Methodenartikel

Eencellige Photoconversion in levende Intact zebravis

DOI:

10.3791/57024

⸱

19 maart 2018

 , 
1Department of Biological Sciences, University of Notre Dame, 2Center for Stem Cells and Regenerative Medicine, University of Notre Dame

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol om te laten zien hoe de photoconversion van de cel wordt bereikt door UV blootstelling aan specifieke gebieden uiten de fluorescente proteïne, Eos, in levende dieren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dier- en plantensoorten weefsel is samengesteld uit verschillende populaties van cellen. Deze cellen communiceren na verloop van tijd te bouwen en onderhouden van het weefsel en kunnen leiden tot ziekte wanneer verstoord. Wetenschappers hebben ontwikkeld, slimme technieken om te onderzoeken van de kenmerken en de natuurlijke dynamiek van deze cellen binnen intact weefsel met het uitspreken van fluorescente proteïnen in subsets van cellen. Echter, soms experimenten vereisen meer geselecteerde visualisatie van de cellen in het weefsel, soms op de wijze van eencellige of bevolking-van-cellen. Om dit bereiken en visualiseren van afzonderlijke cellen binnen een bevolking van cellen, hebben wetenschappers eencellige photoconversion van fluorescente proteïnen gebruikt. Om aan te tonen deze techniek, zien we hier hoe directe UV-licht naar een Eos-uiten-cel van belang in een intact, zebravis wonen. We beeld dan die photoconverted Eos+ cellen 24 h later om te bepalen hoe ze veranderd in het weefsel. We beschrijven twee technieken: één cel photoconversion en photoconversions van de populaties van de cel. Deze technieken kunnen worden gebruikt om te visualiseren cel interacties, cel-lot en differentiatie en cel-migraties, waardoor het een techniek die geldt in veel biologische vragen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Meerdere afzonderlijke cellen samen bouwen en onderhouden van complexe dierlijke en plantaardige weefsels. Deze cellen zijn vaak tussenliggende en moeilijk te onderscheiden van buren op het niveau van een enkele cel zonder hoge resolutie microscopie waarvoor fixatie van weefsel. Echter, om te begrijpen hoe deze weefsels vormen, zijn gehandhaafd en worden zieke, is het essentieel om te onderzoeken hoe één cellen binnen het weefsel na verloop van tijd zijn interactie. Ideaal, deze experimenten vereisen de etikettering van enkelvoudige cellen binnen een weefsel op een niet-invasieve wijze zonder de vereiste bevestigingsmiddelen. Wetenschappers hebben nu talrijke technieken om te bereiken deze taak1,2,3,4ontwikkeld.

De ontdekking en de uitvoering van de kwallen groen fluorescente proteïne (GFP) was een opwindende benadering die toegestaan voor het labelen van afzonderlijke cellen in een weefsel milieu1. Met behulp van cel-specifieke initiatiefnemers, is het mogelijk genetisch selecteren een subset van cellen die zijn gemarkeerd met1. U kunt ook kan virale geïnduceerde expressie van GFP worden gebruikt voor gebruiker geselecteerde expressie van GFP3,4. Hoewel vrij nuttig, kan genetische gemedieerde uitdrukking van GFP geen gebruiker geselecteerde expressie binnen een subset van cellen in het weefsel; en virale uitdrukking van GFP, hoewel voordelige, kan invasieve. Met de komst van GFP derivaten en slimme technieken zoals zwHANSje uitspreken verschillende TL eiwitten meer dun in weefsels, het mogelijk geworden om te visualiseren van afzonderlijke cellen en de interacties tussen hen in complexe weefsel2, 5. echter deze benaderingen cellen in een willekeurige mode label. Als het gewenste experiment visualisatie van een enkele cel of een bevolking van cellen die is gedefinieerd door de experimentator nodig, zijn ze dus beperkt. Met dergelijke experimenten, zou het voordeel hebben van een genetisch uitgedrukt fluorescent proteïne die kan worden gemanipuleerd om te onderscheiden, in een enkele cel mode, van andere TL- en niet-belichting fluorescerende cellen.

De wetenschappelijke gemeenschap gebruikt voor het bereiken van dit doel en visualiseren van de celbiologie van afzonderlijke cellen binnen een complexe levend weefsel, eencellige photoconversion van verschillende fluorescente proteïnen6,7,8. Genetisch gereguleerde uitdrukking van een photoconvertible-eiwit (dat wil zeggen, eos, kaede, etc.) dat van een groen rood fluorescerende staat overgangen bij blootstelling aan UV (488 nm) licht, we kunnen een eencellige onderscheiden van haar fluorescently geëtiketteerde buren6,7,8. Deze aanpak maakt gebruik van een apparaat aangesloten op onze confocal microscoop die licht uit een laser stapel naar een diffractie-beperkte regio van belang direct kan. Met deze techniek kunnen we ofwel label afzonderlijke cellen of grotere populaties in een gebruiker gedefinieerde manier9,10,11. De techniek is een minimaal invasieve vergeleken met eencellige injecties van virale GFP. Als een bewijs van concept, laten we zien dat we photoconvert enige cellen binnen een ganglion in het perifere zenuwstelsel en de grotere populaties photoconvert als cellen gelegen aan de ventrale zijde van het ruggenmerg9,10kunnen, 11,12. Wij kunt vervolgens deze photoconverted cel populaties 24 h later om inzicht in hun beweging en differentiatie tijdens ontwikkeling visualiseren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierlijke studies werden goedgekeurd door de Universiteit van Notre Dame institutionele Animal Care en gebruik Comité.

1. voorbereiding voor Zebrafish Specimen

  1. Een volwassen mannetje en één volwassen vrouwelijke GS (converteerbare eiwit) in een paring kamer per standaardprocedures13plaatsen. In dit manuscript, gebruiken Tg(sox10:eos) vis9 vanwege toegang, maar andere transgene lijnen met photoconvertible eiwit kan eveneens worden gebruikt. Meer dan één kamer instellen in het geval dat vis niet doen leggen. Laat de vis in de bedwelmingsruimte blijven 's nachts.
  2. De volgende ochtend, verzamel eieren in petrischalen van 100 mm. Laat de eieren om te rijpen tot 24u na bevruchting (hpf) voor screening.
  3. Als dieren bovenstaande heterozygoten voor de transgenic, filter scherm 24 hpf gerechten voor Tg(sox10:eos) + embryo's met een 488 nm lichtbron en GFP sets op een ontleden Microscoop. Isoleren Tg(sox10:eos) + embryo's en toestaan om te rijpen tot en met 48 hpf.
  4. Dechorionate embryo's handmatig met een naald of pincet.
  5. Bereiden en magnetron 5 mL van 0,8% laag-melting point agarose oplossing.
    1. Zodra agarose koel aanvoelt is, plaats 3-4 narcose GS (sox10:eos) 48 hpf vis in het midden van een 10 mm glas-dekglaasje aan onderste petrischaal.
    2. Voeg genoeg agarose ter dekking van het oppervlak van het dekglaasje aan, ongeveer 1 mL. Via een sonde naald vis aan hun zijden rangschikken. Agarose te stollen zodat montage van dieren toestaan. Mogelijk moet voortdurend Re-Arrange de zebravis totdat de agar14 stolt. Stolling duurt ongeveer 2 minuten.
  6. Nadat de agarose heeft verhard gedurende 2 minuten, Voeg langzaam embryo opslagmedium met 0,02% aminobenzoic acid ester (tricaïne) om schotel totdat de onderkant van de agar en schotel is ondergedompeld. Dit moet ongeveer 3mL.

2. Microscoop montage en pre conversie Imaging

  1. Confocale software openen en selecteer de opname en focus Vensters [Figuur 1]. Selecteer de lab-specifieke conversie imaging instelling onder de opname instellen van de drop-down tabblad [Figuur 1] onder het opnamevenster. Hier, de lab-specifieke instelling heet "vis Imaging."
  2. Plaats specimen op confocal toepassingsgebied en brengen in beeld met behulp van de cursus en fijnafstelling knoppen.
  3. Open het venster focus en ga naar het gewenste gebied van belang (d.w.z. dorsal root ganglia).
  4. Selecteer de c488 laser onder het menu Filter ingesteld. Instellen van de blootstelling aan 300 ms, laser macht tot en met 5 en intensiveren tot 75 [Figuur 2].
  5. Het 3D selectievakje onder de sectie type vastleggen . In het gedeelte 3D-vastlegging Selecteer Gebruik huidige positie en controleer bereik rond huidige. In dezelfde sectie, moet u het bereik opgeven tot en met 35, het aantal vliegtuigen tot en met 36, en de stap-grootte op 1. Het bereik kan worden vergroot of verkleind om ruimte voor de diepte van het imaginggebied. Voor het ruggenmerg is de waarde van een bereik tussen 35-40 stapels doorgaans voldoende [Figuur 5].
  6. Selecteer huidige locatie [Figuur 5].
  7. Klik op start aan de onderkant van het Opnamevenster te verwerven van de afbeelding.

3. eencellige Photoconversion

  1. Confocale software openen en selecteer de opname en focus Vensters [Figuur 1]. Selecteer de lab-specifieke conversie imaging instelling onder de opname instellen van de drop-down tabblad [Figuur 1] onder het opnamevenster. Hier, de lab-specifieke instelling heet "Vis lasertherapie volledige chip."
  2. Selecteer de c488 en c541 laser onder het menu Filter ingesteld. Als niet gebruikend de zelfde Microscoop software, vinden het menu om te Selecteer verschillende lasers en selecteer het 488 nm en 541 nm lasers. Instellen van de risico's op 300 ms, laser macht tot en met 5 en intensiveren tot 75 [Figuur 2]. Deze laser-instellingen zijn geselecteerd op basis van het produceren van voldoende fluorescent signaal zonder photobleaching of toxiciteit te veroorzaken. Als toxiciteit of photobleaching wordt gevisualiseerd, verminderen laser macht of blootstelling.
  3. Open het venster focus en klik op het tabblad photomanipulation in het venster focus. Laser parameters aanpassen. De kracht van de stapel laser omzetten in 2 en klik op Ga naar. Wijzig de blokgrootte Raster 1 en klikt u op instellen. Het Dubbelklik op formaat wijzigen tot en met 4. Wijzig de regel van laser v405 [Figuur 3].
  4. Open de instellingen voor geavanceerde vastlegging in het opnamevenster. Selecteer het tabblad photomanipulation en wijzig de herhalingen dubbelklikken in 2. Klik op OK [Figuur 4].
  5. Selecteer het tabblad XY in het venster focus. Controleer de laser parameters uit stap 2 in het tabblad photomanipulation [Figuur 3, Figuur 4]. Laser instellen op photoconvert de cel van belang zonder photoconversion van de omringende cellen.
    1. Als photoconversion van aangrenzende cellen aanwezig is, verminderen laser. Als photoconversion van cellen niet optreedt, kunnen de laser bevoegdheden worden verhoogd. Optimaal, stel laser macht om photoconvert alleen de regio van belang en niet omliggende gebieden.
  6. Vink het selectievakje timelapse onder type vastleggen. Klik vervolgens op Start [figuur 6A].
  7. Zodra het levende timelapse-venster opent, selecteer het gereedschap cirkel op de bovenste taakbalk [Figuur 7]
  8. Teken een cirkel in de regio van de centermost van de cel. Klik met de rechtermuisknop de getekende cirkel, selecteer FRAP regioen wacht 3 seconden. Het geselecteerde gebied moet worden dimmer [Figuur 8]. Klik op opname stoppen.
  9. Als meer dan één dier imaging, ga terug naar de XY-tabblad in het focus menu en selecteer positie 2. Herhaal vervolgens stap 4.1-4.6.
  10. Als u wilt converteren van een bevolking van cellen, volg de parameters van het protocol en laser voor stappen 4.1-4.4 behalve in plaats van het tekenen van een cirkel om de regio van belang FRAP, gebruikt u het hulpmiddel lijn. Trek een lijn op de regio van belang en de regio met dezelfde parameters hierboven vermelde FRAP.

4. post-photoconversion Imaging

  1. Nadat alle punten photoconverted zijn. Selecteer de stack van de lab-specifieke standaardafbeelding instellen in de precoversion imaging stap 3 beschreven. Dit is gevonden onder de opname instellen van drop-down tabblad in het Opnamevenster [Figuur 5].
  2. De c488 laser selecteren en instellen van de blootstelling aan 300ms, laser macht tot en met 5 en intensiveren tot 75 [Figuur 2].
  3. Selecteer de c541 laser vinden onder hetzelfde menu als de c488 laser. Instellen van de blootstelling aan 500 ms, laser macht tot en met 10 en intensiveren tot 75 [Figuur 9].
  4. Het 3D selectievakje onder de sectie type vastleggen . In het gedeelte 3D-vastlegging Selecteer Gebruik huidige positie en controleer bereik rond huidige. In dezelfde sectie, moet u het bereik opgeven tot en met 35, het aantal vliegtuigen tot en met 36, en de stap-grootte op 1. Het bereik getal kan vergroten of verkleinen zodat de gewenste beeldvorming diepte [Figuur 5].
  5. Als er meerdere punten in het tabblad XY focus, de optie multipoint lijst in het opnamevenster. Als dat niet het geval is, selecteert u huidige locatie.
  6. Klik op start aan de onderkant van het Opnamevenster te verwerven van de afbeelding.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Photoconversion van fluorescente proteïnen kan worden gebruikt om afzonderlijke cellen binnen een weefsel6label. Ter demonstratie werden Tg(sox10:eos) vis9 gebruikt om uit te drukken van het photoconvertible eiwit Eos onder de regulerende sequenties van sox10. De Tg(sox10:eos) dieren op 48 hpf werden voor het eerst gemonteerd, en vervolgens beeld voor het detecteren van een niet-specifieke photoconversion die zich ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In complexe weefsels organiseren verschillende celtypes in specifieke domeinen. Onlangs hebben technieken zijn gebruikt om de afzonderlijke cellen label binnen deze grote weefsel structuren1,2,3. Wij tonen hier twee technieken die kunnen ook worden gebruikt om het visualiseren van zowel eencellige interacties en cel bevolking interacties binnen complexe weefsels. Het voordeel van de photoconversion-techniek is de ruimtelijke con...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken Bernard Kulemaka en leden van the Smith lab voor hun nuttige opmerkingen en de oriëntatie van de reagens, Sam Connell en Brent Redford van 3i voor imaging vragen en Deborah Bang, Karen Heed en Kay Stewart fielding zebrafish ziekenverpleger. Dit werk werd gesteund door de University of Notre Dame, de Elizabeth en Michael Gallagher Family, Alfred P. Sloan Foundation Center voor Zebrafish onderzoek aan de Universiteit van Notre en Center van de cellen van de stam en regeneratieve geneeskunde aan de Universiteit van Notre Dame. Alle dierlijke studies werden gedaan met inachtneming van de Universiteit van Notre Dame IACUC aan Dr. Cody Smith.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Tg(sox10:eos) zebrafish dierenVissen werden verkregen en gekruist vanuit de visfaciliteit aan de Universiteit van Notre Dame
100 X 15 mm petrischaalVWR25384-302
Embryo mediumEmbryo medium wordt wekelijks gemaakt en geleverd door de visfaciliteit aan de Universiteit van Notre Dame met 5L RO-water, 30uL methyleenblauw en 200mL zoutstock.
0,8% Laag smeltpunt Agarosedot scientific inc9012-36-6
35 X 10 mm glazen dekglasbodem petrischaalTed Pella Inc.14021-20
Naald dissecterende sonde
0,002% 3-aminobenzoëzuur ester (Tricaine)Fluka analytischA5040-250G
Fluorescent dissecterend microscoop met GFP-filtersZeiss Axiozoom
Confocale microscoop met lasers om GFP en RFP filtersets te exciteren3i spinning disk confocal
UV-lichtbron (laser) voor fotoconversie405 nm laser
Slidebook software3i
MethyleenblauwKordon

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
  2. Livet, J., Weissman, T. A., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
  3. Goins, W. F., Krisky, D., et al. Herpes simplex virus vectors for gene transfer to the nervous system. J Neurovirol. 3 Suppl 1, S80-S88 (1997).
  4. Boevink, P., Cruz, S., Hawes, C., Harris, N., Oparka, K. J. Virus-mediated delivery of the green fluorescent protein to the endoplasmic reticulum of plant cells. Plant J. 10 (5), 935-941 (1996).
  5. Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chem Soc Rev. 38 (10), 2887-2921 (2009).
  6. Wiedenmann, J., Ivanchenko, S., et al. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (45), 15905-15910 (2004).
  7. Maurel, D., Banala, S., Laroche, T., Johnsson, K. Photoactivatable and Photoconvertible Fluorescent Probes for Protein Labeling. ACS Chem Biol. 5 (5), 507-516 (2010).
  8. Terskikh, A., Fradkov, A., et al. "Fluorescent timer": protein that changes color with time. Science. 290 (5496), 1585-1588 (2000).
  9. McGraw, H. F., Snelson, C. D., Prendergast, A., Suli, A., Raible, D. W. Postembryonic neuronal addition in Zebrafish dorsal root ganglia is regulated by Notch signaling. Neural Dev. 7 (23), (2012).
  10. Smith, C. J., Morris, A. D., Welsh, T. G., Kucenas, S. Contact-Mediated Inhibition Between Oligodendrocyte Progenitor Cells and Motor Exit Point Glia Establishes the Spinal Cord Transition Zone. PLoS biology. 12 (9), e1001961(2014).
  11. Ravanelli, A. M., Appel, B. Motor neurons and oligodendrocytes arise from distinct cell lineages by progenitor recruitment. Genes Dev. 29 (23), 2504-2515 (2015).
  12. Smith, C. J., Johnson, K., Welsh, T. G., Barresi, M. J. F., Kucenas, S. Radial glia inhibit peripheral glial infiltration into the spinal cord at motor exit point transition zones. Glia. , (2016).
  13. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  14. Kirby, B. B., Takada, N., et al. In vivo time-lapse imaging shows dynamic oligodendrocyte progenitor behavior during zebrafish development. Nat Neurosci. 9 (12), 1506-1511 (2006).
  15. Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase. Curr Biol. 8 (24), 1323-1326 (1998).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Foto omzetbaar eiwitConfocale microscopieUV lichtblootstellingZebravis embryo sEos eiwitCelbestemmings trackingCelmigratie analyseTime lapse beeldvormingFluorescerend eiwit

Gerelateerde artikelen