Twee methoden worden hier voorgesteld om te bepalen van intestinale barrièrefunctie. Een epitheliale meter (volt/ohm) wordt gebruikt voor metingen van de elektrische weerstand van de transepithelial van gekweekte epithelen rechtstreeks in weefselkweek wells. Bij muizen, wordt de FITC-dextran maagsonde methode gebruikt om te bepalen de intestinale permeabiliteit in vivo.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
In Vitro en In Vivo benaderingen te bepalen van intestinale epitheliale cel permeabiliteit
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De intestinale barrière verdedigt tegen pathogene micro-organismen en microbiële toxine. De functie wordt gereguleerd door de strakke junction permeabiliteit en epitheliale cel integriteit en verstoring van de intestinale barrièrefunctie bijdraagt aan progressie van gastro-intestinale en systemische ziekte. Twee eenvoudige methoden worden hier beschreven voor het meten van de permeabiliteit van het intestinaal epitheel. In vitro, Caco-2BBe cellen zijn verguld in weefselkweek wells als een enkelgelaagde en transepithelial elektrische weerstand (TER) kan worden gemeten door een epitheliale (volt/ohm) meter. Deze methode is overtuigend vanwege de gebruiksvriendelijke bediening en herhaalbaarheid. In vivo muizen zijn gavaged met 4 kDa fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-dextran, en de FITC-dextran-concentraties worden gemeten in verzamelde serummonsters van muizen om de epitheliale permeabiliteit. Mondelinge maagsonde biedt een nauwkeurige dosering, en daarom is de geprefereerde methode voor het meten van de intestinale permeabiliteit in vivo. Samen genomen, deze twee methoden kunnen meten de permeabiliteit van het intestinaal epitheel in vitro en in vivo, en vandaar worden gebruikt bij het bestuderen van de verbinding tussen ziekten en barrièrefunctie.
Inleiding
Intestinale epitheliale cellen zijn niet alleen verantwoordelijk voor de absorptie van voedingsstoffen, maar vormen ook een belangrijke barrière te verdedigen tegen de pathogene micro-organismen en microbiële toxines. Deze functie van de intestinale barrière wordt gereguleerd door de strakke junction permeabiliteit en epitheliale cel integriteit1,2,3, en dysfunctie van de epitheliale barrièrefunctie is geassocieerd met ontstoken darm ziekte (IBD). De perijunctional actomyosine ring (PAMR) ligt in de cel die zich nauw aaneengesloten aan de strakke kruispunten. De inkrimping va....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Deze studie werd goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Protocol van Cambridge-Suda Genomic Resource Center (CAM-SU), Soochow Universiteit.
1. plating en het onderhoud van Caco-2bbe op poreuze polycarbonaat membranen
- Groeien van cellen in een maatkolf van T75 met media (DMEM met 10% FBS). Kolven moeten regelmatig, afhankelijk van de celdichtheid worden gevoed.
Opmerking: Voor optimale beplating, cellen moeten verdelen snel en hebben een plat "gebakken-ei"-vorm, die aangeeft dat cellen in de groeifase. - Zodra de cellen 80% confluente, nemen de kolf uit de incubator zijn en verwijder het medium. Spoel alle resterende....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Cultuur, Caco-2BBe cellen groeien als een enkelgelaagde en langzaam onderscheiden in volwassen absorberend enterocyten borstel randen. In dit protocol, Caco-2BBe cellen werden bedekt met een hoge dichtheid op polycarbonaat membranen en cellen bereikt 100% confluentie één dag na het zaaien. Cellen zijn echter ongedifferentieerde in dit stadium: als volledig onderscheid de cellen, de media elke 2-3 dagen voor 3 weken wordt gewijzigd. Cellen werden gekleurd met kernen en F-actine vlekken om .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Er zijn verschillende kritische stappen in het protocol. CaCO-2BBe (brush border-uitdrukken) cellen worden altijd gebruikt voor TER meting, geselecteerd uit de Caco-2 cellijn voor expressie van borstel-grens eiwitten. CaCO-2BBe cellen hebben een villosités absorberend fenotype als volledig-gesplitste (na ongeveer 3 weken voor cultuur na confluence)17. Het is noodzakelijk om te voorkomen dat besmetting tijdens de meting, en te steriliseren van de elektrode. Omdat de procedure niet-steriele is, alle.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.
Dankbetuigingen
Wij Dr. Jerrold R. Turner, van Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, bedanken voor zijn genereuze hulp bij het voltooien van deze studie. Dit werk wordt ondersteund door de nationale stichting van de natuurwetenschappen van China (subsidie nummer 81470804, 31401229 en 81200620), de Natural Science Foundation van de oostelijke provincie Jiangsu (subsidie nummer BK20180838 en BK20140319), The Research Program voor innovatie College afgestudeerden van de oostelijke provincie Jiangsu (subsidie nummer KYLX16-0116), Advanced Research projecten van Soochow Universiteit (subsidie nummer SDY2015_06), en ziekte van Crohn & Colitis Foundation Research Fellowship ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 22 G gavage needle | VWR | 20068-608 | |
| 4 kDa FITC-dextran | Sigma | 46944 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Zwarte 96-well platen voor fluorescentie | Fisher | 14-245-197A | |
| C57/B6 muizen | Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University | ||
| Caco-2BBe cellen | ATCC | CRL-2102 | |
| Dextraansulfaat natrium | MP Biomedicals | 2160110 | |
| DMED met hoge glucose en natriumpyrovaat | Hyclone | SH30243.01B | |
| Epitheliaal (Volt/Ohm) Meter | Millicell-ERS | MERS00002 | |
| Ethanol | Sinopharm ChemicalReagent | 10009218 | |
| Falcon buis (15 mL) | Corning | 430791 | |
| FBS | Gibco | 10437-028 | |
| Fluorescentiemicroscoop | Olympus | FV1000 | |
| Fluorometer | Biotek | Synergy 2 | |
| HBSS | 138 mM NaCl, 0.3 mM Na2HPO4, 0.4 mM MgSO4, 0.5 mM MgCl2, 5.0 mM KCl, 0.3 mM KH2PO4, 15.0 mM HEPES, 1.3 mM CaCl2, 25 mM glucose | ||
| IFNg | PeproTech | 315-05-20 | |
| Modulair weefsel-inbeddingscentrum | Leica | EG1150H | |
| Serum collectiebuizen | Sarstedt | 41.1378.005 | |
| T75 fles | corning | 430641 | |
| TNF | PeproTech | 315-01A | |
| Paraffine | Sigma | A6330-1CS | |
| Polycarbonaat membranen (Transwell) | Costar | 3413 | |
| Drukpomp | AUTOSCIENCE | AP-9925 | |
| Roterende Microtomie | Leica | RM2235 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| XYleen | Sinopharm ChemicalReagent | 10023418 |
Referenties
- Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nature reviews. Immunology. 9, 799-809 (2009).
- Odenwald, M. A., Turner, J. R. The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target? Nature reviews. Gastroenterology & ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
