Twee methoden worden hier voorgesteld om te bepalen van intestinale barrièrefunctie. Een epitheliale meter (volt/ohm) wordt gebruikt voor metingen van de elektrische weerstand van de transepithelial van gekweekte epithelen rechtstreeks in weefselkweek wells. Bij muizen, wordt de FITC-dextran maagsonde methode gebruikt om te bepalen de intestinale permeabiliteit in vivo.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
In Vitro en In Vivo benaderingen te bepalen van intestinale epitheliale cel permeabiliteit
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De intestinale barrière verdedigt tegen pathogene micro-organismen en microbiële toxine. De functie wordt gereguleerd door de strakke junction permeabiliteit en epitheliale cel integriteit en verstoring van de intestinale barrièrefunctie bijdraagt aan progressie van gastro-intestinale en systemische ziekte. Twee eenvoudige methoden worden hier beschreven voor het meten van de permeabiliteit van het intestinaal epitheel. In vitro, Caco-2BBe cellen zijn verguld in weefselkweek wells als een enkelgelaagde en transepithelial elektrische weerstand (TER) kan worden gemeten door een epitheliale (volt/ohm) meter. Deze methode is overtuigend vanwege de gebruiksvriendelijke bediening en herhaalbaarheid. In vivo muizen zijn gavaged met 4 kDa fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-dextran, en de FITC-dextran-concentraties worden gemeten in verzamelde serummonsters van muizen om de epitheliale permeabiliteit. Mondelinge maagsonde biedt een nauwkeurige dosering, en daarom is de geprefereerde methode voor het meten van de intestinale permeabiliteit in vivo. Samen genomen, deze twee methoden kunnen meten de permeabiliteit van het intestinaal epitheel in vitro en in vivo, en vandaar worden gebruikt bij het bestuderen van de verbinding tussen ziekten en barrièrefunctie.
Inleiding
Intestinale epitheliale cellen zijn niet alleen verantwoordelijk voor de absorptie van voedingsstoffen, maar vormen ook een belangrijke barrière te verdedigen tegen de pathogene micro-organismen en microbiële toxines. Deze functie van de intestinale barrière wordt gereguleerd door de strakke junction permeabiliteit en epitheliale cel integriteit1,2,3, en dysfunctie van de epitheliale barrièrefunctie is geassocieerd met ontstoken darm ziekte (IBD). De perijunctional actomyosine ring (PAMR) ligt in de cel die zich nauw aaneengesloten aan de strakke kruispunten. De inkrimping van de PAMR, die wordt geregeld door de myosin lichtketting (MLC), is van cruciaal belang voor de regulering van strakke junction permeabiliteit4,5,6,7,8, 9,10. Tumornecrosefactor (TNF) staat centraal in de intestinale barrière verlies door upregulating intestinale epitheliale MLC kinase (MLCK) expressie en inducerende occludin internalisering11,-12,13.
Ionen zoals Na+ en Cl- kunnen kruisen de paracellular ruimte door de porie of lek route14. In een "lekke" epitheel weerspiegelen veranderingen in TER voornamelijk veranderde tight junction permeabiliteit. TER meting is een veelgebruikte elektrofysiologische aanpak te kwantificeren tight junction doorlatend zijn, vooral voor nb+ en Cl-, op basis van de impedantie van de cel monolayers. Diverse celtypen, met inbegrip van intestinale epitheliale cellen, pulmonale epitheliale cellen en vasculaire endotheliale cellen, zijn gemeld voor TER metingen. Voordelen van deze methode zijn dat TER metingen niet-invasief zijn en kunnen worden gebruikt om levende cellen in real-time controleren. De meettechniek TER is bovendien handig voor drug toxiciteit studies15.
CaCO-2BBe cellen zijn cellen van de menselijke epitheliale colorectal adenocarcinoom met een structuur en functie vergelijkbaar met de gedifferentieerde kleine intestinale epitheliale cellen: bijvoorbeeld, deze cellen hebben microvilli en enzymen die zijn gekoppeld aan kleine intestinale borstel grens. Daarom, gekweekte Caco-2BBe monolayers worden gebruikt als een in vitro model voor het testen van de barrièrefunctie.
Bij muizen is unidirectioneel om te studeren van intestinale paracellular permeabiliteit door het meten van het vermogen van FITC-dextran te steken van de lumen in het bloed. Zo kan de intestinale permeabiliteit door gavaging FITC-dextran direct in muizen en het meten van de fluorescentie in het bloed worden beoordeeld. Het volgende protocol worden twee eenvoudige methoden om te beoordelen van de permeabiliteit van het intestinaal epitheel beschreven zowel in vitro als in vivo.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Deze studie werd goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Protocol van Cambridge-Suda Genomic Resource Center (CAM-SU), Soochow Universiteit.
1. plating en het onderhoud van Caco-2bbe op poreuze polycarbonaat membranen
- Groeien van cellen in een maatkolf van T75 met media (DMEM met 10% FBS). Kolven moeten regelmatig, afhankelijk van de celdichtheid worden gevoed.
Opmerking: Voor optimale beplating, cellen moeten verdelen snel en hebben een plat "gebakken-ei"-vorm, die aangeeft dat cellen in de groeifase. - Zodra de cellen 80% confluente, nemen de kolf uit de incubator zijn en verwijder het medium. Spoel alle resterende media met 1-2 mL steriele PBS (zonder Ca2 +). Pipetteer 1,5 mL trypsine-EDTA in de kolf en zachtjes rock van de kolf; dan, plaats de kolf in de incubator van de 37 ° C gedurende 20 minuten zonder schommelen.
- Terwijl de cellen zijn trypsinizing, plaats ingevoegd die bevat, poreuze polycarbonaat membranen (poriegrootte, 0.4 µm; oppervlakte, 0,33 cm2; Zie Tabel van materialen) in 24-Wells-platen. Voeg 1,0 mL voedingsbodems in de basale zaal (de lagere ruimte van het membraan).
- Pipetteer 5 mL van de media in de kolf en krachtig Pipetteer de cellen tegen de zijkant van de kolf 5 - 10 keer om losse, afzonderlijke cellen of 2-3 cel samengeklonterd.
-
Plaat 0.166 milliliters cellen (het bereiken van een verdunningsverhouding 1:8) in de apicale kamer (de bovenste ruimte van het membraan). Incubeer bij 37 ° C gedurende maximaal 3 weken.
- Voeden cellen drie keer wekelijks door zorgvuldig aspirating de media van de basale compartiment van elk goed met een drukpomp. Voorzichtig druppelen 1 mL van de media in de apicale kamer van elke toevoeging.
2. gebruik van epitheliale Meter (Volt/Ohm) voor het meten van de TER
Opmerking: Na ongeveer 3 weken cultuur op polycarbonaat membranen, Caco-2BBe cellen zijn klaar voor TER meting.
- Voor cytokine studies, één dag vóór de meting, vervangen door de basale media media met 10 ng/mL van IFNγ. Op de dag van het experiment, door de media te vervangen door HBSS met 2.5 of 7.5 ng/mL van TNF.
Opmerking: IFNγ behandeling verhoogt expressie van TNF receptor 2 (TNFR2)16. - Om te corrigeren de meter, de correctie-elektrode in de invoerpoort invoegen en kies "Ohm" modus. Pas de R Adj schroef met een schroevendraaier, totdat de meter een lezing van 1000 Ω geeft.
- De elektroden steriliseren door ze te plaatsen in 70% ethanol voor 15-30 min en laat ze in de lucht droog voor 15 s. spoeling de elektrode in de experimentele cel-cultuur-media.
- Zet de macht, en de "Ohm" modus kiest. Zorgvuldig plaatst de lange uiteinden van de elektrode bruggen in de basale zaal en de korte uiteinden in de apicale kamer. Ervoor zorgen dat de langere elektroden de onderkant van de schotel, raken terwijl de kortere elektroden onder het oppervlak van de media, maar vooral de weefselkweek inserts. Houd de elektroden verticale.
- Meet de weerstand van de steekproef inzetstukken en lege inserts (dat wil zeggen, de cultuur wordt ingevoegd zonder cellen maar met HBSS) op 0, 1, 2, 3, 4 uur na de behandeling van cytokine. Record de weerstand.
- Om consistentie in verschillende plaat formaten, berekenen het product van de weerstand en het gebied van effectieve membraan:
Voor 24-well inzetstukken is het gebied van effectieve membraan 0.33 cm2.
3. lymfkliertest Model van Dextran (II) sulfaat natrium (DSS)-geïnduceerde Colitis
- Meng DSS met gesteriliseerde met autoclaaf water om een eindconcentratie van 3,5% (wt/vol).
- Beheren van 3,5% DSS naar 8-week-oude mannelijke C57BL/6 muizen voor een totaal van 7 dagen. Regelmatige drinkwater zonder DSS geven controle muizen.
- Activeer de DSS-bevattende water regelmatig drinkwater na dag 7.
- Weeg muizen en beoordelen van klinische scores van elke muis elke dag. Lichaamsgewicht van elke muis te zijn eerste lichaamsgewicht te normaliseren. Scores worden gedefinieerd volgens de ernst van de ziekte door vier parameters: rectale verzakking (0-2), consistentie van de ontlasting (0-2), bloeden (0-2) en activiteit (0-2)5. Som van de scores van deze parameters voor een klinische eindscore.
- Als u wilt analyseren de histopathologische conditie van het weefsel van de dikke darm, euthanaseren muizen door intraperitoneaal (i.p.) injectie met 1,2% (vol/vol) Avertin (0,6 mL/10 g lichaamsgewicht) 7 dagen de behandeling van de post-DSS. Ter voorbereiding van een voorraad van 100% avertin, meng 10 g van 2,2,2-tribromoethanol met 10 ml van tert-amyl alcohol. Opslaan in het donker bij 4° C. Als u wilt gebruiken, Verdun 100% voorraad tot 2% in water.
- Isoleren van de dikke darm en blindedarm en meet de lengte van de dikke darm5.
- Gesneden 0.5 cm segmenten van de distale dubbelpunt en correctie in een tube van 15 mL falcon met 10 mL 10% formaline 's nachts. Wassen van de vaste weefsels met gesorteerde ethanol (75, 95 en 100%) en xyleen. Het weefsel inbedden in paraffine en snijd 6 mm secties voor de haematoxyline en eosine-kleuring van8.
4. meten van de permeabiliteit van de epitheliale barrière bij DSS-geïnduceerde Colitis muizen
- Het meten van de permeabiliteit van de barrière 7 dagen na het begin van DSS administratie.
- Op de dag van de test, snel muizen gedurende 3 uur.
- Autoclaaf een maagsonde naald zodat steriliteit, vervolgens maagsonde muizen met 150 µL 80 mg/mL 4 kDa FITC-dextran in steriel water, en houden de ongebruikte FITC-Dextraan voor het meten van de standaard curve na serum collectie. Weeg de muizen voor de berekening van de permeabiliteit.
Nota: De FITC-dextran oplossing moet worden gemaakt in water. - Met behulp van een paar van schaar, clip van een stuk van 1 cm van de staart, en verzamelen van 100 µL bloed uit de staart in serum collectie buizen. Draai het verzamelde bloed bij 10.000 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Verdun de serum 1:4 in water. Te maken van een standaard kromme, ongebruikte FITC-dextran met water bij 1:300, 1:1, 000, 1:3, 000, verdunnen 1:10, 000, 1:30, 000, 1:100, 000, 1:300, 000, 1:1, 000, 000 en 1:3, 000, 000. Voeg 100 µL per putje van het serum en de standaard curve monsters in 96-wells-platen.
- Lees de fluorescentie in een afleesapparaat met 485 excitatie/528 emissie. Berekenen van de waarden van de permeabiliteit gebaseerd op de standaard curve, en vermenigvuldig met 4 om te corrigeren voor de verdunning.
- De concentratie van FITC-dextran delen door het gewicht te normaliseren van de waarden (dit helpt normaliseren van het verschil in de FITC-dextran levering als muizen ziek zijn en hebben verloren gewicht).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Cultuur, Caco-2BBe cellen groeien als een enkelgelaagde en langzaam onderscheiden in volwassen absorberend enterocyten borstel randen. In dit protocol, Caco-2BBe cellen werden bedekt met een hoge dichtheid op polycarbonaat membranen en cellen bereikt 100% confluentie één dag na het zaaien. Cellen zijn echter ongedifferentieerde in dit stadium: als volledig onderscheid de cellen, de media elke 2-3 dagen voor 3 weken wordt gewijzigd. Cellen werden gekleurd met kernen en F-actine vlekken om ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Er zijn verschillende kritische stappen in het protocol. CaCO-2BBe (brush border-uitdrukken) cellen worden altijd gebruikt voor TER meting, geselecteerd uit de Caco-2 cellijn voor expressie van borstel-grens eiwitten. CaCO-2BBe cellen hebben een villosités absorberend fenotype als volledig-gesplitste (na ongeveer 3 weken voor cultuur na confluence)17. Het is noodzakelijk om te voorkomen dat besmetting tijdens de meting, en te steriliseren van de elektrode. Omdat de procedure niet-steriele is, alle...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.
Dankbetuigingen
Wij Dr. Jerrold R. Turner, van Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, bedanken voor zijn genereuze hulp bij het voltooien van deze studie. Dit werk wordt ondersteund door de nationale stichting van de natuurwetenschappen van China (subsidie nummer 81470804, 31401229 en 81200620), de Natural Science Foundation van de oostelijke provincie Jiangsu (subsidie nummer BK20180838 en BK20140319), The Research Program voor innovatie College afgestudeerden van de oostelijke provincie Jiangsu (subsidie nummer KYLX16-0116), Advanced Research projecten van Soochow Universiteit (subsidie nummer SDY2015_06), en ziekte van Crohn & Colitis Foundation Research Fellowship Award (verlenen nummer 310801).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 22 G gavage needle | VWR | 20068-608 | |
| 4 kDa FITC-dextran | Sigma | 46944 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Zwarte 96-well platen voor fluorescentie | Fisher | 14-245-197A | |
| C57/B6 muizen | Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University | ||
| Caco-2BBe cellen | ATCC | CRL-2102 | |
| Dextraansulfaat natrium | MP Biomedicals | 2160110 | |
| DMED met hoge glucose en natriumpyrovaat | Hyclone | SH30243.01B | |
| Epitheliaal (Volt/Ohm) Meter | Millicell-ERS | MERS00002 | |
| Ethanol | Sinopharm ChemicalReagent | 10009218 | |
| Falcon buis (15 mL) | Corning | 430791 | |
| FBS | Gibco | 10437-028 | |
| Fluorescentiemicroscoop | Olympus | FV1000 | |
| Fluorometer | Biotek | Synergy 2 | |
| HBSS | 138 mM NaCl, 0.3 mM Na2HPO4, 0.4 mM MgSO4, 0.5 mM MgCl2, 5.0 mM KCl, 0.3 mM KH2PO4, 15.0 mM HEPES, 1.3 mM CaCl2, 25 mM glucose | ||
| IFNg | PeproTech | 315-05-20 | |
| Modulair weefsel-inbeddingscentrum | Leica | EG1150H | |
| Serum collectiebuizen | Sarstedt | 41.1378.005 | |
| T75 fles | corning | 430641 | |
| TNF | PeproTech | 315-01A | |
| Paraffine | Sigma | A6330-1CS | |
| Polycarbonaat membranen (Transwell) | Costar | 3413 | |
| Drukpomp | AUTOSCIENCE | AP-9925 | |
| Roterende Microtomie | Leica | RM2235 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| XYleen | Sinopharm ChemicalReagent | 10023418 |
Referenties
- Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nature reviews. Immunology. 9, 799-809 (2009).
- Odenwald, M. A., Turner, J. R. The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target? Nature reviews. Gastroenterology & hepatology. 14, 9-21 (2017).
- Clarke, H., Soler, A. P., Mullin, J. M. Protein kinase C activation leads to dephosphorylation of occludin and tight junction permeability increase in LLC-PK1 epithelial cell sheets. J. Cell Sci. 113 (Pt 18), 3187-3196 (2000).
- Clayburgh, D. R., et al. A differentiation-dependent splice variant of myosin light chain kinase, MLCK1, regulates epithelial tight junction permeability. J.Biol. Chem. 279, 55506-55513 (2004).
- Su, L., et al. TNFR2 activates MLCK-dependent tight junction dysregulation to cause apoptosis-mediated barrier loss and experimental colitis. Gastroenterology. 145, 407-415 (2013).
- Su, L., et al. Targeted epithelial tight junction dysfunction causes immune activation and contributes to development of experimental colitis. Gastroenterology. 136, 551-563 (2009).
- Zha, J. M., et al. Characterization of isoform expression and subcellular distribution of MYPT1 in intestinal epithelial cells. Gene. 588, 1-6 (2016).
- He, W. Q., et al. Altered contractile phenotypes of intestinal smooth muscle in mice deficient in myosin phosphatase target subunit 1. Gastroenterology. 144, e1451-e1455 (2013).
- He, W. Q., et al. Myosin light chain kinase is central to smooth muscle contraction and required for gastrointestinal motility in mice. Gastroenterology. 135, 610-620 (2008).
- Li, H. S., et al. Myosin regulatory light chain phosphorylation is associated with leiomyosarcoma development. Biomed. Pharmacother. 92, 810-818 (2017).
- Clayburgh, D. R., et al. Epithelial myosin light chain kinase-dependent barrier dysfunction mediates T cell activation-induced diarrhea in vivo. J. Clin. Invest. 115, 2702-2715 (2005).
- Wang, F., et al. Interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha synergize to induce intestinal epithelial barrier dysfunction by up-regulating myosin light chain kinase expression. Am. J. Pathol. 166, 409-419 (2005).
- Ye, D., Ma, T. Y. Cellular and molecular mechanisms that mediate basal and tumour necrosis factor-alpha-induced regulation of myosin light chain kinase gene activity. J. Cell Mol. Med. 12, 1331-1346 (2008).
- Turner, J. R., Buschmann, M. M., Romero-Calvo, I., Sailer, A., Shen, L. The role of molecular remodeling in differential regulation of tight junction 300 permeability. Semin. Cell Dev. Biol. 36, 204-212 (2014).
- Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. J. Lab. Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
- Wang, F., et al. IFN-gamma-induced TNFR2 expression is required for TNF-dependent intestinal epithelial barrier dysfunction. Gastroenterology. 131, 1153-1163 (2006).
- Peterson, M. D., Mooseker, M. S. Characterization of the enterocyte-like brush border cytoskeleton of the C2BBe clones of the human intestinal cell line Caco-2. J. Cell Sci. 102 (Pt 3), 581-600 (1992).
- Wang, L., et al. Methods to determine intestinal permeability and bacterial translocation during liver disease. J. Immunol. Methods. 421, 44-53 (2015).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
