Methodenartikel

Native chromatine Immunoprecipitation met behulp van lymfkliertest Brain Tumor Neurospheres

DOI:

10.3791/57016

⸱

29 januari 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cell and Developmental Biology, University of Michigan Medical School, 2Department of Neurosurgery, University of Michigan Medical School, 3Cancer Research Summer Internship Program (CARSIP), Cancer Biology Program, University of Michigan Medical School, 4Department of Biology, University of Puerto Rico-Río Piedras Campus

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Epigenetische mechanismen worden regelmatig gewijzigd in glioma. Chromatine immunoprecipitation kan worden gebruikt om de gevolgen van genetische wijzigingen in glioma die voortvloeien uit wijzigingen in histone modificaties tot regeling van de chromatine structuur en gene transcriptie. Dit protocol beschrijft een native chromatine immunoprecipitation op lymfkliertest hersenen tumor neurospheres.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Epigenetische aanpassingen kunnen worden betrokken bij de ontwikkeling en de progressie van glioma. Wijzigingen in methylation en acetylation voor initiatiefnemers en regelgevende gebieden oncogenen en tumor suppressors kunnen leiden tot wijzigingen in genexpressie en spelen een belangrijke rol in de pathogenese van hersentumoren. Native chromatine immunoprecipitation (ChIP) is een populaire techniek waarmee de opsporing van wijzigingen of andere eiwitten strak gebonden aan DNA. In tegenstelling tot de kruiselings gekoppelde ChIP, in native-ChIP, worden de cellen niet behandeld met formaldehyde covalent eiwit te koppelen aan DNA. Dit is voordelig omdat soms crosslinking eiwitten die alleen Transient interactie met DNA en hebben geen functionele betekenis in genregulatie kan oplossen. Bovendien zijn antilichamen over het algemeen ingebracht nietgefixeerde peptiden. Daarom is antilichamenspecificiteit verhoogd in native ChIP. Het is echter belangrijk om in gedachten houden dat inheemse ChIP alleen geldt voor het bestuderen van histones of andere eiwitten die strak aan het DNA binden. Dit protocol beschrijft de inheemse chromatine immunoprecipitation op lymfkliertest hersenen tumor neurospheres.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Epigenetische gebeurtenissen zijn frequent in de gliomen en waarschijnlijk een belangrijke rol spelen in de pathogenese van de tumor. Inderdaad, in pediatrische hoogwaardige glioma, mutaties in de genen coderend voor Histon varianten H3.3 en H3.1 komen vaak voor1. De mutaties beïnvloeden histone modificaties en hebben grote gevolgen epigenetische hebben2,3. In de adolescente tot volwassen spectrum optreden periodieke mutaties in isocitrate dehydrogenase gen 1/2 (IDH1/2), een mutatie die α-KG afhankelijk histone en DNA de-methylasaes remt, en genetische wijzigingen in andere regelgevers van de chromatine zoals ATRX en DAXX 4. Daarom is het van cruciaal belang om te bestuderen hoe mutaties die invloed hebben op de regelgevers van de epigenetische structuur van de chromatine en regelgevende histone modificaties, die op hun beurt een dramatische impact van de tumorcellen transcriptome hebben veranderen.

Chromatine immunoprecipitation (ChIP) is een krachtig hulpmiddel gebruikt voor het evalueren van het effect van de epigenetische aanpassingen in de genoom5,6,7. In native-ChIP, chromatine wordt verteerd met micrococcal nuclease (MNase), immunoprecipitated met behulp van een antilichaam tegen het eiwit van belang, aan de orde gesteld en vervolgens DNA wordt gezuiverd van de immunoprecipitated chromatine complexe6. Cellen zijn niet tijdens de procedure vast zodat deze techniek is alleen van toepassing voor de studie van eiwitten die nauw met DNA6 samenwerken. Het ontbreken van de cross-linking helpt antilichamenspecificiteit aangezien antilichamen zijn gewoonlijk verhoogd tegen nietgefixeerde peptiden of eiwitten7. Bovendien, aangezien er geen cross-linking stap, vermindert dit de kans op vaststelling van voorbijgaande eiwit-DNA interacties die aspecifieke en niet regelgevende7,8. ChIP kan worden gebruikt voor identificatie van de verrijking van Histon modificaties in een specifiek gebied van het genoom. Hier, detail we een protocol voor het uitvoeren van inheemse ChIP in neurospheres (NS) gegenereerd op basis van genetisch gemanipuleerde Muismodellen van glioma.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de Universiteit van Michigan.

1. generatie van hersentumor NS en voorwaarden te kweken.

  1. Neurale stamcellen Medium (NSC) met Dulbecco van bewerkt Eagle Medium/F12B27 toeslag (1 x), N2 toeslag (1 x), en een antimicrobiële reagens te bereiden. NSC medium een aanvulling vormen op de dag van gebruik met menselijke recombinante endothelial groei factor (EGF) en basic-fibroblast groeifactor (FGF) op een eindconcentratie van 20 ng/mL elke.
  2. De hersentumor in muis met behulp van de schone slaapster transposon systeem waarin plasmiden codering oncogenen of shRNA gericht op tumor suppressors wordt geïnjecteerd in de laterale ventrikels van pasgeborenen voor het genereren van spontane hersenen tumoren9induceren. Selecteer een muis met een grote tumor, die wordt bevestigd met bioluminescentie beeldvorming.
    Opmerking: Meer gedetailleerde informatie over de Sleeping Beauty Transposon systeem en plasmide constructies die gebruikt kan worden gevonden in Calinescu et al. 9.
    1. Naar het image van de muizen, injecteren 100 µL van 30 mg/mL luciferine oplossing intraperitoneally met behulp van een naald van 26 meter.
    2. 5 min na injectie van luciferine, anesthetize het dier een verdoving kamer met zuurstof/Isofluraan stroom ingesteld op 2% Isofluraan.
    3. Wanneer de dieren zijn verdoofd (meestal 2-3 min), plaats van de dieren in de Bioluminescentie zaal met zuurstof Isofluraan ingesteld op 2% Isofluraan. Als de dieren onder verdoving langer dan 5 min, gebruik maken van een oogheelkundige zalf om te voorkomen dat droogte terwijl onder verdoving.
    4. Afbeelding van de muizen met behulp van een in vivo optisch imaging systeem met de volgende parameters: automatische belichting, grote weggooien en diafragma f = 1. De parameter om het te overwegen een grote tumor is een bioluminescentie > 106 fotonen/s/cm2/sr.
  3. Euthanaseren van de muis met een overdosis van Isofluraan inademing verdoving in een gesloten kamer, Controleer door teen snuifje dat het dier wordt verdoofd, en het onthoofden van de muis.
  4. Extract van de hersenen en het ontleden, zoals eerder is beschreven in Calinescu et al. 9.
  5. Plaats de hersenen in een 10 cm petrischaal. Als de tumor-geïnduceerde spreekt een fluorescente proteïne, gebruik een TL ontrafeling van Microscoop ingesteld op het juiste TL kanaal en 0.3 X vergroting, anders identificeren tumor massa door de verschillen in weefsel kleur en textuur. Gebruik de scalpel en pincet te scheiden van de tumor weefsel van de normale hersenen.
  6. Mince de tumor in kleine stukjes in de petrischaal. Plaats de ontleed tumor in een 1,5 mL tube met 300 µL van het NSC-medium.
  7. Gebruik een wegwerp plastic pellet stamper die bij de muren van een conische microcentrifuge buis past te voorzichtig het homogeniseren van de tumor. Voeg 1 mL van cel detachement medium toe en Incubeer het monster gedurende 5 minuten bij 37 ° C.
    Opmerking: Het gebruik van een stamper kan sommige cellen doden. Als de lezer wil maximaliseren van de levensvatbaarheid van de cellen, kan het gebruik van een stamper achterwege blijven.
  8. Passeren van de celsuspensie van stap 1.7 door een 70 µm cel zeef en wassen van de zeef met 25 mL van NSC medium.
  9. Centrifugeer de schorsing bij 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, decanteren het supernatant en resuspendeer de pellet in 6 mL van NSC medium.
  10. Plaat van de tumor celsuspensie uit stap 1.9 in een maatkolf van T-25 cultuur en cultuur het bij 37 ° C in een broedstoof weefselkweek met een sfeer van 95% lucht en 5% CO2. Meestal na 3 dagen, zal er een mengsel van sommige dode cellen, zelfklevend cellen en sommige cellen vormen van NS die in het medium zweven.
  11. De celsuspensie Breng in een conische tube van 15 mL, verzamelen alleen de cellen bevat die zinken naar de bodem met behulp van een micropipet en hen opnieuw plaat op een T-75 weefselkweek kolf.
  12. Het handhaven van de cellen bij relatief hoge dichtheid (1-3 X 106 cellen in een T-25). Passage van de cellen die confluente.
    Opmerking: Confluentie wordt bepaald door de grootte van de bollen. Zwarte centra van grote bollen betekenen dat er zijn dode cellen in het midden en aan te geven dat de cellen onmiddellijk moeten worden gepasseerd.
  13. Toevoegen van de groeifactoren (EGF en basic-FGF; 20 ng/mL elk) elke drie dagen. Het medium wijzigen wanneer de cellen niet heuvels en de middellange draait licht oranje.
  14. Als u wilt wijzigen het medium, verzamelen de oud medium en Centrifugeer het bij 300 x g bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten en resuspendeer de pellet cel in NSC medium aangevuld met EGF en FGF op de concentratie in stap 1.1 hebt opgegeven.
    Opmerking: Als de bollen staan midden-tot hoge confluentie, maar niet klaar om te worden gepasseerd (bol grootte is klein met een diameter van < 100 µm), dan de pellet kan worden gesplitst in twee maatkolven.
  15. Om de passage van de cellen, centrifugeren van de cellen bij 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, de bovendrijvende vloeistof decanteren en Incubeer de cellen in cel detachement medium voor 5 minuten bij 37 ° C.
    1. Voeg 5 mL van evenwichtige zout oplossing verdund detachement medium samen en Centrifugeer het bij 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    2. De bovendrijvende vloeistof decanteren, resuspendeer de pellet cel in 18 mL van NSC medium en de schorsing gelijkelijk verdelen in drie T-25 kolven.
  16. Als u wilt blokkeren de aliquots van cellen, distantiëren van de cellen zoals in stap 1.15 en bevriezen van de cellen in 1 mL aliquots van 90% foetale runderserum met 10% dimethylsulfoxide. Langzaam afkoelen van de cellen door het plaatsen van de cellen op het ijs gedurende 10 minuten, dan houden van de cellen-20 ° C gedurende 30 minuten, en -80 ° C voor 1 dag. De volgende dag, worden de cellen overbrengen in een opslagcontainer vloeibare stikstof.

2. eigen ChIP

  1. Chromatine voorbereiding
    1. Cultuur na het maken van voorraad van afgeleide NS, NS in een T-75 in 15 mL van NSC medium bij 37 ° C in een broedstoof weefselkweek met een sfeer van 95% lucht en 5% CO2 totdat NS confluente geworden. Één confluente T-75 plaat zal 3-5 X 106 cellen opleveren.
    2. Wanneer de cellen confluente worden, NS Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min, giet het supernatant en voeg 1 mL van cel dissociatie medium. Incubeer de cellen bij 37 ° C gedurende 5 min. Voeg 5 mL van medium en de cellen met behulp van een hemocytometer10tellen.
      Opmerking: 1 x 106 cellen zijn per immunoprecipitation (IP) reactie nodig. Let erop dat een vooraf immuun serum of IgG besturingselement ook opgenomen11moet zijn.
    3. Centrifugeer de NS in een tube van de microcentrifuge van de 1,5 mL bij 300 x g gedurende 5 min, giet het supernatant en resuspendeer de pellet van de NS met 1 mL van evenwichtige zoutoplossing en spoel de suspensie laag eiwitgehalte bindende 1,5 mL microcentrifuge buizen.
    4. Centrifuge NS bij 300 x g voor 5 min, giet het supernatant en resuspendeer de pellet cel in 95 µL van spijsvertering buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM CaCl2, 0,2% polyethyleenglycol octylphenyl ether) per 1 x 106 cellen aangevuld met protease remmer cocktail in een hoge concentratie (1:100). Onmiddellijk Pipetteer de cellen op en neer ter voorkoming van samendoen en voorkomen dat er bubbels.
    5. Resuspendeer MNase in 50% glycerol te maken van 1 mg/mL oplossing (1,15 eenheden/µL, opgeslagen bij-20 ° C), die zal worden verwezen als "1 x" voorraad. Maak een "0.1 x" voorraad verwerkingsopties in op een tweede 1:9-verdunning met 50% glycerol (bv., 900 µL van "1 x" MNase en 100 µL 50% glycerol) en opslaan bij-20 ° C.
    6. Meng 5 µL van "0.1 x" MNase en 145 µL van spijsvertering buffer. Houd het enzym op ijs al the times. Voeg 5 µL van verdunde MNase in spijsvertering buffer per 1 x 106 cellen. Flick de buis te mengen en de buis in 37 ° C blok voor precies 12 min. proces de monsters één tegelijk om een nauwkeurige incubatietijd van 12 min.
    7. Voeg 10 µL van 10 x MNase stoppen Buffer (110 mM Tris-HCl, pH 8.0, 55 mM EDTA) per 1 x 106 cellen. Monsters moeten worden bewaard op ijs vanaf dit moment.
    8. Voeg 110 µL "2 x RIPA buffer" (280 mM NaCl, 1,8% polyethyleenglycol octylphenyl ether 0,2% natrium dodecyl sulfaat (SDS), 0,2% Na-deoxycholate, 5 mM ethyleen glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N', N'-Dinatriumethyleendiaminetetra-azijnzuuroplossing (EGTA); opgeslagen bij 4 ° C) aangevuld met proteaseinhibitor cocktail in hoge concentraties (1:100) per 1 x 106 cellen. Flick de buis te mengen.
    9. Centrifugeer de buizen gedurende 15 min. in een microfuge bij 4 ° C en 1700 x g. het supernatant overbrengen in een nieuwe reguliere 1,5 mL microcentrifuge buizen (laag eiwitgehalte bindende microcentrifuge buizen zijn niet meer nodig) en bewaar ze op ijs. Gooi de pellet.
  2. Immunoprecipitation (IP)
    1. Meng EiwitA en eiwit G magnetische kralen in een 1:1 verhouding. Voor elke IP, 25 µL van parels te bereiden.
    2. Wassen van de kralen door toevoeging van 1 mL van de buffer RIPA (10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA, 140 mM NaCl, 1% polyethyleenglycol octylphenyl ether, 0,1% SDS, 0,1% nb-deoxycholate; opgeslagen bij 4 ° C) aangevuld met proteaseinhibitors bij lage concentratie (1:1000).
    3. Gebruik een magneet om parels te scheiden van de oplossing van het wassen en decanteren van de Supermarket-oplossing (ongeveer 1 minuut). De wassen stap tweemaal uitvoeren.
    4. Resuspendeer de kralen op het oorspronkelijke volume met behulp van de buffer RIPA aangevuld met proteaseinhibitors (1:1000).
    5. Indien nodig, verdunde Reserve de chromatine met behulp van de buffer RIPA aangevuld met proteaseinhibitors (1:1000), zodat elk IP een volume van 100-200 heeft µL. 10% van het volume per IP-adres van de chromatine gebruikt voor de input.
      Opmerking: bijvoorbeeld als 200 µL worden gebruikt per IP, 20 µL van de verdunde chromatine moeten worden gereserveerd voor de input. Voor een totaal van vier IPs, moet totale chromatine volume worden verdund tot 820 µL.
    6. De ingang voor te bereiden. Voeg 100 µL van TE buffer (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA) aangevuld met proteïnase K (0,5 mg/mL) aan op de ingang en de input bij 55 ° C gedurende 1 uur uit te broeden.
      Opmerking: De stappen 2.2.6-2.2.7 kan worden uitgevoerd samen met stappen 2.3.4 en 2.4.1.
    7. Zuiveren van de invoer met behulp van een PCR zuivering kit na instructies van de fabrikant en elueer in 50 µL van elutie buffer geleverd in kit.
    8. De concentratie van de invoer met behulp van een microvolume spectrofotometer meten en de resultaten daarvan vastleggen in een notitieblok. Lege met elutie buffer van kit.
      Opmerking: In de muis neurospheres gebruikten we ongeveer 6 µg van DNA voor elk IP.
    9. Input uitvoeren op een 1% gel of laden 1 µL op een DNA-Bioanalyzer met behulp van de standaard instellingen. Bewaar de rest voor gebruik als input in downstream toepassingen.
    10. Voeg 10 µL van gewassen EiwitA & G magnetische kralen voor elke IP en IP Incubeer gedurende 1 uur bij 4 ° C.
      Opmerking: Voeg bijvoorbeeld 30 µL van EiwitA & G magnetische kralen voor drie IP-adressen.
    11. Leg de monsters op een magneet en laat kralen om te scheiden. Verdeel de chromatine door het vooraf bepaalde bedrag over te brengen in een nieuwe 1,5 mL-buis.
    12. Toevoegen van het antilichaam en wikkel de doppen met kunststof paraffine film om verdamping. Incubeer de monsters 's nachts bij 4 ° C met rotatie bij 20 omwentelingen per minuut.
      Opmerking: Concentratie moet worden bepaald empirisch na aanbevelingen van de fabrikant.
    13. De volgende dag, draaien de buizen met behulp van een mini centrifuge bij kamertemperatuur, 2000 x g, voor 10 s. Dan 10 µL van kralen toevoegen aan elk IP en IP Incubeer gedurende 3 uur bij 4 ° C met rotatie bij 20 omwentelingen per minuut.
  3. IP-wast en vertering van de eiwitten
    1. Voeg 150 µL van RIPA buffer aangevuld met proteaseinhibitors bij lage concentratie (1:1000) naar elk IP en incubeer IP bij 4 ° C met rotatie bij 20 omwentelingen per minuut gedurende 5 minuten plaats het monster op een magnetische standaard en laat van de magnetische kralen om te scheiden. Gebruik een pipet wilt verwijderen van de bovendrijvende substantie. Herhaal dit vijf tep-wast.
    2. Voeg 150 µL van LiCl buffer (250 mM LiCl, 10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA, 0,5% NP-40, 0,5% NB-deoxycholate; bewaren bij 4 ° C) aangevuld met proteaseinhibitors bij lage concentratie (1:1000) naar elk IP en IP Incubeer bij 4 ° C met rotatie bij 20 omwentelingen per minuut gedurende 5 minuten plaats het monster op een magnetische staan en toestaan van magnetische kralen om te scheiden. Gebruik een pipet wilt verwijderen van de bovendrijvende substantie.
    3. Voeg 150 µL van koude TE (geen proteaseinhibitors) en Incubeer het monster bij 4 ° C met rotatie bij 20 omwentelingen per minuut gedurende 5 minuten plaats het monster op een magnetische standaard en laat van magnetische kralen om te scheiden. Gebruik een pipet wilt verwijderen van de bovendrijvende substantie.
    4. Na de definitieve wassen stap, resuspendeer de steekproef in 100 µL TE buffer aangevuld met proteïnase K (0,5 mg/mL) en Incubeer het monster bij 55 ° C gedurende 1 uur.
  4. DNA zuivering en ChIP kwantitatieve Real-Time PCR (qPCR)
    1. Zuiveren van immunoprecipitated DNA met behulp van een PCR zuivering kit. Na toevoeging van DNA-bindende buffer uit de kit aan elk monster, plaats de buis op een magneet en wacht totdat het supernatant magnetische kralen statistische, vervolgens overbrengen naar de kolom opruimen. Volg de instructies van de fabrikant en elueer in 50 µL van elutie buffer geleverd in kit.
    2. Om te controleren als het IP succesvol is, een qPCR uit te voeren. Idealiter moeten de inleidingen voor positieve en negatieve controle regio's worden ontworpen.
      Opmerking: bijvoorbeeld, voor een IP uitgevoerd met H3K4me3 en H3K27me3, de volgende monsters moeten worden uitgevoerd op qPCR: H3K4me3, H3K27me3 en IgG ChIP DNA, invoerwaarden DNA en een sjabloon oncontroleerbaar (NTC) gebruikend inleidingen voor regio's worden verrijkt met H3K4me3 (positieve controle) en regio's worden verrijkt met H3K4me3 (negatieve controle); ook voor H3K27me3.
    3. Volg standaardprotocollen voor het uitvoeren van qPCR12. Kortom, een qPCR met SYBR groen master mix, 0,5 µL van 10 µM werken concentratie van elke voorwaartse en omgekeerde primer en 2 µL van ChIP of input DNA uitvoeren Lees platen met behulp van een Real Time PCR-systeem. Primer sequenties zijn opgenomen in tabel 2. De Gapdh primer sequenties van twee exemplaren Hwang et al. gebruikte13waren.
    4. ChIP gegevens analyseren ten opzichte van de invoer, dat wil zeggen, procent input methode (% IP)14. Bereken het percentage invoeren met behulp van de volgende formules:
      Aangepast input = gemiddelde ct (input)-log2(DF)
      waar DF is de verdunningsfactor van de startende input en
      DF = totaalvolume van IP / volume van input
      % IP = 100 × 2 ^ (aangepast input - Ct (IP))
      Ct is waar de drempel-factor.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een schematische weergave van NS gegenereerd op basis van een hersentumor waar de tumor hersencellen Katushka positieve zijn tumor wordt gepresenteerd in Figuur 1. Figuur 2 is een schematische weergave van de hele techniek van de ChIP. Figuur 3 toont de representatieve resultaten van de chromatine van hersentumor NS verteerd met MNase voor 12 min, opbrengst van een meerderheid van mono, di- en tri-nu...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het hier gepresenteerde protocol kan de gebruiker voor het uitvoeren van de native ChIP op NS afgeleid van genetisch gemanipuleerde hersentumoren. In tegenstelling tot dwarsbinding ChIP, is dit protocol beperkt voor de studie van eiwitten waarmee strak gekoppeld aan DNA-6. Het aantal cellen die worden gebruikt als noodzakelijk kan worden gewijzigd en het protocol kan worden opgeschaald. We gebruikten 1 X 106 cellen per IP, inheemse ChIP kan echter ook worden uitgevoerd met zo weinig als...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gesteund door de nationale instituten van gezondheid/National Institute of Neurological Disorders & beroerte (NIH/NINDS) subsidies R37-NS094804, R01-NS074387, R21-NS091555 naar M.G.C.; NIH/NINDS verleent R01-NS076991, R01-NS082311 en R01-NS096756 P.R.L.; NIH/NINDS R01-EB022563; de Afdeling Neurochirurgie; Leahs Happy Hearts, en Tsjaad hoewel Stichting M.G.C. en P.R.L. RNA biogeneeskunde Grant F046166 aan M.G.C. F.M.M. wordt ondersteund door een F31 NIH/NINDS-F31NS103500. R.I.Z.-V. wordt ondersteund door de NIH / NIGMS verlenen 5T34GM007821-37.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Agilent 2100 BioanalyzerAgilentG2946-90004bioanalyzer
AccuSpin Micro 17R, refrigeratedFisher Scientific13-100-676
C57BL/6TaconicB6-fC57BL/6 muis
Calcium ChlorideAldrich22350-6bufferreagens
D-Luciferin, Potassium SaltGoldbioLuckK-1g
DiaMag1.5 magnetic rackDiagenodeB04000003voor magnetische parelwasbeurten
DiaMag Rotator EUDiagenodeB05000001rotator
DMEM/F-12Gibco11330-057NSC component
Dynabeads Protein AThermo Fisher Scientific10001Dprotein A magnetische pareltjes
Dynabeads Protein GThermo Fisher Scientific10003Dprotein G magnetische pareltjes
EGFPeproTechAF-100-15bereid 20 μg/mL stock in 0,1% BSA en verdeel in aliquoten.
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)SigmaE-4884bufferreagens
ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid) (EGTA)SigmaE-4378bufferreagens
Fast SYBR Green Master MixApplied Biosystems4385612qPCR reagent
Fetal Bovine SerumGibco10437028voor het invriezen van cellen
FGFPeproTech100-18bBereid 20 μg/mL stock in 0,1% BSA en verdeel in aliquoten.
ForcepsFine Science Tools11008-13voor dissectie van tumor
Glycerol, MB GradeEMD- Millipore356352
H3K4me3AbcamAb8580
H3K27me3Millipore07-449
HBSSGibco14175-103evenwichtig zout oplossing
FlurisoVETone501017inhalatieanestheticum
Ivis SpectrumPerkin-Elmer124262in vivo optisch beeldvormingssysteem
HyqtaseHyClonSV3003001celdetacheringsmedium
Lithium ChlorideSigmaL8895bufferreagens
Low binding microtubesCorning CostarCLS3207lage eiwitbinding microcentrifugebuisje
Microcentrifuge tubeFisher21-402-903gewone microcentrifugebuisje
Micrococcal NucleaseThermo Fisher Scientific, Affymetrix70196Yelke batch kan verschillen; koop voldoende hoeveelheid voor experimenten en verdeel in aliquoten.
N2Gibco17502-048NSC component
Normal Rabbit IgGMillipore12-372
NormocinInvivogenNOL-36-063antimicrobiële stof, gebruik bij 0,1 mg/mL.
NP-40 (Igepal CA-630)Sigma18896-50MLbufferreagens
Kimble Kontes Pellet PestleFisher ScientificK749515-0000
Protease Inhibitor CocktailSigma-AldrichP8340verdeel in aliquoten en bewaar bij -20 °C.
Protinase KSigma-AldrichP2308maak 10 mg/mL stock in water; verdeel in aliquoten en bewaar bij -20 °C.
QIAquick PCR Purification KitQiagen28104DNA zuiveringskit
ScalpelFine Science Tools10007-16voor dissectie van tumor
Sodium ChlorideVWR0241-5KGbufferreagens
Sodium DeoxycholateSigma-AldrichD670-25Gbufferreagens
Sodium Dodecyl sulfate (SDS)SigmaL-4390bufferreagens
Tris BaseThermo Fisher ScientificBp152-1bufferreagens
Triton X-100Thermo Fisher ScientificBP 151-500polyethyleenglycol octylfenylether
Standard Mini CentrifugeFisherbrand12-006-901standaard mini centrifuge
SZX16 microscopeOlympusSZX16fluorescerende dissectiemicroscoop
ViiA 7 Real-Time PCR System with Fast 96-Well BlockApplied Biosystems4453535
Nanodrop OneThermo-Fisher ScientificND-ONEC-W

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schwartzentruber, J., et al. Driver mutations in histone H3.3 and chromatin remodelling genes in paediatric glioblastoma. Nature. 482 (7384), 226-231 (2012).
  2. Bjerke, L., et al. Histone H3.3. mutations drive pediatric glioblastoma through upregulation of MYCN. Cancer Discov. 3 (5), 512-519 (2013).
  3. Bender, S., et al. Reduced H3K27me3 and DNA hypomethylation are major drivers of gene expression in K27M mutant pediatric high-grade gliomas. Cancer Cell. 24 (5), 660-672 (2013).
  4. Maleszewska, M., Kaminska, B. Is glioblastoma an epigenetic malignancy? Cancers (Basel). 5 (3), 1120-1139 (2013).
  5. Gilfillan, G. D., et al. Limitations and possibilities of low cell number ChIP-seq. BMC Genomics. 13, 645(2012).
  6. Thorne, A. W., Myers, F. A., Hebbes, T. R. Native chromatin immunoprecipitation. Methods Mol Biol. 287, 21-44 (2004).
  7. Turner, B. Mapping Protein/DNA Interactions by Cross-Linking. , (2001).
  8. Tseng, Z., Wu, T., Liu, Y., Zhong, M., Xiao, A. Using native chromatin immunoprecipitation to interrogate histone variant protein deposition in embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 1176, 11-22 (2014).
  9. Calinescu, A. A., et al. Transposon mediumted integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma. J Vis Exp. (96), (2015).
  10. Sambrook, J., Russell, D. W. Estimation of cell number by hemocytometry counting. CSH Protoc. 2006 (1), (2006).
  11. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).
  12. Kubista, M., et al. The real-time polymerase chain reaction. Mol Aspects Med. 27 (2-3), 95-125 (2006).
  13. Hwang, W. W., et al. Distinct and separable roles for EZH2 in neurogenic astroglia. Elife. 3, e02439(2014).
  14. Haring, M., et al. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 3, 11(2007).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Verrijking van histonmerkersdigestie met micrococaal nucleasechromatinfragmentatieProtein A G magnetische beadswassingen met RIPA bufferelutie met TE bufferqPCR validatiehistonmodificaties

Gerelateerde artikelen