Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Visualiseren van de actine en microtubulus Cytoskeletons in de B-cel immuun Synaps met behulp van de gestimuleerde emissie uitputting (STED) microscopie

13.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/57028

⸱

9 april 2018

 ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of British Columbia

In dit artikel

Samenvatting

Presenteren we een protocol voor het gebruik van STED microscopie gelijktijdig afbeelding actine structuren, microtubuli en microtubulus plus-end bindende proteïnen in B-cellen die zich hebben verspreid op coverslips bekleed met antilichamen aan de B-cel receptor, een model voor de eerste fase van immuun synapse formatie.

Samenvatting

B-cellen die zich aan antigenen van de membraan-gebonden (bijvoorbeeldop het oppervlak van een antigeen-presenteren cel binden) vormen een immuun SYNAPS, een gespecialiseerde cellulaire structuur die B-cel receptor (BHG) signalering optimaliseert en BCR-gemedieerde antigeen acquisitie. Zowel de verbouwing van het cytoskelet actine en de heroriëntatie van de microtubuli-netwerk naar de contact site van antigeen zijn essentieel voor immuun synapse formatie. Verbouwing van het cytoskelet van actine in een dichte perifere ring van F-actine gaat gepaard met de polarisatie van het center microtubulus-organiseren naar de immuun synaps. Microtubulus plus-end bindende proteïnen, evenals corticale plus-einde opname eiwitten bemiddelen fysieke interactie tussen de actine en microtubulus cytoskeletons, waarmee ze op een gecoördineerde wijze worden gereorganiseerd. Het ophelderen van de mechanismen die dat besturingselement deze cytoskeletal reorganisatie, alsmede inzicht in hoe deze cytoskeletal structuren vorm immuun synapse formatie en het BHG signalering, nieuwe inzichten in de B-cel-activatie kan leveren. Dit heeft geholpen door de ontwikkeling van super resolutie microscopie benaderingen die nieuwe details van cytoskeletal netwerkorganisatie onthullen. Hier beschrijven we een methode voor het gebruik van gestimuleerde emissie uitputting (STED) microscopie gelijktijdig afbeelding actine structuren, microtubuli en transfected GFP-gelabeld microtubulus plus-end bindende proteïnen in B cellen. Om het model van de vroege gebeurtenissen in immuun synaps formatie, toestaan we dat B-cellen te verspreiden op coverslips bekleed met anti-immunoglobuline (anti-Ig) antistoffen, die BHG signalering en cytoskelet remodeling initiëren. Wij bieden stapsgewijze protocollen voor het uitdrukken van GFP fusion proteïnen in cellen van de A20-B-lymfoom, voor het verspreiden van anti-Ig-geïnduceerde cel, en voor de daaropvolgende cel fixatie, immunokleuring Beeldacquisitie en afbeelding deconvolutie stappen. De hoge resolutie beelden verkregen met behulp van deze procedures kunnen men gelijktijdig visualiseren actine structuren, microtubuli, en de microtubulus plus-end bindende proteïnen die deze twee cytoskeletal netwerken kunnen koppelen.

Inleiding

Wanneer B cellen binden aan gepolariseerde arrays van antigenen (bijvoorbeeldweergegeven op het oppervlak van het antigeen-presenteren cellen (APCs)), de resulterende B-cel receptor (BHG) signalering stations de vorming van een klassieke immuun synapse structuur die werd voor het eerst beschreven in T cellen1,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13. Aanvankelijk, microclusters van antigeen-gebonden vorm van de BCRs aan de rand van de B-cel: APC contact site. Deze microclusters wordt vervolgens verplaatst naar het midden van de antigeen contact site, waar ze in een centrale supramoleculaire activering cluster (cSMAC samensmelten) de kern van de immuun SYNAPS vormt. Immuun synapse formatie optimaliseert BHG signalering en faciliteert het BCR-gemedieerde antigeen extractie van de APC membraan14. Deze overname van antigeen, die wordt gevolgd door antigeen BCR-gemedieerde internalisering en latere antigeen processing, kunt B cellen te presenteren peptide: MHC II complexen naar T-cellen en T-cel help14uitlokken. Omdat immuun synapse formatie B cel activatie bevordert, ophelderen van de mechanismen die stellen dat dit functionele patroon van receptor organisatie kan bieden nieuwe zijn inzichten in hoe humorale immuunreacties gestart en wordt geregeld.

Reorganisatie van zowel de actine en microtubulus cytoskeletons is essentieel voor immuun synapse formatie. Gelokaliseerde BHG signalering gestimuleerd door een ruimtelijk-gepolariseerde scala aan antigenen induceert snelle en dramatische remodelleren van de actine cytoskelet1,15. De vorming van dendritische actine structuren aan de rand van de B-cel oefent duwen krachten op het plasma-membraan en bevordert de verspreiding van de B-cel. Dit maakt de B-cel voor het scannen van een grotere ruimte van de antigeen-steunvlak, en verhoogt het aantal BCRs dat antigeen te binden en te activeren BHG signalering trajecten. Op hetzelfde moment zijn de MTOC en het netwerk van microtubuli omgebogen naar de site van antigeen contact. Als de MTOC de contact site van antigeen nadert, uitbreiden microtubuli die afkomstig zijn van de MTOC langs de binnenzijde van het plasma-membraan op het raakvlak tussen de B-cel en de antigeen-dragende oppervlak16,17 Deze juxtamembrane microtubuli kunnen vervolgens fungeren als tracks voor de dynein-gemedieerde centripetale beweging van antigeen-gebonden BHG microclusters18, wat leidt tot de vorming van een cSMAC.

De heroriëntatie en polarisatie van de MTOC naar de immuun SYNAPS vereist intact actine en microtubulus cytoskeletons en hangt vaak af van interacties tussen de corticale actine netwerk en microtubuli16,17, 19,20. Corticale actine-bindende eiwitten, zoals IQGAP1, kunnen het vangen van microtubuli door interactie met eiwitcomplexen dat de microtubulus plus-ends21 versieren. Deze dynamische complexen van plus-end bindende proteïnen bevatten EB1 en CLIP-170, die gezamenlijk worden aangeduid als microtubulus plus-einde bijhouden van eiwitten (+ TIPs)21,22. + TIPs aan de uiteinden van de microtubuli kunnen binden aan eiwitten die gekoppeld aan het plasma-membraan of de corticale actine cytoskelet zijn. Hierdoor treden genererende mechanismen (bijvoorbeeldhet min-uiteinde gericht verkeer van dynein cortically-verankerd langs de microtubuli) te oefenen trekken krachten op de microtubuli, en daarmee de MTOC verplaatsen. CLIP-170 kan binden aan de steigers actine-geassocieerde proteïne IQGAP123, en we hebben aangetoond dat zowel van deze proteïnen vereist voor het BCR-geïnduceerde MTOC polarisatie richting de immuun synapse17 zijn. Deze IQGAP1-CLIP-170 interactie kan een belangrijke rol bij de coördinatie van de verbouwing van het cytoskelet actine met de herpositionering van het netwerk van microtubuli in de B-cel immuun synaps.

Conventionele fluorescentie microscopie is gebleken dat de dramatische reorganisatie van de actine en microtubulus cytoskeletons tijdens de B-cel immuun synapse formatie2. Echter, deze aanpak niet het oplossen van kleine cellulaire structuren in detail toe te schrijven aan de limiet van de diffractie van licht, die, volgens Abbe de wet, afhankelijk van de golflengte van licht bestemd is tot verlichting van het monster en de opening van de objectieve24. Deze limiet diffractie Hiermee beperkt u de resolutie van conventionele lichte microscopen 200-300 nm in de laterale richting te 500-700 nm in de axiale richting25. Daarom, kleinere subcellular structuren, evenals de fijne details van de actine en microtubulus-cytoskeletons, kunnen alleen worden waargenomen met behulp van elektronenmicroscopie. Elektronenmicroscopie beeldvorming van het cytoskelet is tijdrovend, harde monster fixatie en voorbereiding protocollen die biologische structuren kunnen veranderen, en is beperkt tot de antilichaam-gemedieerde detectie vereist. Het vermogen om immunokleuring en gelijktijdig afbeelding meerdere eiwitten of cellulaire structuren is een aanzienlijk voordeel van fluorescentie microscopie. Anderzijds uiting van fluorescerende fusion eiwitten in cellen kunt real-time imaging en is nuttig wanneer daadwerkelijke antilichamen voor immunokleuring de proteïne van belang niet beschikbaar zijn.

Recente technologische vooruitgang in super resolutie microscopie overwinnen van de grenzen van de diffractie van licht en de visualisatie van nanoschaal cellulaire structuren24toegestaan. Een dergelijke super resolutie microscopie techniek heet gestimuleerde emissie uitputting (STED) microscopie. STED maakt gebruik van twee lasers, waar een laser prikkelt de fluorophore en een tweede laser met een donut-vormige patroon selectief onderdrukt de fluorescentie emissie rond de fluorophore. Dit vermindert de punt-spread-functie (schijnbare gebied) van een één fluorescerende deeltje en zorgt voor een sub diffractie limiet fluorescerende afbeelding25,26. Grondtoestand uitputting microscopie hanteert ook fluorescentie gebaseerde technieken te verwerven Super resolutiebeelden. De afbeelding verwerving en wederopbouw tijden zijn lang, er zijn echter slechts een beperkt aantal fluorophores die kunnen worden gebruikt, en de gelijktijdige high-resolution beeldvorming van meerdere cytoskeletal onderdelen is technisch uitdagend omdat handhaving actine en microtubulus structuren vereist verschillende fixatie procedures. Daarom STED heeft meerdere voordelen ten opzichte van elektronenmicroscopie en andere super resolutie microscopie nadert dat het biedt snelle Beeldacquisitie post-processing minimumvereisten heeft en maakt gebruik van de dezelfde fluorophores en kleuring technieken die worden gebruikt voor conventionele fluorescentie microscopie van vaste monsters26.

Nu al super resolutie microscopie hanteert voor het visualiseren van actine structuren in de immuun SYNAPS in natural killer (NK) cellen en T cellen26,27,28,29,30, 31. echter super resolutie beeldvorming van het cytoskelet van de microtubuli, alsmede de gecoördineerde reorganisatie van de actine en microtubulus cytoskeletons tijdens immuun synaps formatie, is slechts onlangs gemelde17. Wij STED microscopie gewend in afbeelding B-cellen die verspreid over coverslips bekleed met anti-immunoglobuline (anti-Ig) antilichamen, die stimuleren BHG signalering en initiëren cytoskelet reorganisatie had gekregen. Bij het uitplaten op geïmmobiliseerdet anti-Ig antilichamen, ondergaan B-cellen dramatische actine-afhankelijke verspreiden, die de eerste gebeurtenissen recapituleert tijdens immuun synapse formatie. Bovenal bleek STED microscopie de fijne details van de dendritische ring van F-actine die vormen aan de rand van het immuunsysteem synapsen en toonde aan dat de MTOC, evenals de microtubuli die eraan verbonden zijn, dicht bij de antigeen contact site17was verhuisd. Deze microtubuli uitgebreid naar buiten naar de perifere ring van F-actine. Bovendien Multi-Color STED beeldvorming van verschillende combinaties van F-actine, tubuline, IQGAP1, en GFP-gelabeld CLIP-170 + TIPs toonden dat microtubulus plus-ends gekenmerkt door CLIP-170-GFP nauw verbonden met de perifere actine gevlochten en met IQGAP1, een corticale opname eiwitten17.

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor imaging-de actine en microtubulus cytoskeletons in de immuun Synaps met behulp van microscopie STED. Deze methoden zijn geoptimaliseerd met behulp van de A20 lymfkliertest B-cel-lijn, die veel heeft gewerkt voor de studie BHG signalering en immuun synapse formatie17,32,33,34,35 , 36 , 37 , 38 , 39. omdat commerciële antilichamen tegen CLIP-170 niet goed voor immunokleuring in eerdere experimenten werkte, we beschrijven in detail de uitdrukking van GFP-gelabeld CLIP-170 op de A20 cellen, samen met de protocollen voor het visualiseren van gelijktijdig maximaal kleuring drie cytoskeletal componenten of cytoskelet-geassocieerde eiwitten. Methoden voor het gebruik van STED microscopie naar afbeelding actine op NK-cel immuun synapsen zijn40eerder is beschreven. Hier, breiden we dit aan het verwerven van Multi-Color Super resolutiebeelden van zowel de actine en microtubulus cytoskeletons in B cellen.

Een belangrijke overweging voor super-resolutie microscopie is met behulp van de juiste fixatie-procedures voor het onderhouden van cellulaire structuren en voorkomen van schade aan fluorescerende eiwitten. De fixatie en kleuring van de hier vermelde methoden zijn geoptimaliseerd om te behouden GFP fluorescentie en hoge resolutie beeldvorming van de actine- en microtubulus-netwerken. Wanneer het uiten van fluorescente proteïnen, opgemerkt moet worden dat B-cellen meestal moeilijk zijn te transfect. Met behulp van dit protocol, 20-50% van de A20 express cellen meestal de transfected GFP fusieproteïne, en onder deze populatie de hoeveelheid eiwit expressie variabel. Niettemin, super resolutie beeldvorming van actine en microtubuli met behulp van de procedures die we beschrijven is heel robuust en afbeeldingen van hoge kwaliteit zijn gemakkelijk verkregen. Ondanks hun kleine formaat ten opzichte van de A20 cellen, laten we zien dat deze procedures kunnen ook worden gebruikt om het imago van het netwerk van microtubuli in primaire B-cellen die kort zijn geactiveerd met lipopolysaccharide (LPS). We hebben aangetoond dat de LPS-geactiveerde primaire B cellen kunnen zijn transfected met siRNAs op relatief hoge rendement (dat wil zeggen, zodanig dat eiwit uitputting kan worden gedetecteerd door immunoblotting), waardoor ze een goed alternatief voor het gebruik van B cellijnen voor sommige studies 17.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierlijke procedures werden goedgekeurd door de Universiteit van British Columbia Animal Care Comité.

1. uiten van GFP-fusion proteïnen in cellen van de A20-B-lymfoom

  1. Cultuur A20 cellen in volledige RPMI medium (RPMI-1640 aangevuld met 10% warmte-geïnactiveerd foetale runderserum (FBS), 50 µM 2-mercaptoethanol, 2 mM glutamine, 1 mM pyruvaat, 50 U/mL penicilline en 50 µg Mo/mL streptomycine) bij 37 ° C in een broedstoof weefselkweek met 5 % CO2.
  2. Voorbereiden van de transfectiereagens (Zie de Tabel van materialen) volgens instructies van de fabrikant.
    Opmerking: Dit protocol is geoptimaliseerd voor de specifieke reagentia en transfectie protocol beschreven de Tabel van materialen. Andere transfectie reagentia die we hebben geprobeerd hebben geen voldoende transfectie efficiëntie opgeleverd.
  3. Met behulp van een hemocytometer cellen tellen. Cellen in een centrifuge 2.5 x 10-6 A20 (voor elke transfectie) voor 5 min op 525 x g. resuspendeer de cellen in 100 µL van transfectiereagens met 1-2,5 µg plasmide DNA. Gebruik voor DNA codering CLIP-170-GFP23, 2,5 µg per transfectie. Meng voorzichtig.
  4. De cellen overbrengen in een putje van de plaat van een 6-well, en pas het volume aan 2 mL met voorverwarmde volledige RPMI medium. Cultuur van de cellen gedurende 18 uur bij 37 ° C eiwit expressie mogelijk te maken.

2. primaire muisknop B cellen isoleren en je ze activeert met LP 's

  1. Gesteriliseerde chirurgische hulpmiddelen gebruiken voor het verwijderen van de milt van een muis, protocollen door de instelling Animal Care Commissie goedgekeurd.
  2. Plaats een steriele 70-µm cel zeef in de weefselkweek kap, in een 35-mm weefselkweek schotel met 3 mL steriele PBS kamertemperatuur. Gebruik de rubberen deel van de zuiger van een 5 ml-spuit te verpletteren de milt door de zeef van de cel.
  3. Pipetteer eencellige opschorting van splenoctyes in een steriele tube van 15 mL en centrifugeer bij 525 x g gedurende 5 min.
  4. Gebruik een magnetische kraal gebaseerde B-cel isolatie kit (Zie Tabel van materialen) te verkrijgen van een hoogverrijkt bevolking van B-cellen.
  5. Resuspendeer de cellen van B naar 3 x 106/mL in volledige RPMI medium aangevuld met 2,5 µg Mo/mL LPS plus 5 ng/mL B-cel activeren factor (BAFF; een cytokine overleven).
  6. Cultuur van de cellen voor 6 hr bij 37 ° C.

3. coating glas Coverslips met Anti-Ig antilichamen

  1. Bereid de antilichaam-oplossing voor het coaten van de coverslips. Verdun de stockoplossing van geit-anti-muis Ig antilichamen in kamertemperatuur steriele PBS te maken een 12,5 µg Mo/mL oplossing; 400 µL van antilichaam oplossing is vereist voor elke dekglaasje aan.
    Opmerking: Gebruik geit-antimuis IgG voor A20 cellen; geit-antimuis IgM gebruiken voor primaire B cellen. Geit IgG antilichamen binden niet ook aan muis Fc receptoren. Echter, om te voorkomen dat elke potentiële Fc receptor bindende, kunt een F(ab) of F(ab')2 fragmenten van anti-muis IgG of IgM-antistoffen anti-muis.
  2. Duik een dekglaasje aan van #1.5, 18-mm ronde glas in 100% methanol en laat het volledig drogen (~ 10 min).
  3. Plaats de gedroogde dekglaasje aan met pincet in een 12-well weefselkweek plaat en Pipetteer 400 µL van de 12,5 µg Mo/mL antilichaam oplossing (5 µg totaal; 2 µg/cm2) op het dekglaasje aan, zodat het vormen van een zeepbel in het midden van het dekglaasje aan en zich naar de randen uitbreidt.
  4. Wees voorzichtig ter dekking van de gehele dekglaasje aan, maar laat niet de antilichaam-oplossing om uit te breiden voorbij de rand van het dekglaasje glas aan en op de plastic weefselkweek. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
  5. Wassen van de coverslips door pipetting 1 mL steriele PBS in het goed en vervolgens zuigen uit de oplossing. Herhaal de twee meer tijden voor het verwijderen van niet-afhankelijke antistoffen.
  6. Voeg 1 mL steriel PBS tot het putje met de antilichaam-gecoate dekglaasje aan totdat cellen zijn klaar om te worden toegevoegd.
    Opmerking: De coverslips is houdbaar bij kamertemperatuur, bedekt met PBS, voor gebruik op dezelfde dag.

4. B-cel verspreiden op Anti-Ig-Coated Coverslips

  1. Bereiden gewijzigd HEPES-gebufferde zoutoplossing (mHBS): 25 mM HEPES pH 7,2, 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM nb2HPO4, 0.5 mM MgSO4, 1 mg/mL dextrose, 2 mM glutamine, 1 mM natrium pyruvaat, en 50 µM 2-mercaptoethanol). Filter deze oplossing steriliseren en bewaren bij 4 ° C.
  2. Breng 50 mL mHBS met 2% op de dag van het experiment, FBS (mHBS-FBS) door toevoeging van 1 mL van de warmte-geïnactiveerd FBS aan 50 mL mHBS. Warm de mHBS-FBS tot 37 ° C vóór gebruik.
  3. Centrifugeer transfected cellen A20 of de primaire B-cellen, die had zijn gekweekt met BAFF plus LPS bij 525 x g gedurende 5 min.
  4. Resuspendeer de cellen in 1 mL mHBS-FBS, met behulp van een hemocytometer cellen tellen en verdunnen van de cellen tot 2 x 105 cellen/mL in mHBS-FBS.
  5. Met behulp van Tang, overbrengen in het dekglaasje aan van de weefselkweek plaat een stuk van paraffine film.
  6. 250 µL van B-cellen (5 x 104 cellen) aan elke dekglaasje aan toevoegen.
  7. Incubeer de coverslips bij 37 ° C gedurende 15 min. in het donker te staan van de B-cellen te verspreiden over het anti-IgG-gecoate oppervlak.

5. vaststelling en immunokleuring de cellen

  1. De oplossing van de fixatie door verdunning van de stockoplossing paraformaldehyde 16% en de 50% Glutaaraldehyde stockoplossing in kamertemperatuur gedestilleerd water aan opbrengst eindconcentraties van 3% paraformaldehyde en 0,1% Glutaaraldehyde voorbereiden. Bereid de oplossing van de fixatie op de dag dat het is om te worden gebruikt en overmaat negeren.
    Let op: De paraformaldehyde en Glutaaraldehyde voorraadoplossingen mag alleen worden gebruikt in een chemische zuurkast. Volg de instructies op het veiligheidsinformatieblad (MSDS).
  2. Voorbereiden van de permeabilization/blokkeren buffer (3% BSA en 0,1% Triton X-100 verdund in PBS). Filter deze oplossing steriliseren en bewaren bij 4 ° C. Warm op de dag van het experiment, het normbedrag tot kamertemperatuur.
  3. Bereiden de kleuring buffer (1% BSA en 0,1% saponine in PBS). Deze oplossing met behulp van een 0,2 µm filter steriliseren en bewaren bij 4 ° C. Warm op de dag van het experiment, het normbedrag tot kamertemperatuur.
  4. Pipetteer 350 µL van de oplossing van de fixatie op elke dekglaasje aan, ervoor te zorgen dat het oppervlak volledig bedekt is. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten in het donker.
  5. Verwijder de fixatie oplossing uit het dekglaasje aan door zorgvuldig zuigen van de rand van het dekglaasje aan met behulp van een micropipet.
    Let op: De fixatie oplossing moet worden weggegooid als gevaarlijk chemisch afval.
  6. Wassen van de coverslips eens met 500 µL van buffer permeabilization/blokkeren. Pipetteer uit de vloeistof.
  7. Permeabilize en blokkeren de cellen door 250 µL van permeabilization/blokkeren buffer toe te voegen aan elke dekglaasje aan en incubatie gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
  8. Verdun het konijn anti-tubuline antilichaam 1:100 in buffer kleuring.
  9. Gecombineerd uit de buffer permeabilization/blokkeren van de coverslips, en 50 µL van de verdunde anti-tubuline antilichaam-oplossing toevoegen aan elke dekglaasje aan. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 min. in het donker.
  10. Bereid de oplossing van de vlek secundair antilichaam/actine door verder verdunnen van zowel de Alexa Fluor 532-geconjugeerde geit anti-konijn IgG secundair antilichaam en de Alexa Fluor 568-geconjugeerde phalloidin 1:100 in de kleuring van de buffer.
  11. De coverslips 3 keer voor het verwijderen van overtollige primair antilichaam door toevoeging van 500 µL van kleuring van buffer en aspirating dan het wassen.
  12. 50 µL van het secundaire antilichaam/actine vlek oplossing toevoegen aan elke dekglaasje aan en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
  13. De coverslips 3 keer voor het verwijderen van overtollige secundair antilichaam door toevoeging van 500 µL van kleuring van buffer en aspirating dan het wassen.
  14. Voeg 10 µL van montage reagens op een microscoopglaasje. Monteer het dekglaasje aan op het microscoopglaasje met de cel-zijde naar beneden.
    Opmerking: Een "anti-fade" montage-medium (Zie Tabel van materialen) wordt sterk aanbevolen voor het behoud van de intensiteit van de fluorescentie van GFP fusion eiwitten. Vermijd het gebruik van montage van reagentia met DAPI, die met de beeldvorming van de fluorophores interfereren kan bij het gebruik van de laser STED.
  15. Laat de dia's te droog 's nachts in het donker. Het imago van de dia's de volgende dag.
    Opmerking: De dia's Imaging zodra het dekglaasje aan droge sterk wordt aanbevolen, omdat het GFP-fluorescentie in de tijd afnemen zal.

6. met behulp van de Microscoop STED imaging

Opmerking: Houd er rekening mee dat alle software stappen hieronder beschreven zijn specifiek voor de Microscoop en de software die we gebruikt (Zie de Tabel van de materialen). De stappen en de instellingen zal moeten worden aangepast als beeldvorming wordt uitgevoerd met behulp van een andere Microscoop/software.

  1. Inschakelen van de Microscoop STED, activeren de lasers en epifluorescence verlichting lamp en opstarten van de Microscoop software.
  2. Stel de parameters voor de STED uitputting lasers.
    Opmerking: Dit zal afhangen van de specifieke Microscoop wordt gebruikt en de lasers die is uitgerust met. Enkele aanbevolen instellingen zijn wit licht (WLL) 70%; 592 nm laser 80%; 660 nm laser 80%.
  3. Activeer de instellingen STED en uitlijnen van de STED laserstralen, het streven naar 100 X.
  4. Met behulp van het oculair, concentreren van het monster en selecteer een cel met matige GFP expressie.
    Opmerking: Lage GFP expressie worden niet zichtbaar omdat STED de emissie-intensiteit vermindert. Omgekeerd, hoge uitdrukking van CLIP-170-GFP induceert de spontane vorming van grote clusters, die niet met de normale microtubulus plus-end eiwit complex morfologie en distributie overeenkomt. Selecteren van een cel met matige GFP-expressie is essentieel voor het nauwkeurig imaging de cytoskeletal structuren op de contact site van antigeen.
  5. Inzoomen op de geselecteerde cel en kies de regio van belang zijn voor het image worden gemaakt. De focus aanpassen zodat de x-y -vlak van de B-cel die zich het dichtst bij het dekglaasje aan in focus is.
    1. Om dit te doen, door het doel geleidelijk dichter naar het dekglaasje aan verplaatsen zodat de B-cel cytoskeletal structuren naar voren komen en vervolgens gaan onscherp. Vervolgens geleidelijk de doelstelling in de tegenovergestelde richting totdat de B-cel cytoskeletal structuren eerst in focus terugkomt.
  6. Optimaliseer de instellingen met inbegrip van de macht van de laser, excitatie lichtbundel en detector bereik. Begin met de instellingen die zijn aanbevolen door de instructies van de fabrikant. Dan pas zo nodig voor het optimaliseren van het signaal voor de monsters. Het imago van alle monsters worden vergeleken aan elkaar met dezelfde instellingen.
  7. Onder het tabblad "verwerven" van de software instellen de Beeldacquisitie sequentiële frame overname in het lagere linker "Sequentiële scannen" paneel door de optie "tussen frames".
  8. Stel de volgorde van de overname.
    Opmerking: We krijgen het GFP-fluorescentie eerst om te voorkomen dat de aantasting van het GFP-signaal.
    Afhankelijk van de combinatie van fluorophores die naast GFP worden gebruikt, kan de langere golflengte fluorescentie signaal imaging eerst betere resultaten opleveren. De volgorde waarin de fluorophores of fluorescerende eiwitten zijn onderworpen aan de gestimuleerde emissie uitputting en beeld moet echter worden geoptimaliseerd om de sterkste fluorescentie signalen en beste resolutie te verkrijgen.
  9. Selecteer en stel de STED laser macht voor elke fluorophore onder het tabblad "Verwerven" van de software, en gebruik de schuifbalk voor de 592-nm of de 660 nm STED laser aan te passen de kracht van de laser. Pas de macht voor de 592-nm uitputting laser voor GFP en Alexa Fluor 532. De kracht voor de 660 nm uitputting laser voor Alexa Fluor 568 aanpassen.
  10. Verhogen van de resolutie en verminderen het signaal van de achtergrond, ga naar de "Overname" instellingen onder het tabblad "Verwerven" van de software, de lijn en/of frame gemiddeld door het selecteren van een waarde groter dan 1 met behulp van het drop-down menu voor elke optie te verhogen.
  11. Ook het verwerven van het fluorescerende signaal tijd-gated STED via de gating optie voor de fluorophore onder het tabblad "Verwerven" te controleren en waarden opgeven voor de tijd-gating (zie hieronder nota). Verhoog het vermogen laser STED ter verbetering van de resolutie, hoewel dit ook photobleaching van de fluorophores zal verhogen.
    Opmerking: De gating tijd moet worden geoptimaliseerd voor de Microscoop, monster en fluorophores wordt gebruikt. Een tijd gating van 0,3 tot en met 6 ns wordt aanbevolen. Na fixatie is GFP bijzonder gevoelig voor de laser van de hoge macht. Verklein de photobleaching van GFP en tijd gating moet worden toegepast en de kracht van de laser STED verlaagd moet worden.
  12. 3D STED beelden vastleggen, gebruikt u de schuifregelaar naar het punt wijzigen verspreid functie (PSF) aan "3D STED".
  13. Handmatig meerdere afbeeldingen zodat de reproduceerbaarheid te verwerven. Deconvolve de beelden (Zie Figuur 1) met behulp van een deconvolutie software pakket41(Zie Tabel van materialen).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Voor B-cellen verspreiden op geïmmobiliseerdet anti-Ig, biedt STED microscopie gebruikt in combinatie met deconvolutie software hogere resolutiebeelden van cytoskeletal structuren dan confocale microscopie. Dit blijkt duidelijk uit Figuur 1, waar de F-actine-netwerk werd gevisualiseerd met behulp van het protocol zoals hierboven beschreven. Een vergelijking van de confocal en STED Super resolutiebeelden van hetzelfde voorbeeld toont aan dat de STED beelden va...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Gedetailleerde beelden van cytoskeletal structuren kunnen worden verkregen met behulp van STED super resolutie microscopie, wat theoretisch van een oplossing van 50 bereiken kan nm, in vergelijking met conventionele confocale microscopie, waarvoor de diffractie-beperkte resolutie ~ 200 is nm 24. de mogelijkheid om op te lossen fijnere structuren wordt verder verbeterd deconvolutie door software te gebruiken voor het berekenen van de meest waarschijnlijke positie van de oorspronkelijke lichtbron va...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Wij danken de UBC Life Sciences Institute (LSI) Imaging faciliteit voor ondersteuning en handhaving van de Microscoop STED. Dit werk werd gefinancierd door een subsidie #68865 van de Canadese instituten van Health Research (M.R.G.). Wij danken Dr. Kozo Kaibuchi (Nagoya University, Nagoya, Japan) voor de CLIP-170-GFP plasmide.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Celcultuur
A20 muis B-lymfoomcellenATCCTIB-208Muur B-cel lymfoom van Balb/c oorsprong dat een IgG-bevattend BCR op zijn oppervlak toont
RPMI-1640Thermo Fisher Scientific R0883
Fetaal bovien serumThermo Fisher Scientific12483020Verhit inactiveren bij 56 oC gedurende 30 min
2-mercaptoethanolMillipore SigmaM3148
GlutamineMillipore SigmaG5763
NatriumpyruvaatMillipore SigmaP5280
Penicilline-StreptomycineThermo Fisher Scientific15140122Vloeibaar, 10.000 eenheden
Aanvullende materialen voor primaire B-cellen
70-µm cel zeefCorning352350
Magneetkraal gebaseerde B-cel isolatiekitStemcell Technologies19854EasySep Muis B-cel isolatiekit
Lipopolysaccharide (LPS)Millipore SigmaL4391LPS van E. coli 0111:B4
B-cel activerend factor (BAFF)R&D Systems2106-BF-010
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Transfectie
Plasmid dat CLIP-170-GFP codeertCadeau van Dr. Kozo Kaibuchi (Nagoya Univ., Nagoya, Japan); beschreven in Fukata et al. Cell 109:873-885, 2002
Aanbevolen transfectiereagentia en apparatuur
Amaxa Nucleofectiekit VLonzaVCA-1003Volg de aanwijzingen van de fabrikant voor het mengen van de transfectiereagentia met het DNA
Amaxa Nucleofector model 2bLonzaAAB-1001Programma L-013 gebruikt
Falcon 6-well platen, TC behandeld, sterieelCorning353046
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Bekleden van deksels
18 mm diameter ronde #1.5 dekglasThomas Scientific1217N81Vergelijkbaar product: Marienfield-Superior catalogus #117580
PincetFisher Scientific1381242Dissectie extra fijn splinter pincet
Falcon 12-well steriele weefsel polystyreen weefsel kweekplaatCorning353043
100% methanolFisher ScientificA412-4
Steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) zonder calcium of magnesiumThermo Fisher Scientific10010049
Geit-anti-muis IgG antilichaamJackson ImmunoResearch115-005-008Voor A20 cellen
Geit-anti-muis IgM antilichaamJackson ImmunoResearch115-005-020Voor primaire muis B-cellen
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Kleuren
Paraformaldehyde (16% stockoplossing)Electron Microscopy Sciences15710Verdun met PBS tot werkende concentratie
Glutaraldehyde (50% stockoplossing)Millipore Sigma340855Verdun met PBS tot werkende concentratie
Triton X-100Fisher ScientificBP151-500
SaponineMillipore SigmaS2149
Bovien serum albumine (BSA), fractie VMillipore Sigma10735094001
Konijn anti-tubuline antilichaamAbcamab528661:250 verdunning aanbevolen maar moet worden geoptimaliseerd
Alexa Fluor 532-geconjugeerd geit anti-konijn IgGThermo Fisher ScientificA110091:100 verdunning aanbevolen maar moet worden geoptimaliseerd
Alexa Fluor 568-geconjugeerd ftaloidineThermo Fisher ScientificA123801:100 verdunning aanbevolen maar moet worden geoptimaliseerd
Prolong Diamond Antifade MountantThermo Fisher ScientificP36970Zonder DAPI
Fisherbrand Superfrost Plus Microscoop GlazenFisher Scientific12-550-15
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Materialen
ParafilmVWRP1150-2
HEPESMillipore SigmaH3375
NaClFisher ScientificBP358
KClMillipore SigmaP9333
CaCl2Millipore SigmaC1016
Na2HPO4Fisher ScientificS374-500
MgSO4Fisher ScientificM63
DextroseFisher ScientificD16-500
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Microscopie
Leica SP8 TCS STED microscoopLeica
Huygens deconvolutiesoftwareScientific Volume ImagingZie https://svi.nl/HuygensProducts

Referenties

  1. Harwood, N. E., Batista, F. D. The cytoskeleton coordinates the early events of B-cell activation. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (2), a002360(2011).
  2. Batista, F. D., Treanor, B., Harwood, N. E. Visualizing a role for the actin cytoskeleton in the regulation of B-cell activation. Immunol Rev. 237 (1), 191-204 (2010).
  3. Harwood, N. E., Batista, F. D. Early events in B cell activation. Annu Rev Immunol. 28, 185-210 (2010).
  4. Batista, F. D., Harwood, N. E. The who, how and where of antigen presentation to B cells. Nat Rev Immunol. 9 (1), 15-27 (2009).
  5. Kumari, S., et al. T cell antigen receptor activation and actin cytoskeleton remodeling. Biochim Biophys Acta. 1838 (2), 546-556 (2014).
  6. Dustin, M. L. Visualization of Cell-Cell Interaction Contacts: Synapses and Kinapses. Self Nonself. 2 (2), 85-97 (2011).
  7. Dustin, M. L., Chakraborty, A. K., Shaw, A. S. Understanding the Structure and Function of the Immunological Synapse. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (10), a002311(2010).
  8. Dustin, M. L. Modular design of immunological synapses and kinapses. Cold Spring Harb Perspect Biol. 1 (1), a002873(2009).
  9. Dustin, M. L. Visualization of cell-cell interaction contacts-synapses and kinapses. Adv Exp Med Biol. 640, 164-182 (2008).
  10. Dustin, M. L. Hunter to gatherer and back: immunological synapses and kinapses as variations on the theme of amoeboid locomotion. Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 577-596 (2008).
  11. Dustin, M. L. T-cell activation through immunological synapses and kinapses. Immunol Rev. 221, 77-89 (2008).
  12. Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
  13. Monks, C. R., et al. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).
  14. Yuseff, M. I., et al. How B cells capture, process and present antigens: a crucial role for cell polarity. Nat Rev Immunol. 13 (7), 475-486 (2013).
  15. Mattila, P. K., Batista, F. D., Treanor, B. Dynamics of the actin cytoskeleton mediates receptor cross talk: An emerging concept in tuning receptor signaling. J Cell Biol. 212 (3), 267-280 (2016).
  16. Kuhn, J. R., Poenie, M. Dynamic polarization of the microtubule cytoskeleton during CTL-mediated killing. Immunity. 16 (1), 111-121 (2002).
  17. Wang, J. C., et al. The Rap1-cofilin-1 pathway coordinates actin reorganization and MTOC polarization at the B cell immune synapse. J Cell Sci. 130 (6), 1094-1109 (2017).
  18. Schnyder, T., et al. B cell receptor-mediated antigen gathering requires ubiquitin ligase Cbl and adaptors Grb2 and Dok-3 to recruit dynein to the signaling microcluster. Immunity. 34 (6), 905-918 (2011).
  19. Nath, S., et al. Dynein Separately Partners with NDE1 and Dynactin To Orchestrate T Cell Focused Secretion. J Immunol. 197 (6), 2090-2101 (2016).
  20. Combs, J., et al. Recruitment of dynein to the Jurkat immunological synapse. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (40), 14883-14888 (2006).
  21. Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Control of microtubule organization and dynamics: two ends in the limelight. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (12), 711-726 (2015).
  22. Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Microtubule +TIPs at a glance. J Cell Sci. 123 (20), 3415-3419 (2010).
  23. Fukata, M., et al. Rac1 and Cdc42 capture microtubules through IQGAP1 and CLIP-170. Cell. 109 (7), 873-885 (2002).
  24. Wegel, E., et al. Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison. Sci Rep. 6, 27290(2016).
  25. Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. Super-resolution fluorescence microscopy. Annu Rev Biochem. 78, 993-1016 (2009).
  26. Mace, E. M., Orange, J. S. Dual channel STED nanoscopy of lytic granules on actin filaments in natural killer cells. Commun Integr Biol. 5 (2), 184-186 (2012).
  27. Ritter, A. T., et al. Actin depletion initiates events leading to granule secretion at the immunological synapse. Immunity. 42 (5), 864-876 (2015).
  28. Tamarit, B., et al. Membrane microdomains and cytoskeleton organization shape and regulate the IL-7 receptor signalosome in human CD4 T-cells. J Biol Chem. 288 (12), 8691-8701 (2013).
  29. Brown, A. C., et al. Super-resolution imaging of remodeled synaptic actin reveals different synergies between NK cell receptors and integrins. Blood. 120 (18), 3729-3740 (2012).
  30. Dupre, L., et al. T Lymphocyte Migration: An Action Movie Starring the Actin and Associated Actors. Front Immunol. 6, 586(2015).
  31. Rak, G. D., et al. Natural killer cell lytic granule secretion occurs through a pervasive actin network at the immune synapse. PLoS Biol. 9 (9), e1001151(2011).
  32. Lin, K. B., et al. The Rap GTPases regulate the migration, invasiveness and in vivo dissemination of B-cell lymphomas. Oncogene. 29 (4), 608-615 (2010).
  33. Lin, K. B., et al. The rap GTPases regulate B cell morphology, immune-synapse formation, and signaling by particulate B cell receptor ligands. Immunity. 28 (1), 75-87 (2008).
  34. McLeod, S. J., et al. The Rap GTPases regulate integrin-mediated adhesion, cell spreading, actin polymerization, and Pyk2 tyrosine phosphorylation in B lymphocytes. J. Biol. Chem. 279 (13), 12009-12019 (2004).
  35. Christian, S. L., et al. Activation of the Rap GTPases in B lymphocytes modulates B cell antigen receptor-induced activation of Akt but has no effect on MAPK activation. J Biol Chem. 278 (43), 41756-41767 (2003).
  36. Batista, F. D., Iber, D., Neuberger, M. S. B cells acquire antigen from target cells after synapse formation. Nature. 411 (6836), 489-494 (2001).
  37. Treanor, B., et al. Dynamic cortical actin remodeling by ERM proteins controls BCR microcluster organization and integrity. J Exp Med. 208 (5), 1055-1068 (2011).
  38. Mattila, P. K., et al. The actin and tetraspanin networks organize receptor nanoclusters to regulate B cell receptor-mediated signaling. Immunity. 38 (3), 461-474 (2013).
  39. Yuseff, M. -I., et al. Polarized Secretion of Lysosomes at the B Cell Synapse Couples Antigen Extraction to Processing and Presentation. Immunity. 35 (3), 361-374 (2011).
  40. Mace, E. M., Orange, J. S. Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy. J Vis Exp. (85), (2014).
  41. Russ, J. C. The Image Processing Handbook, Sixth Edition. , CRC Press. (2011).
  42. Stinchcombe, J. C., et al. Centrosome polarization delivers secretory granules to the immunological synapse. Nature. 443 (7110), 462-465 (2006).
  43. Vicidomini, G., et al. Sharper low-power STED nanoscopy by time gating. Nat Methods. 8 (7), 571-573 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

ActinecytoskeletMicrotubuli cytoskeletCytoskeletale ReorganisatieVorming van de ImmuunsynapsGFP gelabelde EiwittenProtocol voor CelspreidingBeelddeconvolutieFluorescente Fusie eiwitten
Visualiseren van de actine en microtubulus Cytoskeletons in de B-cel immuun Synaps met behulp van de gestimuleerde emissie uitputting (STED) microscopie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.