Het doel van deze paper is te presenteren een stapsgewijze procedure voor het verzamelen van verschillende witte vetweefsel van muizen, de vet monsters te verwerken en extraheren van RNA.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Muis adipeus weefsel verzameling en verwerking voor RNA analyse
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Vergeleken met andere weefsels, heeft witte vetweefsel een aanzienlijk minder RNA en eiwit gehalte voor downstream toepassingen zoals real-time PCR en Western Blot, omdat het meestal lipiden bevat. RNA isolatie van adipeus weefselmonsters is ook een uitdaging zoals er extra stappen vereist zijn om te voorkomen dat deze lipiden. Hier presenteren we een procedure voor het verzamelen van drie anatomisch verschillende witte vetweefsel van muizen, voor het verwerken van deze monsters en uitvoeren van RNA isolatie. Verder beschrijven we de synthese van cDNA en gen expressie experimenten met behulp van PCR in real time. De hierbij beschreven protocol staat toe de vermindering van de verontreiniging van de haren en bloed op vet pads evenals kruisbesmetting tussen de verschillende dikke pads tijdens weefsel collectie van het dier. Het is ook geoptimaliseerd om ervoor te zorgen voldoende kwantiteit en kwaliteit van het RNA gehaald. Dit protocol kan worden alom toegepast op elk muismodel waar adipeus weefselmonsters nodig voor routinematige experimenten zoals PCR in real time zijn, maar is niet bedoeld voor de isolatie van de cultuur van de cel van de primaire adipocytes.
Inleiding
Obesitas is een wereldwijde epidemie die tot complicaties, zoals type 2 diabetes1 leiden kan. Zwaarlijvig en genetisch gemodificeerde voeding-geïnduceerde dierlijke modellen worden vaak gebruikt voor onderzoek in de obesitas en zijn bijbehorende complicaties. Traditioneel, witte vetweefsel is bekend als een opbergvak voor overtollige energie en bestaat meestal uit lipiden terwijl bruin vetweefsel energie in warmte2,3 omzet. Vetweefsel zal is dynamisch en uitbreiden en verkleinen afhankelijk van vele factoren zoals de voedselinname en lichaamsbeweging. Vandaar, om te bepalen bijdragende ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Verzorging van de muizen gebruikt in de procedures in acht genomen met normen voor de zorg en het gebruik van proefdieren die door de Canadese Raad voor de bescherming van dieren. Alle procedures werden goedgekeurd door de Universiteit Animal Care en gebruik Comité bij de CHUM Research Center.
1. de necropsie en vetweefsel collectie van mannelijke muizen
- Experimentele groepen volgens studie doelstellingen maken In deze studie werden monsters verzameld uit twee groepen van mannelijke muizen op een achtergrond van C57Bl/6 (n = 12-14/groep). Zorgen dat muizen gebruikt hier 12-15 weken oud zijn en worden bijgehouden op 12-h licht/donk....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Volgens de procedure van de necropsie, drie witte vetweefsel wordt ingezameld en gewogen van de twee groepen muizen (N en HF dieet-gevoed muizen). Zoals verwacht, toegenomen muizen op het HF dieet definitieve lichaamsgewicht en gewichtstoename ten opzichte van nestgenoten op N dieet (tabel 1). Deze observaties werden begeleid door meer dan een 2-fold verhoging van het gewicht van de PGF, PRF en SCF in zwaarlijvige muizen vergeleken met die op N dieet.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Volgende HF-dieet voeding, zwaarlijvig muizen bleken te zijn toegenomen lichaam en wit vetweefsel gewichten in vergelijking met muizen gevoed een N-dieet. RNA geëxtraheerd met behulp van fenol oplossing leverde monsters met goede zuiverheid. Leptine is een adipokine dat voornamelijk geproduceerd door vetweefsel en te correleren positief met vet massa16is bekend. Zoals verwacht, leptine mRNA uitdrukking toename in obesitas muizen samengaan met hun dikke massa.
Deze metho.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gesteund door Diabetes Canada.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1 mL spuiten | |||
| 1X TE-oplossing (10 mM Tris-HCl en 1 mM EDTA•Na2. pH 8,0) | |||
| 22 G naalden | |||
| 26 G naalden | |||
| 75% Ethanol | |||
| Block heater (droogbad) | |||
| Chloroform | Sigma | C2432-500mL | |
| dATP | Thermo scientific | R0141 | |
| dCTP | Thermo scientific | R0151 | |
| dGTP | Thermo scientific | R0161 | |
| DNase I (1 U/µl) | Thermo scientific | EN0521 | |
| dTTP | Thermo scientific | R0171 | |
| Faststart Universal SYBR green Master (Rox) | Roche | 4913922001 | |
| Faststart universal SYBR green master (Rox) fluorescent kleurstof | Roche | 4913914001 | |
| Filterspuittips | |||
| Forceps | Instrumentarium | HB275 | |
| Gaas | |||
| Hamer | |||
| Vetrijk knaagdierdieet | Bio-Serv, Frenchtown, NJ | F3282 | |
| Isopropanol | Laboratoire MAT | IH-0101 | |
| Leptine voorwaartse PCR-primer (5’-GGGCTTCACCCCATTCTGA-3’) 10 uM | |||
| Leptine omgekeerde PCR-primer (5’-GGCTATCTGCAGCACATTTTG-3’) 10 uM | |||
| Vloeibare stikstof | |||
| Maxima Reverse Transcriptase (enzym en 5x buffer) | Thermo scientific | EP0742 | |
| Nanopure water (ook wel ultrapuur water) | |||
| Nitril onderzoekshandschoenen | |||
| Nitril handschoenen | |||
| Normaal knaagdierdieet | Harlan Laboratories, Madison, WI | Harlan 2018 | |
| P1000 pipetman | |||
| P2 pipetman | |||
| P20 pipetman | |||
| P200 pipetman | |||
| Fenoloplossing (TRIzol) | Ambion Life Technologies | 15598018 | |
| Vooraf geïdentificeerde aluminiumfolie | |||
| Kwarts spectrofotometer cuvet | |||
| Rack voor PCR-buisjesstrips | |||
| Racks voor RT-PCR-buisjesstrips | |||
| Random hexamers | Invitrogen | 58875 | |
| Real-time PCR Rotor Gene systeem | Corbett research | RG-3000 Rotor-Gene thermocycler | |
| Gekoelde tafelcentrifuge | |||
| RiboLock RNase-remmer | Thermo scientific | EO0381 | |
| RNase-vrije 1,5 mL eppendorfbuisjes | |||
| RNase-vrije 1,5 mL schroevendopbuisjes | |||
| RNase-vrije PCR-buisjesstrips (0,2 mL) en doppen | |||
| RNase-vrij water | Hyclone | SH30538.02 | |
| RT-PCR machine | Qiagen | Roto-Gene Corbett 3000 | |
| RT-PCR-buisjesstrips (0,1 mL) en doppen | |||
| S16 voorwaartse PCR-primer (5’-ATCTCAAAGGCCCTGGTAGC-3’) 10 uM | |||
| S16 omgekeerde PCR-primer (5’ ACAAAGGTAAACCCCGATCG-3’) 10 uM | |||
| Spectrofotometer | Biochrom | Ultrospec 3100 pro | |
| RVS mortel en stamper | |||
| Chirurgische pads | Zelfgemaakt van een schuimbord omhuld door een wegwerpbare absorberende onderlaag | ||
| Chirurgische schaar | Intrumentarium | 130.450.11 | |
| Thermische cycler | |||
| Thermische cycler | Biometra | Thermocycler | |
| Vortexmixer | |||
| Weegspatels |
Referenties
- Guh, D. P., et al. The incidence of co-morbidities related to obesity and overweight: a systematic review and meta-analysis. BMC. Public Health. 9, 88(2009).
- Wronska, A., Kmiec, Z. Structural and biochemic....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
