke reactie moet bevatten: 100 ng van genomic DNA; 1 mM van forward (5'-AAA ATC CAC GAA GAC TGG GG-3') en omgekeerde (5'-CTT TTA TCC AAG TGG TGG CAC ACC-3') inleidingen; 200 mM dNTPs; 0.5 eenheden Taq Polymerase en de juiste hoeveelheid buffer en nuclease-gratis water.
      Opmerking: Dit paar oligonucleotide is ontworpen om te herkennen en te binden aan homologe reeksen in zowel H. pylori en H. felis ureB genen maar wanneer onderworpen aan de voorwaarden van de PCR hieronder, niet de aanwezigen in de ureB genen van Enterohepatische Helicobacter spp.
    4. Uitvoeren van PCR versterking met behulp van de volgende thermische profiel: verwarming bij 94 ° C gedurende 5 minuten, gevolgd door 35 cycli van 94 ° C voor 30 s, 61 ° C voor 30 s en 72 ° C gedurende 1 min, voorheen houden bij 20 ° C.
    5. Het uitvoeren van PCR producten op een agarose gel van 2% voor 30 min. bij 100 V.

5. histologische Analyses van Helicobacter -besmette muis maag secties

  1. Verwerking van maag weefsels
    1. Maag weefsels van formaline en plaats in de schone petrischalen verwijderen.
    2. Snijd maag weefsels met een scalpel in meerdere gelijke grootte longitudinale reepjes (elke 2-3 mm dik) en plaats in gelabelde insluiten cassettes met polstering van schuimstof.
    3. Fix maag weefsels door te embedding cassettes plaatsen in een pot gevuld met 80% ethanol.
      Opmerking: Magen kunnen worden onmiddellijk verwerkt of opgeslagen voor tot 1 – 2 dagen voordat u verdergaat met de volgende stap.
    4. De magen van het proces op een geautomatiseerd weefsel processor, geprogrammeerd met de volgende instellingen:
      Uitdroging: 70% ethanol - 1 cyclus, 20 min; 90% ethanol - 1 cyclus, 20 min; 100% ethanol - 2 cycli, elke 20 min. + 1 cyclus, 40 min + 1 cyclus, 1 h.
      Clearing: xyleen – 2 cycli, elke 30 min + 1 cyclus, 45 min.
      Impregnatie: paraffine bij 60 ° C - 1 cyclus, 45 min + 1 cyclus, 1 h + 1 cyclus, 1.25 h.
    5. Verwijder de verwerkte monsters uit de machine en bewaren bij kamertemperatuur voor het insluiten van paraffine.
  2. Paraffine inbedding van bewerkte maag weefsels
    1. RVS basis mallen plaats in het werkgebied van de insluiten eenheid om te warmen de basis van de mallen.
      Opmerking: Machine te Embedding moet worden ingesteld op 60 ° C voor het insluiten van efficiënte paraffine.
    2. Plaats gewaxt cassettes met de monsters in een warme wax Bad/hete plaat gebied van de insluiting eenheid tot wax volledig oplost.
      Opmerking: Het wordt aanbevolen dat het monster kort na wax lost worden ingebed. Dit zorgt ervoor dat de verharding van weefsels treedt niet op.
    3. Vul de helft van de roestvrij stalen mallen met paraffine. Maag weefsel strips uit de cassettes en zachtjes druk op die de maag door de paraffine aan de basis van de mallen strips warm pincet gebruikt, verwijderen. Zorgvuldig oriënteren weefsel strips in een rechte hoek aan de basis van de mallen, zodat hun gesneden doeleinden zijn naar boven zijn gericht.
      Opmerking: De volgende stappen moeten worden uitgevoerd zo snel mogelijk om te voorkomen dat de verharding en scheiding van de lagen paraffine binnen ingesloten blokken. De juiste stand van maag weefsels is essentieel voor downstream analyses.
    4. Plaats de mallen op de koude plaat van de insluiten eenheid op te lossen van de specimens in plaats en opnieuw oriënteren weefsels indien nodig.
      Opmerking: Als de weefsels worden verdreven en de paraffine begint te verharden, plaatst mallen terug op de hete plaat om te smelten van de was en opnieuw insluiten van weefsels in mallen.
    5. Schakel de helft van de gelabelde insluiten cassettes (die werden gebruikt voor de verwerking van weefsel) aan de bovenkant van de mallen en zachtjes Vul met warme wax. Laat geen paraffine overloopt.
    6. Voorzichtig plaats mallen op een koude plaat en laat afkoelen.
    7. Zodra de paraffine is volledig ingesteld, scheiden de ingesloten blokken van mallen. Schoon overmaat paraffine op cassette hoeken met behulp van een warmhoudplaat (ingesteld boven 80 ° C) of een schraper. Blokken kunnen bij kamertemperatuur worden opgeslagen totdat afdelen wordt uitgevoerd.
  3. Afdelen van weefsels
    1. Chill paraffine-ingebedde weefsel blokken op ijs en warmte van een bad met water gevuld met ultrazuiver water tot 40-45 ° C.
    2. Beveilig het mes in de houder van de microtoom en de klaring hoek tussen 1 – 5° ter voorkoming van contact tussen het blok gezicht en mes facet, videoband paraffineblokken instellen.
      Opmerking: Zorg ervoor blokken zijn duidelijk van overtollige paraffine verworven van het inbedden, aangezien dit de pasvorm van het blok kan belemmeren.
    3. Het blad voor een rechte snede oriënteren in het blok. Voorzichtig snijden 2 tot 3 dunne secties zodat de juiste positionering van het blok.
    4. Snijd de blokken door een dikte van ongeveer 10-30 mm. Deze stap zorgt u ervoor dat een maximale oppervlakte van elke strip weefsel zal worden gesneden.
    5. Gesneden 10 µm secties en gooi die bevatten gaten veroorzaakt door in te korten.
    6. Zorgvuldig secties met pincet halen en ze zweven in het waterbad voor het afvlakken. Gebruik pincet te scheiden van elke sectie.
    7. Secties van de plaats in geladen glas dia's (Zie Tabel van materialen) en waterbad verzamelen.
    8. Dia's rechtop in een rack dia opslaan en plaatsen in een incubator bij 37 ° C. 'S nachts droog secties.
    9. Secties bij kamertemperatuur voor onbepaalde tijd voor latere analyses opslaan.
  4. Haematoxylin en eosine (H & E) verkleuring van de maag weefsels
    1. Dewax dia's met behulp van 3 wasbeurten xyleen voor 5 minuten elk, gevolgd door 3 wasbeurten in 100% ethanol, voor elke 3 min. Garanderen verse oplossingen worden gebruikt in elk stadium.
    2. Spoel de dia's in leidingwater voor 30-60-s.
    3. Verwijder overtollig water door zachtjes te tikken op de onderkant van de dia's op een papieren handdoek. Vlek met gefilterde Haematoxylin voor 3 min. Zorg ervoor dat de afdelingen zijn voldoende bedekt met de oplossing.
    4. Spoel dia's onder stromend leidingwater tot water duidelijk loopt.
    5. Dompel onder dia's in Scott's leidingwater voor 8-10 s. Niet blootstellen aan dia's aan de oplossing meer dan 10 s als dit zal resulteren in donkerder en intense vlekken. -Verkleuring van de secties kan worden weergegeven onder een microscoop. Efficiënte kleuring in dit stadium zal resulteren in een 'baby blue' kleur.
      Opmerking: Bereiden van Scott leidingwater door ontbinding van 2 g natriumwaterstofcarbonaat (NaHCO3) en 20 g magnesiumsulfaat (MgSO4) in gedistilleerd water 1 liter.
    6. Spoel de dia's in leidingwater voor 30-60-s.
    7. Verwijder overtollig water zoals beschreven in stap 3 en vervolgens vlek met gefilterde 1% waterige eosine gedurende 3 minuten.
    8. Spoel dia's onder stromend leidingwater tot water duidelijk loopt.
      Opmerking: Kleuring kan worden beoordeeld met behulp van een lichte Microscoop. Als de vlekken is te donker, kunnen dia's worden gedehydrateerde in 100% ethanol voor langer dan de opgegeven tijd. Als donkere vlekken vereist is, kunnen dia's worden gekleurd met eosine gedurende 1-2 minuten langer, voordat wij overgaan tot de volgende stappen.
    9. Uitdrogen van dia's met behulp van 3 wasbeurten van 100% ethanol voor 30 s elke, gevolgd door 3 wasbeurten xyleen voor elke 2 min. Garanderen verse oplossingen worden gebruikt in elk stadium.
    10. Mount dia's met montage medium. Voeg een druppel van montage medium in het midden van een schone dekglaasje aan voorafgaand aan zachtjes dia te plaatsen op de top met secties beneden zijn gericht.
      Opmerking: Dia's voorafgaand aan dekking uitglijden niet droog.
    11. Plaats van dia's op een vlakke ondergrond en laat lucht droog. Dia's kunnen ook worden gedroogd in een zuurkast te versnellen droogtijd.
  5. Giemsa-kleuring van maag weefsels
    1. Dewax dia's met behulp van 2 wasbeurten van histolene voor 5 minuten elk, gevolgd door 2 wasbeurten van 100% ethanol voor elke 3 min, waarna een definitieve wassen in 70% ethanol voor 3 min. zorgen verse oplossingen worden gebruikt voor elke wasbeurt.
    2. Spoel de dia's in leidingwater voor 30-60-s.
    3. Bereid Giemsa-oplossing door het mengen van 20% Giemsa-kleuring met 80% gedestilleerd water. Dia's met Giemsa-oplossing voor 1 h vlek.
    4. Dia's in 100 mL gedestilleerd water met 3-4 druppels azijnzuur voor 2 – 3 s plaatsen.
      Opmerking: Oplossing moet worden gemengd goed vóór gebruik. In dit stadium moeten dia's worden weergegeven in kleur lichtblauw.
    5. Wassen van dia's in 96% ethanol voor 30 s.
    6. Wassen van de dia's in 3 baden van isopropanol voor 2 minuten elk, gevolgd door 3 baden van histolene voor elke 2 min. Gebruik verse isopropanol en histolene voor elke wassen.
    7. Dekglaasje aan dia's met montage medium, zoals eerder is beschreven.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Dit protocol beschrijft een mondelinge maagsonde techniek om intragastric infectie met H. pylori of H. felis in lymfkliertest Muismodellen (Figuur 1). Na euthanasie, magen zijn verwijderd, gewogen en verdeeld in 2 gelijke helften, bestaande uit het antrum, lichaam en niet-klierweefsel regio's van maag weefsels (Figuur 2). De niet-klierweefsel regio is verwijderd voordat u eventueel analyses uitvoert.

Succesvolle kolo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit protocol beschrijft het gebruik van een in vivo muismodel voor Helicobacter infectie. De kritische stappen van de procedure zijn de: 1) voorbereiding van Helicobacter entmateriaal met levensvatbare en motile bacteriën; 2) levering van het juiste aantal bacteriën aan de muis via intragastric maagsonde; 3) detectie van bacteriële infectie door het tellen van de kolonie en/of PCR; en 4) verwerking van weefsels van de maag om de beoordeling van histopathologisch onderzoek in besmet magen. Verde...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs bedank mevrouw A. De Paoli en Ms. Georgie Wray-McCann voor technische bijstand. De auteurs erkennen gebruik van de faciliteiten en technische bijstand van Monash histologie Platform, afdeling Anatomie en ontwikkelingsbiologie, Monash University. Het laboratorium wordt ondersteund door financiële middelen van de nationale gezondheids- en medische onderzoek Raad (NHMRC) naar RLF (APP1079930, APP1107930). RLF wordt ondersteund door een Senior Research Fellowship van de NHMRC (APP1079904). KD en MC worden beide ondersteund door Monash afgestudeerde beurzen. KD wordt ook ondersteund door het centrum voor aangeboren immuniteit en Infectious ziekten, Hudson Institute of Medical Research, terwijl MC een postdoctorale International-beurs van de faculteit geneeskunde, verpleegkunde en gezondheidswetenschappen, Monash University heeft. Onderzoek op de Hudson Institute of Medical Research wordt ondersteund door de Victoriaanse regering operationele infrastructuur Support Program.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Bacteriologische reagentia
Oxoid Blood Agar Base No.2Thermo Fischer ScientificCM0271BLos op in gedeïoniseerd water voorafgaand aan sterilisatie
Premium Defibrinated Horse bloodAustralian Ethical BiologicalsPDHB100
Bacto Brain Heart Infusion BrothBD Bioscience237500Los op in gedeïoniseerd water voorafgaand aan sterilisatie
CampyGen gas packsThermo Fischer ScientificCN0035A/CN0025A
Histologische reagentia
Formaline, neutraal gebufferd, 10%Sigma AldrichHT501128
Absoluut alcohol, 100% GedenatureerdChemSupplyAL048-20L-P
Isopropanol (2-propanol)Merck100995
Xyleen (zwavelvrij)ChemSupplyXT003-20L
Mayer's HaematoxylineAmber ScientificMH-1LFilter voor gebruik
Eosine, waterige kleurstofAmber ScientificEOCA-1LFilter voor gebruik
Wright-Giemsa Stain, gemodificeerdSigma AldrichWG80-2.5LVerdun voor gebruik (20% Giemsa, 80% gedeïoniseerd water)
HistoleneGrale Scientific11031/5
DPX montagemediumVWR1.00579.0500
Moleculairbiologische reagentia
Qubit dsDNA BR Assay KitThermo Fischer ScientificQ32850
OligonucleotidenSigma AldrichDe annealingtemperatuur van de ureB primers gebruikt in dit onderzoek is 61 °C
GoTaq Flexi DNA PolymerasePromegaM8291Kit bevat 10x PCR buffer en Magnesium Chloride
dNTP'sBiolineBIO-39028Verdun tot 10 mM in steriel nucleasevrij water voor gebruik
Moleculair Grad AgaroseBiolineBIO-41025
NatriumwaterstofcarbonaatUnivar (Ajax Fine Chemicals)A475-500G
Magnesium Sulfaat HeptahydraatChem-SupplyMA048-500G
Antibiotica
VancomycineSigma AldrichV2002-1GLos op in gedeïoniseerd water
Polymyxine BSigma AldrichP4932-5MULos op in gedeïoniseerd water
Trimethoprim (≥98% HPLC)Sigma AldrichT7883Los op in 100% (absoluut) Ethanol
AmfotericineAmresco (Astral Scientific)E437-100MGLos op in gedeïoniseerd water
Bacitracine van Bacillus licheniformisSigma AldrichB0125Los op in gedeïoniseerd water
NaladixinezuurSigma AldrichN8878Los op in gedeïoniseerd water
Overige reagentia
Methoxyfluraan (Pentrhox)Medical Developments InternationalNiet van toepassing
ParaffinewasParaplast Plus, Leica Biosystems39601006
Apparatuur en plasticwerk
Oxoid Anaerobic JarsThermo Fischer ScientificHP0011/HP0031
COPAN Pasteur PipettesInterpath Services200CS01
Eppendorf 5810R centrifugeVerzamel bacteriële pellets door centrifugatie bij 2.200 rpm gedurende 10 minuten bij 4 °C
23 g precision glide naaldBD Bioscience301805
Parafilm MBemis, VWRPM996
Portex fine bore polyethyleen buisSmiths Medical800/100/200
Kunststof voedingskathetersInstech  LaboratoriesFTP20-30
1 mL tuberculine luer slip wegwerpspuitenBD Bioscience302100
Eppendorf micropestle voor 1,2 - 2 mL buisjesSigma AldrichZ317314Autoclaveerbare polypropyleen pestels gebruikt voor maaghomogenisatie
GentleMACs DissociatorMiltenyi Biotec130-093-235Gebruik een vooraf ingesteld gentleMACS Programma voor muismagensweefsel
M Tubes (oranje dop)Miltenyi Biotec30-093-236
Qubit FluorometerThermo Fischer ScientificQ33216
Steriele plastic loopLabServLBSLP7202
Cold Plate, Leica EG1160 Embedding SystemLeica BiosystemsNiet van toepassing
Tissue-Tek Base Mould System, Base Mold 38 x 25 x 6Sakura, Alphen aan den Rijn4124
Tissue-Tek III Uni-Casette SystemSakura, Alphen aan den Rijn4170
Microtoom, Leica RM2235Leica Biosystems
Gelaaide SuperFrost Plus glazen slidesMenzel Glaser, Thermo Fischer Scientific4951PLUS4

Referenties

  1. Goh, K. L., Chan, W. K., Shiota, S., Yamaoka, Y. Epidemiology of Helicobacter pylori infection and public health implications. Helicobacter. 16, Suppl 1. 1-9 (2011).
  2. Montecucco, C., Rappuoli, R. Living dangerously: how Helicobacter pylori survives in the human stomach. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (6), 457-466 (2001).
  3. Akopyants, N. S., et al. Analyses of the cag pathogenicity island of Helicobacter pylori. Molecular Microbiology. 28 (1), 37-53 (1998).
  4. Censini, S., et al. cag, a pathogenicity island of Helicobacter pylori, encodes type I-specific and disease-associated virulence factors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (25), 14648-14653 (1996).
  5. Peek, R. M., Fiske, C., Wilson, K. T. Role of innate immunity in Helicobacter pylori-induced gastric malignancy. Physiological Reviews. 90 (3), 831-858 (2010).
  6. O'Rourke, J. L., Lee, A. Animal models of Helicobacter pylori infection and disease. Microbes and Infection. 5 (8), 741-748 (2003).
  7. Sakagami, T., et al. Atrophic gastric changes in both Helicobacter felis and Helicobacter pylori infected mice are host dependent and separate from antral gastritis. Gut. 39 (5), 639-648 (1996).
  8. Correa, P. Helicobacter pylori and gastric carcinogenesis. The American Journal of Surgical Pathology. 19, S37-S43 (1995).
  9. Enno, A., et al. MALToma-like lesions in the murine gastric mucosa after long-term infection with Helicobacter felis. A mouse model of Helicobacter pylori-induced gastric lymphoma. The American Journal of Pathology. 147 (1), 217-222 (1995).
  10. Lee, A., et al. A standardized mouse model of Helicobacter pylori infection: introducing the Sydney strain. Gastroenterology. 112 (4), 1386-1397 (1997).
  11. Crabtree, J. E., Ferrero, R. L., Kusters, J. G. The mouse colonizing Helicobacter pylori strain SS1 may lack a functional cag pathogenicity island. Helicobacter. 7 (2), 139-140 (2002).
  12. Israel, D. A., et al. Helicobacter pylori strain-specific differences in genetic content, identified by microarray, influence host inflammatory responses. Journal of Clinical Investigation. 107 (5), 611-620 (2001).
  13. Fox, J. G., et al. Helicobacter pylori-induced gastritis in the domestic cat. Infection and Immunity. 63 (7), 2674-2681 (1995).
  14. Lee, A., Hazell, S. L., O'Rourke, J., Kouprach, S. Isolation of a spiral-shaped bacterium from the cat stomach. Infection and Immunity. 56 (11), 2843-2850 (1988).
  15. Ferrero, R. L., Wilson, J. E., Sutton, P. Mouse models of Helicobacter-induced gastric cancer: use of cocarcinogens. Methods in Molecular Biology. 921, 157-173 (2012).
  16. Ferrero, R. L., Thiberge, J. M., Huerre, M., Labigne, A. Immune responses of specific-pathogen-free mice to chronic Helicobacter pylori (strain SS1) infection. Infection and Immunity. 66 (4), 1349-1355 (1998).
  17. Blanchard, T. G., Nedrud, J. G. Laboratory maintenance of Helicobacter species. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 8, Unit8B 1 (2012).
  18. Kim, J. S., Chang, J. H., Chung, S. I., Yum, J. S. Importance of the host genetic background on immune responses to Helicobacter pylori infection and therapeutic vaccine efficacy. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 31 (1), 41-46 (2001).
  19. Nedrud, J. G., et al. Lack of genetic influence on the innate inflammatory response to helicobacter infection of the gastric mucosa. Frontiers in Immunology. 3, 181(2012).
  20. Cai, X., et al. Helicobacter felis eradication restores normal architecture and inhibits gastric cancer progression in C57BL/6 mice. Gastroenterology. 128 (7), 1937-1952 (2005).
  21. Ferrero, R. L., Labigne, A. Cloning, expression and sequencing of Helicobacter felis urease genes. Molecular Microbiology. 9 (2), 323-333 (1993).
  22. Stevenson, T. H., Castillo, A., Lucia, L. M., Acuff, G. R. Growth of Helicobacter pylori in various liquid and plating media. Letters in Applied Microbiology. 30 (3), 192-196 (2000).
  23. Uotani, T., Graham, D. Y. Diagnosis of Helicobacter pylori using the rapid urease test. Annals of Translational Medicine. 3 (1), 9(2015).
  24. Riley, L. K., Franklin, C. L., Hook, R. R., Besch-Williford, C. Identification of murine helicobacters by PCR and restriction enzyme analyses. Journal of Clinical Microbiology. 34 (4), 942-946 (1996).
  25. Chaouche-Drider, N., et al. A commensal Helicobacter sp. of the rodent intestinal flora activates TLR2 and NOD1 responses in epithelial cells. PLoS One. 4 (4), e5396(2009).
  26. Fox, J. G. Helicobacter bilis: bacterial provocateur orchestrates host immune responses to commensal flora in a model of inflammatory bowel disease. Gut. 56 (7), 898-900 (2007).
  27. McGee, D. J., et al. Cholesterol enhances Helicobacter pylori resistance to antibiotics and LL-37. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (6), 2897-2904 (2011).
  28. Viala, J., et al. Nod1 responds to peptidoglycan delivered by the Helicobacter pylori cag pathogenicity island. Nature Immunology. 5 (11), 1166-1174 (2004).
  29. Kong, L., et al. A sensitive and specific PCR method to detect Helicobacter felis in a conventional mouse model. Clinical and Vaccine Immunology. 3 (1), 73-78 (1996).
  30. Ng, G., Every, A., McGuckin, M., Sutton, P. Increased Helicobacter felis colonization in male 129/Sv mice fails to suppress gastritis. Gut Microbes. 2 (6), 358-360 (2011).
  31. Ferrero, R. L., Ave, P., Radcliff, F. J., Labigne, A., Huerre, M. R. Outbred mice with long-term Helicobacter felis infection develop both gastric lymphoid tissue and glandular hyperplastic lesions. The Journal of Pathology. 191 (3), 333-340 (2000).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Helicobacter pylorimaaginfectieintragastrische gavagebacteriële kolonisatiehistologische verwerkingkweek van levensvatbare cellenpolymeraseketenreactieWarthin-Starry-kleuringspecifiek pathogeenvrij
Muismodellen van Helicobacter infectie en maag pathologieën
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.