Oppervlakte Functionalization van Hepatitis E Virus nanodeeltjes met behulp van methoden voor chemische Woordherkomst en-opbouw

Summary

We hebben de Eiwitmantel proteïne van hepatitis E virus ontworpen als een theranostic nanoparticle (HEVNP). HEVNP assembleert zelf in een stabiele icosahedrale kooi in mucosale levering. Hier beschrijven we de wijziging van de HEVNPs voor tumor gericht op door muteert residuen oppervlak-blootgesteld aan cysteines, die conjugaat van synthetische liganden die specifiek tumorcellen binden.

Abstract

Virusachtige deeltjes (experimentele) zijn gebruikt als nanocarriers weergeven van buitenlandse epitopes en/of leveren van kleine moleculen in de opsporing en behandeling van verschillende ziekten. Deze toepassing is afhankelijk van genetische modificatie, zelf-assemblage en cysteïne vervoeging te vervullen van de tumor-targeting toepassing van recombinant experimentele. vergeleken met genetische wijziging alleen, chemische vervoeging van buitenlandse peptiden aan experimentele biedt een belangrijk voordeel omdat het toestaat dat een aantal entiteiten, zoals synthetische peptides of oligosachariden bevatten, te worden op het oppervlak van experimentele geconjugeerd in een gedifferentieerde en flexibele wijze zonder wijziging van de VLP-vergadering.

We laten hier zien hoe met het hepatitis E virus nanoparticle (HEVNP), een modulair theranostic capsule, als een multifunctionele levering "vervoerder". Functies van HEVNPs omvatten weefsel-targeting, imaging en therapeutische levering. Gebaseerd op de reeds lang gevestigde structurele onderzoek van HEVNP, werden de structureel onafhankelijk en oppervlakte-blootgesteld residuen geselecteerd voor de vervanging van cysteïne als conjugatie sites voor maleimide-linked chemische groepen via thiol-selectieve verbanden. Een specifieke cysteïne-gewijzigd HEVNP (Cys ter vervanging van de asparagine op 573 aa HEVNP - 573C) was geconjugeerd met een borst kanker cel-specifieke ligand, LXY30 en voorzien van nabij-infrarood (NIR) fluorescentie kleurstof (Cy5.5), waardoor de tumor-gerichte HEVNPs als doeltreffende diagnostische capsules (LXY30-HEVNP-Cy5.5). Soortgelijke engineering strategieën kunnen worden toegepast met andere macromoleculaire complexen met bekende atomaire structuren te verkennen mogelijke toepassingen in theranostic levering.

Introduction

De ontwikkeling van de nano-sized vectoren in therapeutische en diagnostische levering, bekend als nanotheranostics, is veel van de biomedische veld uit de buurt van gegeneraliseerde behandelingen naar gerichte levering¹verschoven. Gerichte nanotheranostic levering integreert nano-sized vectoren (nanodeeltjes) met theranostic moleculen om stabiel theranostic moleculen naar een specifieke zieke weefsel of biochemische traject^2,3,4 . Nanogeneeskunde is gekomen op de voorgrond van gerichte levering omdat optimaal formaat nanodeeltjes de capaciteit hebben ....

Protocol

1. HEVNP productie in Insect cellen

Opmerking: Alle volgende stappen moeten worden uitgevoerd in een cel cultuur kap. Verwijs naar onze vorige publicatie voor meer gedetailleerde HEVNP productie-procedures¹¹.

1. Cultuur Sf9 cellen in insect cell media (Zie Tabel van materialen) tot 50-75% samenkomst in 6-Wells-platen.
2. Met behulp van insecten cel transfectie reagentia volgens de fabrikant protocollen, transfect Bacmids met HEVNP - 573 C ORF2 in cellen van de Sf99 voor de productie van recombinante baculovirus. Incubeer de transfected cellen bij 27 ° C gedurende 3-6 dagen, afhankelijk ....

Results

Verwant aan HEV-experimentele, alle Cys gemodificeerde HEVNPs gevormd oplosbare icosahedrale capsids en deed niet aggregaat in oplossing tijdens productie of zuivering. Voor en na-voor-stapmodus maleimide-Biotine conjugatie, elk van de Cys bewerkt waren HEVNPs niet te onderscheiden van HEV-experimentele in de negatieve vlek EM (Figuur 2). Maleimide-Biotine vervoeging efficiëntie Cys gemodificeerde HEVNPs werd voor het eerst getest met het westelijke bevlekken.......

Discussion

In tegenstelling tot de procedure tijdrovend genetische manipulatie, wat gewoonlijk weken duurt, hier tonen we eenvoudige twee stappen en one-step chemische vervoeging procedures, die kunnen worden voltooid binnen 3 dagen, van het toevoegen van de kanker targeting ligand en/of fluorescentie detectie kleurstof de Cys/Lys sites van HEVNPs. De techniek kan worden gebruikt aan het scherm voor de beste ligand-doelstelling van een pool van kandidaten, en dus maakt gebruik van de beschikbare peptide/kleine molecuul synthese die.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
MINI Dialysis Units, 10K MWCO	Thermo Fisher Scientific	69572	mini dialysis unit
High Five Cells	Thermo Fisher Scientific	B85502	Tn5 cells
SF9 Cells	Thermo Fisher Scientific	11496015	Sf9 cells
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System	Thermo Fisher Scientific	A11101, A11100	Baculovirus expression system
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System	Life Technologies	10359-016, 10360-014, 10584-027, 10712-024	Bacmid
ESF921 Insect Cell Media	Expression Systems LLC	96-001-01	insect cell media
Cy5.5 NHS ester, 5mg	Lumiprobe Corp	27020	Cy5.5 NHS ester
Zeba Spin Desalting Columns, 40K MWCO, 0.5 mL	Thermo Scientific	87766	spin desalting column
MES Hydrate	Sigma-Aldrich Chemical Co	M8250-250G	MES
Ultra-Clear Centrifuge Thinwall Ultra-Centrifuge Tubes	Beckman Coulter, Inc	Depends on Rotor	ultracentrifuge tube
NuPage 4-12% Bis-Tris Protein Gels	Thermo Fisher Scientific	NPO321BOX	SDS protein gel
Cellfectin II Reagent	Thermo Fisher Scientific	10362100	transfection reagent
EMS Glow Discharger	Electron Microscopy Science		glow discharger