Methodenartikel

Proliferatie en differentiatie van lymfkliertest myeloïde voorloper 32 quinquies/G-CSF-R cellen

9.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/57033

⸱

21 februari 2018

 ,  ,  , 
1Department of Hemato-Oncology, Institute of Molecular Genetics of the ASCR, 2Childhood Leukaemia Investigation Prague, Department of Paediatric Haematology and Oncology, 2nd Faculty of Medicine, Charles University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Hier worden gedetailleerde protocollen voor het kweken van de 32 quinquies/G-CSF-R cellijn van lymfkliertest myeloïde voorloper, uitvoeren van virale infecties en het uitvoeren van de proliferatie en differentiatie testen gepresenteerd. Deze cellijn is geschikt voor de studie van myeloïde cel ontwikkeling, en de rol van genen van belang in myeloïde celgroei en neutrofiele differentiatie.

Samenvatting

Inzicht in de hematopoietische stamcellen en voorlopercellen celbiologie heeft belangrijke implicaties voor regeneratieve geneeskunde en de behandeling van hematologische aandoeningen. Ondanks de meest relevante gegevens die kan worden verkregen met behulp van in vivo modellen of primaire culturen, beperkt de lage overvloed van hematopoietische cellen van de stam en voorlopercellen aanzienlijk de pool van geschikte technieken voor hun onderzoek. Daarom kan het gebruik van cellijnen voldoende productie van biologisch materiaal voor de uitvoering van screenings of testen waarvoor grote cel nummers. Hier presenteren we een gedetailleerde beschrijving, uitlezing en interpretatie van de proliferatie en differentiatie tests die worden gebruikt voor het onderzoek van de processen die betrokken zijn bij myelopoiesis en neutrofiele differentiatie. Deze experimenten gebruikmaken van de 32 quinquies/G-CSF-R cytokine lymfkliertest myeloïde doelcel lijn, die beschikt over de mogelijkheid om te verspreiden in het bijzijn van IL-3 en differentiëren in G-CSF. Wij bieden geoptimaliseerde protocollen voor het afhandelen van 32 quinquies/G-CSF-R cellen en bespreken van valkuilen en nadelen die de beschreven tests en de verwachte resultaten in gevaar kunnen brengen. Daarnaast bevat dit artikel protocollen voor lentivirale en retrovirale productie, titratie en transductie van 32 quinquies/G-CSF-R cellen. We laten zien dat genetische manipulatie van deze cellen kan worden gebruikt met succes functionele en moleculaire om onderzoek te verrichten, die resultaten verkregen met primaire hematopoietische cellen van de stam en voorlopercellen of in vivo modellen kunnen aanvullen.

Inleiding

De hematopoietische stamcellen en voorlopercellen bevolking levert het organisme met een groot bereik van volwassen cellen, met inbegrip van cellen uit de myeloïde geslacht (neutrofiele granulocyten, eosinofielen basofielen en monocyten). Het proces dat de aandrijving van de productie van myeloïde cellen van hematopoietische stamcellen staat bekend als myelopoiesis, en voldoende productie van volwassen myeloïde cellen in reactie op de veranderende eisen is een voorwaarde voor goede coping van het organisme met stress voorwaarden, zoals infecties en bloedverlies. Onvoldoende productie van volwassen myeloïde cellen kan leiden tot onmogelijkheid tot het elimineren van pathogenen, verminderde bloedstolling en andere levensbedreigende omstandigheden1,2. Bovendien, kunnen wijzigingen in myeloïde lineage ontwikkeling ook gepaard gaan met hematologische maligniteiten, zoals acute myeloïde leukemie (AML)3. Wijzigingen in de myelopoiesis kunnen zich voordoen als gevolg van verschillende redenen, zoals gebreken in cel oppervlakte receptoren4, veranderde uitingen van transcriptie factoren5, verminderde signalering trajecten6, mutaties resulterend in vorming / activering van oncogenen7, of inactivering van tumor suppressor genen8.

Verschillende methoden hebben ontwikkeld om te studeren myeloïde ontwikkeling, en beoordelen van het effect van specifieke genetische wijzigingen in dit proces. Gemeenschappelijke benaderingen gebruikt bij het bestuderen van myelopoiesis omvatten primaire cellen en transgene muizen. Al deze modellen toe verwerving van biologisch relevante gegevens, hebben ze bepaalde beperkingen. Het gebruik van primaire cellen ontmoetingen een beperkt aantal cellen en een beperkte periode van cultuur, vernauwing van de mogelijkheden om te veranderen van genexpressie en de daaropvolgende biologische of biochemische analyse. Transgene muizen zijn kostbaar en vereisen een redelijke mate van biologische rechtvaardiging. Bovendien voegt werken met in vivo modellen een mate van complexiteit in het begrip van de rol van een gen van belang in een bepaald proces. Daarom, alternatieve benaderingen te omzeilen deze beperkingen nodig zijn. Cellijnen onbetwistbare voordelen hebben: (1) zij beschikken over onbeperkte proliferatie capaciteit waarmee het genereren van genoeg materiaal voor biochemische en biologische studies, (2) ze zijn gevoelig voor genetische manipulaties (knockdown, knock-out, overexpressie), (3) de kosten relatief laag is, en (4) zij toestaan dat een zekere mate van biologische vereenvoudiging vereist in bepaalde experimentele benaderingen.

De ouderlijke IL-3 (interleukine-3) afhankelijke 32 quinquies cellijn werd in 1983 opgericht door Greenberger en collega's door infectie van beenmergcellen van C3H/HeJ muizen met vriend lymfkliertest leukemie virus9. Verschillende 32ste klonen werden beschreven in de literatuur: cl-239, cl-310en cl-1011. De 32ste cl-3 cellen bleken te verspreiden in IL-3 en ondergaan neutrofiele differentiatie op een behandeling met granulocyt-kolonie stimulatie factor (G-CSF)10. Integendeel, werden 32ste cl-10 cellen, terwijl zijn afhankelijk van de IL-3, oorspronkelijk niet onderscheiden in reactie op G-CSF behandeling. In 1995 de groep van Dr. Ivo Touw retrovirally getransduceerde 32ste cl-10 cellen met wild type en mutant vormen van G-CSF receptor (G-CSF-R), teneinde functioneel belangrijke delen van deze receptor11. Deze studie resulteerde in de generatie van de 32 quinquies/G-CSF-R-cellen, die ook afhankelijk van IL-3 zijn, maar binnen 6 tot 10 dagen na de vervanging van IL-3 met G-CSF, cellen stoppen om te vermenigvuldigen en onherroepelijk onderscheiden in volwassen neutrofiele granulocyten. Deze eigenschappen maken 32ste cl-3 en 32 quinquies/G-CSF-R cellen vereenvoudigde modellen van lymfkliertest neutrofiele differentiatie die kan worden gedifferentieerd door twee welomschreven groei en differentiatie factoren - IL-3 en G-CSF. Tijdens de laatste decennia hebben meerdere groepen 32 quinquies/G-CSF-R cellen gebruikt om te bestuderen van de rol van bepaalde genen in de proliferatie en differentiatie van myeloïde cellen in cultuur12,13,14,15 , 16, en te bestuderen of G-CSF signalering17,18. Nog belangrijker is, de resultaten verkregen met behulp van deze cellijn gecorreleerd met gegevens die zijn verkregen met primaire cellen en transgene muizen16,19,20,21. Wij zijn bijgevolg van mening dat 32 quinquies/G-CSF-R paneeltechnologie, een wijd gebruikte en reeds lang gevestigde model een waardevolle systeem vormen te bestuderen myeloïde differentiatie die kan worden gebruikt in parallel met andere benaderingen voor het aanpakken van deze vraag.

Hier, gedetailleerde protocollen beschrijven de behandeling van de 32 quinquies/G-CSF-R cellijn, welke uitbreiding van de dekking, differentiatie en evaluatie van de proliferatie en differentiatie van deze cellen wordt gepresenteerd. Gedetailleerde informatie voor genetische modificatie van 32 quinquies/G-CSF-R cellen, hetzij door retrovirale of lentivirale signaaltransductie, evenals de protocollen voor virus titratie zijn verstrekt. Daarnaast vindt u enkele representatieve resultaten waaruit potentiële toepassingen van 32 quinquies/G-CSF-R cellen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Opmerking: Stappen beschrijven expansie, differentiatie en transductie van 32 quinquies/G-CSF-R cellen zijn hieronder weergegeven.

1. voorbereiding

  1. Voorbereiding van de media
    1. 250 mL gestolde voedingsbodem voor te bereiden: RPMI (Roswell Park Memorial Instituut) 1640 medium aangevuld met 10% warmte geïnactiveerd FBS (foetale runderserum) en lymfkliertest IL-3 (10 ng/mL).
      1. U kunt ook gebruik zelfgemaakte IL-3. Voor de productie van zelfgemaakte IL-3, transduce HEK293 cellen met IL-3 waarin vector en verzamelen van IL-3 met supernatant22.
        Opmerking: Antibiotica, zoals penicilline G (100 IU/mL), streptomycine (100 µg/mL) en gentamicine (40 µg/mL), kunnen worden gebruikt voor de cel kweken bij elke stap van het protocol, tenzij anders vermeld.
    2. 50 mL van differentiatie medium bereiden: RPMI 1640 medium aangevuld met 10% FBS, en menselijke G-CSF (100 ng/mL).
      Opmerking: (Belangrijk) niet alle serum batches steunen differentiatie van 32 quinquies/G-CSF-R cellen. Test verschillende batches instellen van serum vóór aanvang van het experiment. Het is aanbevolen om test ten minste 4 verschillende batches instellen en selecteer de optimale gebaseerd op het vermogen van de 32 quinquies/G-CSF-R cellen te onderscheiden. Zie 32 quinquies/G-CSF-R differentiatie protocol hieronder.
    3. 10 mL van bevriezing medium bereiden: RPMI 1640 medium aangevuld met 40% FBS, en 10% DMSO (dimethylsulfoxide).
  2. Productie van retrovirus
    1. Een eencellige suspensie van Bosc23 cellen (6 × 106) in een petrischaal 16 cm plaat en cultiveer in 18 mL DMEM (Dulbecco van bewerkt Eagle's Medium) bevattende 10 gewichtspercenten FBS tot de confluentie van de cultuur 80% (24 h bedraagt).
      Opmerking: De cellen moeten groeien in een enkelgelaagde en niet formulier klontjes in cultuur. Cel tellen kan worden uitgevoerd met behulp van verschillende methoden (geldig voor de rest van de hier gepresenteerde protocollen). In het geval van lage aantal monsters, wordt handmatig tellen onder de microscoop met behulp van de Bürker kamer aanbevolen. In dit geval, gebruik Trypan blauw voor uitsluiting van dode cellen. Cellen 1:1 mengen met 0,4% Trypan blauw in PBS. Voor het uitvoeren van tellen van groot aantal monsters, kan een automatische cel teller worden gebruikt.
    2. Combineer 40 µg voor retrovirale construct (zoals MSCV), 20 µg voor pCL-Eco (verpakking vector)23, 80 µl van PEI (polyethylenimine) en 2 mL verminderd-Serum medium (bijvoorbeeld Opti-MEM) medium (zonder antibiotica). Incubeer dit mengsel gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur (RT).
    3. Bosc23 cellen medium zorgvuldig vervangen door 16 mL DMEM aangevuld met 2% FBS. Vooraf warm het medium tot 37 ° C vóór gebruik.
      Opmerking: Gebruik geen antibiotica tijdens de transfectie, aangezien het transfectie efficiëntie kan verminderen.
    4. Voeg het mengsel bereid in 1.2.2. dropwise en zorgvuldig naar de Bosc23 cultuur en incubeer gedurende 4 uur bij 37 ° C. Incubatie tot minder dan 6 h als gevolg van PEI toxiciteit te beperken.
    5. Na incubatie, omzetten in Bosc23 medium 18 mL pre opgewarmd DMEM met 10% FBS, en cultiveer cellen gedurende 48 uur bij 37 ° C. Gerechten in een laboratorium van bioveiligheid niveau 2 plaatsen, houd hier van deze stap op en volg standaard veiligheidsprocedures.
    6. Bosc23 medium (met ecotropic retrovirale deeltjes) met behulp van een 25-mL serologische precisiepipet in een conische buis van 50 mL verzamelen en bewaren bij 4 ° C.
      Opmerking: (Belangrijk) transfectie efficiëntie moet 90% voor de productie van een hoge titer virus bereiken.
    7. Voeg 18 mL pre opgewarmd DMEM 10% FBS te Bosc23 cellen en cultiveren gedurende 24 uur.
    8. Herhaal stap 1.2.6.
      Opmerking: Retrovirale supernatant van 1.2.6 en 1.2.8 kunnen worden gepoold zodra ze bij dezelfde temperatuur (4 ° C) om virale integriteit te behouden.
    9. Bosc23 om besmetting te voorkomen in virale supernatant, spin verzamelde virus bij 1500 × g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Aliquot virus, snap bevriezing met behulp van droogijs of vloeibare stikstof, en opslaan bij-80 ° C. Nochtans, merken op dat vers bereide virus is van hogere kwaliteit in termen van efficiëntie van de infectie dan bevroren voorraden.
      Opmerking: (Belangrijk) Vermijd repetitieve invriezen/ontdooien van virus, omdat het leidt tot aantasting van het virale.
  3. Productie van lentivirus
    1. Een eencellige suspensie van HEK293T (menselijke embryonale nier 293T) cellen (6 × 106) in een petrischaal 16 cm plaat en cultiveer in 18 mL DMEM met 10% FBS tot de confluentie van de cultuur 80% (24 h bedraagt).
      Opmerking: De cellen moeten groeien in een enkelgelaagde en niet formulier klontjes in cultuur.
    2. Combineren van 15 µg voor lentivirale construct (zoals pGhU6), verpakking van plasmiden pCMVdR8.74 (codering voor gag/pol, 12 µg) en pMD2.VSVG (codering voor VSV-G, 1,4 µg), 85.2 µL PEI, en 2 mL verminderd-serum medium (zonder antibiotica). Incubeer dit mengsel gedurende 20 minuten op RT.
    3. Zorgvuldig vervangen HEK293T medium met 16 mL DMEM aangevuld met 2% FBS. Vooraf warm het medium tot 37 ° C vóór gebruik. Gebruik geen antibiotica tijdens de transfectie, aangezien het transfectie efficiëntie kan verminderen.
    4. Zorgvuldig drop het mengsel bereid in 1.3.2 aan de cultuur van de cel van de HEK293T en incubeer gedurende 4 uur bij 37 ° C. Duur van de incubatie naar binnen 6 uur om te voorkomen dat PEI toxiciteit te beperken.
    5. Verandering middellange tot 18 mL pre opgewarmd DMEM 10% FBS en cultiveren van cellen gedurende 48 uur bij 37 ° C. Gerechten in een laboratorium van bioveiligheid niveau 2 plaatsen, houd hier van deze stap op en volg standaard veiligheidsprocedures.
    6. HEK293T medium (met amphotropic lentivirale deeltjes) met behulp van een 25-mL serologische precisiepipet in een conische buis van 50 mL te verzamelen en op te slaan bij 4 ° C.
      Opmerking: (Belangrijk) transfectie efficiëntie moet 90% voor de productie van een hoge titer virus bereiken.
    7. Voeg voorzichtig 18 mL voorverwarmde DMEM 10% FBS aan de HEK293T cellen. Cultiveren gedurende 24 uur bij 37 ° C.
    8. Herhaal stap 1.3.6.
      Opmerking: Lentivirale supernatant van 1.3.6 en 1.3.8 kunnen worden gepoold zodra ze bij dezelfde temperatuur (4 ° C) om virale integriteit te behouden.
    9. Om besmetting te voorkomen van virale supernatans met HEK293T cellen, spin verzamelde virus bij 1500 × g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Aliquot virus, snap bevriezing met behulp van droogijs of vloeibare stikstof, en opslaan bij-80 ° C. Nochtans, opmerken dat vers bereide virus is van hogere kwaliteit in termen van efficiëntie van de infectie dan bevroren voorraden.
      Opmerking: (Belangrijk) Vermijd repetitieve invriezen/ontdooien van virus, omdat het leidt tot aantasting van het virale.
  4. Titratie van virus met een GFP-reporter
    1. Zaad van 1 × 105 NIH/3T3 cellen in 300 µL van DMEM 10% FBS per putje in een 24-well-plaat. 7 putten zal worden gebruikt om een virus van de titer.
    2. Ontdooi virus bij 37 ° C en 1, 5, 10, 50, 100 en 500 µL virus toevoegen aan NIH/3T3 culturen. Voeg geen een virus in negatieve controle goed. Cultiveren van cellen in aanwezigheid van het virus gedurende 48 uur bij 37 ° C.
    3. Oogsten van NIH/3T3 cellen met behulp van 30 µL trypsine/EDTA (ethyleendiamminetetra zuur) (0,25% trypsine, 0,01% EDTA in PBS) en cellen plaats in 250 µL PBS in een buis FACS (fluorescentie geactiveerd cel Sorteren).
    4. Bepaal de frequentie van GFP+ cellen door stroom cytometry in elk monster24. Dode cellen uitsluiten door toevoeging van een levensvatbaarheid kleurstof, zoals Hoechst 33258.
    5. Berekenen van het totale aantal GFP+ cellen (gebaseerd op het aantal vergulde cellen en percentage GFP+ cellen) en plot ze tegen de hoeveelheid virus gebruikt voor infectie.
      Opmerking: (Belangrijk) efficiëntie van infectie bereikt een plateau wanneer grote virale doses worden toegepast. Daarom is het belangrijk voor het schatten van de titer op basis van virale concentraties welke infectie efficiëntie in een lineaire reeks (zoals vermeld in tabel 1 optreedt). Het aantal cellen van het GFP+ geeft het aantal functionele virale deeltjes (TU - omzetten van eenheden) in een bepaald virus volume. Berekenen van het aantal TU per mL.
  5. Titratie van virus met een puromycin-reporter
    1. Zaad 5 × 104 NIH/3T3 cellen in 3 mL DMEM 10% FBS per putje in een 6-well plaat; dienst 6 wells titer een virus. Cultuur 's nachts bij 37 ° C.
    2. Volgende dag Verdun virus zoals aangegeven in tabel 2. Om te verdunnen virus, voorverwarmde DMEM 10% gebruiken FBS. Doen niet vortex.
    3. Kweekmedium uit NIH/3T3 cellen verwijderen en voeg 1 mL verdunde virus.
    4. Na een nacht bebroeden bij 37 ° C.
    5. Zachtjes vervangen door het medium virus-bevattende 2 mL voorverwarmde DMEM 10% FBS, en na een nacht bebroeden bij 37 ° C.
    6. Zachtjes vervangen NIH/3T3 medium met 2 mL voorverwarmde DMEM 10% FBS met puromycin (2 µg/mL).
    7. Cultuur bij 37 ° C en zorgvuldig vernieuwen medium met puromycin om de 3 dagen of wanneer medium omslaat naar geel.
    8. 10-12 dagen na infectie, gecombineerd medium uit elk putje en voorzichtig wassen met PBS.
    9. Vlek met kristalvioletoplossing (0,5% kristalviolet in 20% ethanol en dH2O), 1 mL 2 min op RT en zorgvuldig wassen met PBS tweemaal.
    10. Graaf blauwe kolonies in elk putje onder een microscoop (vergroting × X4) aanwezig. Geen kolonies moeten goed worden nageleefd in de negatieve controle.
    11. Bereken het totale aantal TU/mL overweegt de verdunningsfactor.

2. uitbreiding en het onderhoud van 32 quinquies/G-CSF-R cellen

  1. Als 32 quinquies/G-CSF-R cellen zijn bevroren, nemen een aliquoot gedeelte en ontdooien van cellen in een waterbad 37 ° C voor 1 min en giet cellen uit de ampul direct in 10 mL voorverwarmde RPMI 1640 voedingsbodem aangevuld met 10% FBS in een tube van 15mL. Omkeren de buis 3 keer en draaien de cellen neer op 400 × g. Verwijder supernatant en resuspendeer de cellen in de IL-3 met gestolde voedingsbodem in een concentratie tussen de 0,3 × 106 cellen/mL.
  2. Optimale cel groei concentratie is 0,25-0,5 × 106 cellen/mL. Cellen splitsen om de 2 dagen brengen ze naar een concentratie van 0,1-0,2 × 106 cellen/mL.
    Opmerking: (Belangrijk) 32 quinquies/G-CSF-R cellen kunnen gedeeltelijk verliezen hun vermogen om te onderscheiden als uitgegroeid tot concentraties hoger dan 1 × 106 cellen/mL. Het is daarom heel belangrijk om 32 quinquies/G-CSF-R cellen splitsen op tijd.
  3. Indien nodig, bevriezen en opslaan van cel aliquots voor langere tijd bij-80 ° C of in vloeibare stikstof. Spin down 3 × 10-6 cellen verwijderen supernatant en resuspendeer in 1 mL van bevriezing medium. Plaats de buis in een bevriezing container bij-80 ° C. Verplaatsen voor lange termijn opslag, cellen met vloeibare stikstof.

3. signaaltransductie van cellen van de 32 quinquies/G-CSF-R

  1. Plaat 32 quinquies/G-CSF-R cellen in 6-well plaat in een concentratie tussen de 0,3 × 106 cellen/mL.
  2. Voeg de juiste hoeveelheid virus te bereiken een MOI (multipliciteit van infectie) tussen 10 en 40.
    Opmerking: Hogere MOI zal leiden tot verhoogd percentage van GFP+ cellen, alsmede hogere niveaus van expressie van het gen van belang. Voorbeeld: Te infecteren 0,3 × 10-6 cellen met een MOI van 10; 3 × 10-6 TU zal moeten worden toegevoegd aan de cellen 32 quinquies/G-CSF-R.
  3. Voeg polybrene toe aan eindconcentratie 8 µg/mL en incubeer gedurende 6 uur bij 37 ° C. U kunt ook een spin-inoculatie-procedure uitvoeren: centrifugeren op 1200 × g gedurende 90 minuten bij 30 ° C in een kweken plaat met behulp van een swing-emmer rotor en incubeer gedurende 3 uur bij 37 ° C.
  4. De cellen van het verzamelen, overbrengen in een buis 15 mL, en spin bij 450 × g gedurende 5 min (4 ° C).
  5. Verwijder het supernatant, resuspendeer Ingehuld cellen in 6 mL gestolde voedingsbodem, breng in een maatkolf van T25 cel-cultuur, en cultuur bij 37 ° C.
  6. 48 uur later, oogsten van cellen en draaien ze bij 450 × g gedurende 5 min (4 ° C). Verwijder het supernatant.
  7. In het geval van een GFP-verslaggever: cellen in 500 µL van PBS en sorteren GFP+ cellen met behulp van een stroom cytometry sorter plaatsen. In het geval van een verslaggever van de puromycin met vector: plaatsen van cellen in kweekmedium dat 2 µg/mL puromycin.
  8. Vouw cellen zo nodig voor verdere analyse en experimenten.
    Opmerking: (Optioneel) Transduced cellen kunnen worden bevroren in de bevriezing van de media in een bevriezing container bij-80 ° C, en verder opgeslagen in vloeibare stikstof.

4. 32 quinquies/G-CSF-R cel proliferatie assay

  1. Om te beoordelen van proliferatie tarief plaats 0.2 × 106 cellen in 1 mL gestolde voedingsbodem en na een nacht bebroeden bij 37 ° C.
  2. Volgende dag tellen aantal cellen en hen terug naar een concentratie van 0,2 × 106 cellen/mL gestolde voedingsbodem met verdund. Na een nacht bebroeden bij 37 ° C. Een register bijhouden van cel concentraties en verdunningen toegepast op de dagelijkse culturen met behulp van tabel 3.
  3. Herhaal stap 4.2 voor zoveel dagen zoals proliferatie dient te worden beoordeeld.
    Opmerking: De lengte van de proliferatie tests zal afhangen van het effect van het gen van belang. In geval van een sterke fenotype, zou kunnen 8-9 dagen volstaan om te kijken wat een significant effect (Zie figuur 3A). Nochtans, in geval van een milde fenotype, langere tijd kunnen zijn vereist.
  4. Beoordelen celgroei doordat een proliferatie curve zoals aangegeven in tabel 3.

5. 32 quinquies/G-CSF-R cel differentiatie assay

  1. Wassen 0.2 × 106 32 quinquies/G-CSF-R cellen tweemaal met RPMI medium zonder cytokines.
    Opmerking: De stappen wassen vóór toevoeging van G-CSF in de cultuur zijn belangrijk, omdat de aanwezigheid van residuele IL-3 differentiatie kan remmen.
  2. Cellen in 1 mL differentiatie opslagmedium (met 100 ng/mL G-CSF) in een 24 goed/plaat, wat resulteert in een cel concentratie van 0,2 × 10-6 cellen/mL (dag 0) plaatsen. Cultuur 's nachts bij 37 ° C.
  3. Aantal cellen/mL zoals hierboven (stap 1.2.1) aangegeven.
  4. Cytospin 2-5 × 104 cellen op een glasplaatje (76 X 26 mm) met behulp van een centrifuge met nodige adapters op 20 × g.
  5. Vernieuwen differentiatie medium en plaat cellen bij een concentratie van 0,2 × 105 cellen/mL op een 24 goed/plaat (dag 1). Gooi de oude plaat, en gaan de volgende dag met stap 5.6 met de nieuwe plaat.
  6. Herhaal stap 5.3 naar 5.5 op 2 tot 7 dagen. Beoordelen celproliferatie in aanwezigheid van G-CSF zoals beschreven in stap 4.
    Opmerking: (Belangrijk) tijdens de differentiatie, celproliferatie vertraagt, daarom na 3 tot 4 dagen in het bijzijn van G-CSF is het voldoende om de cellen van de cultuur bij hogere concentraties.
  7. Beoordelen van differentiatie staat van 32 quinquies/G-CSF-R cellen op basis van morfologie van de cel.
    1. Cellen uit stap 5.4 in methanol gedurende 5 minuten op RT vast en laat dia's om te drogen.
      Opmerking: Dia's uit dag 0 tot en met 7 kunnen worden opgeslagen op RT en tegelijkertijd vast. Ook kunnen ze ook worden bewaard op RT voor langere periodes na fixatie.
    2. Vlek cellen met behulp van mei-Grünwald-Giemsa kleuring van volgende fabrikant protocol.
    3. Gekleurde cellen met behulp van een microscoop en vergroting X40 visualiseren.
    4. Kwantificeren aantal ontploffingen, gearchiveerd gedifferentieerde cellen en volwassen granulocyten met behulp van de illustratieve afbeeldingen op Figuur 1 en beschrijving in tabel 4.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Proliferatie en differentiatie van cellen van de 32 quinquies/G-CSF-R

Om te beoordelen van proliferatie van 32 quinquies/G-CSF-R cellen onder de voorwaarden van pro-proliferatieve en Pro-differentiatie, werden 32 quinquies/G-CSF-R cellen gekweekt in medium met IL-3 en G-CSF, respectievelijk. Het werd waargenomen dat cellen gekweekt in IL-3 met medium (10 ng/mL) ongeveer elke 24 h (figuur 2A verdelen). ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De keuze van een experimenteel model is een van de belangrijkste kwesties in onderzoek. Hoewel primaire dierlijke en menselijke cellen worden verondersteld om de meest biologisch relevante gegevens te produceren, wordt deze modellen ethische bezwaren kunnen betrekken en worden vaak geassocieerd met dure en/of geavanceerde isolatie/kweken van procedures. Primaire cellen in aantallen zijn beperkt en het is moeilijk om genetisch te manipuleren hen. Bovendien, vertegenwoordigen primaire cellen een heterogene populatie bestaa...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs bedanken Prof. Ruud Delwel en Prof. Ivo Touw voor het verstrekken van ons met de 32 quinquies/G-CSF-R cellijn en Prof. Daniel G. Tenen voor het verstrekken van ons met de cellijn van Bosc23. Dit werk werd ondersteund door subsidies van het subsidie-Agentschap van de Tsjechische Republiek (GACR 15-03796S en GACR 17-02177S) bij MA-J, ondersteuning van het Instituut voor moleculaire genetica van de Tsjechische Academie van Wetenschappen (RVO 68378050) MA-J, een GA UK fellowship (project nr. 341015) van de Karelsuniversiteit in Praag MK, en een fellowship GA UK (project nr. 1278217) van de Karelsuniversiteit in Praag te PD.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
RPMI 1640 poedermediumMerck, Kenilworth, NJ, USAT 121-10zonder NaHCO3, met L-glutamine
DMEMThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA15028
Opti-MEM I Reduced Serum MediumThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA31985-047L-Glutamine, Fenol Rood
Foetaal runderserum (FBS)PAA Laboratories (GE Healthcare,Chicago, IL, USA)MT35011CVVoor differentiatie van 32D/G-CSF-R cellen
Foetaal runderserum (FBS)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA10270Gebruikt voor het kweken van HEK293T, NIH3T3, BOSC23 cellen
PenicillineSigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)P3032
StreptomycineSigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)S9137Streptomycine sulfaat zout poeder
GentamicineSigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)G1914
Murine IL-3PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA213-13
Human G-CSFPeproTech, Rocky Hill, NJ, USA300-23
PolyethyleenimidePolyscience, Warrington, PA, USA23966Lineair, MW 25.000 (PEI 25000)
PolybreenSigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)H9268
TrypsineVWR Chemicals, Radnor, PA, USA0458
EDTASigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)E5134
KristalkobaltSigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)C0775
TrypaanblauwSigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)T6146
Dimethyl sulfaat (DMSO)Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)D2650
May-Grünwald GiemsaDiaPath, Martinengo, BG, Italië10802

Referenties

  1. Bonilla, M. A., et al. Effects of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor on neutropenia in patients with congenital agranulocytosis. N Engl J Med. 320 (24), 1574-1580 (1989).
  2. Bennett, C. L., Djulbegovic, B., Norris, L. B., Armitage, J. O. Colony-stimulating factors for febrile neutropenia during cancer therapy. N Engl J Med. 368 (12), 1131-1139 (2013).
  3. Lowenberg, B., Downing, J. R., Burnett, A. Acute myeloid leukemia. N Engl J Med. 341 (14), 1051-1062 (1999).
  4. Dong, F., et al. Identification of a nonsense mutation in the granulocyte-colony-stimulating factor receptor in severe congenital neutropenia. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (10), 4480-4484 (1994).
  5. Rosenbauer, F., Tenen, D. G. Transcription factors in myeloid development: balancing differentiation with transformation. Nat Rev Immunol. 7 (2), 105-117 (2007).
  6. Kota, J., Caceres, N., Constantinescu, S. N. Aberrant signal transduction pathways in myeloproliferative neoplasms. Leukemia. 22 (10), 1828-1840 (2008).
  7. Kvinlaug, B. T., et al. Common and overlapping oncogenic pathways contribute to the evolution of acute myeloid leukemias. Cancer Res. 71 (12), 4117-4129 (2011).
  8. Krug, U., Ganser, A., Koeffler, H. P. Tumor suppressor genes in normal and malignant hematopoiesis. Oncogene. 21 (21), 3475-3495 (2002).
  9. Greenberger, J. S., Sakakeeny, M. A., Humphries, R. K., Eaves, C. J., Eckner, R. J. Demonstration of permanent factor-dependent multipotential (erythroid/neutrophil/basophil) hematopoietic progenitor cell lines. Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (10), 2931-2935 (1983).
  10. Valtieri, M., et al. Cytokine-dependent granulocytic differentiation. Regulation of proliferative and differentiative responses in a murine progenitor cell line. J Immunol. 138 (11), 3829-3835 (1987).
  11. Dong, F., et al. Mutations in the gene for the granulocyte colony-stimulating-factor receptor in patients with acute myeloid leukemia preceded by severe congenital neutropenia. N Engl J Med. 333 (8), 487-493 (1995).
  12. Jorda, M. A., Lowenberg, B., Delwel, R. The peripheral cannabinoid receptor Cb2, a novel oncoprotein, induces a reversible block in neutrophilic differentiation. Blood. 101 (4), 1336-1343 (2003).
  13. Jorda, M. A., et al. Hematopoietic cells expressing the peripheral cannabinoid receptor migrate in response to the endocannabinoid 2-arachidonoylglycerol. Blood. 99 (8), 2786-2793 (2002).
  14. Abbas, S., et al. Integrated genome-wide genotyping and gene expression profiling reveals BCL11B as a putative oncogene in acute myeloid leukemia with 14q32 aberrations. Haematologica. 99 (5), 848-857 (2014).
  15. Zhuang, D., Qiu, Y., Kogan, S. C., Dong, F. Increased CCAAT enhancer-binding protein epsilon (C/EBPepsilon) expression and premature apoptosis in myeloid cells expressing Gfi-1 N382S mutant associated with severe congenital neutropenia. J Biol Chem. 281 (16), 10745-10751 (2006).
  16. Zjablovskaja, P., et al. EVI2B is a C/EBPalpha target gene required for granulocytic differentiation and functionality of hematopoietic progenitors. Cell Death Differ. 24 (4), 705-716 (2017).
  17. Santini, V., et al. The carboxy-terminal region of the granulocyte colony-stimulating factor receptor transduces a phagocytic signal. Blood. 101 (11), 4615-4622 (2003).
  18. Liu, H., Qiu, Y., Xiao, L., Dong, F. Involvement of protein kinase Cepsilon in the negative regulation of Akt activation stimulated by granulocyte colony-stimulating factor. J Immunol. 176 (4), 2407-2413 (2006).
  19. Kelly, L. M., et al. FLT3 internal tandem duplication mutations associated with human acute myeloid leukemias induce myeloproliferative disease in a murine bone marrow transplant model. Blood. 99 (1), 310-318 (2002).
  20. Pikman, Y., et al. MPLW515L is a novel somatic activating mutation in myelofibrosis with myeloid metaplasia. PLoS Med. 3 (7), e270(2006).
  21. Schwaller, J., et al. Transformation of hematopoietic cell lines to growth-factor independence and induction of a fatal myelo- and lymphoproliferative disease in mice by retrovirally transduced TEL/JAK2 fusion genes. EMBO J. 17 (18), 5321-5333 (1998).
  22. Drobek, A., et al. PSTPIP2, a Protein Associated with Autoinflammatory Disease, Interacts with Inhibitory Enzymes SHIP1 and Csk. J Immunol. 195 (7), 3416-3426 (2015).
  23. Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. J Virol. 70 (8), 5701-5705 (1996).
  24. Alberich-Jorda, M., et al. C/EBPgamma deregulation results in differentiation arrest in acute myeloid leukemia. J Clin Invest. 122 (12), 4490-4504 (2012).
  25. Calabretta, B., Perrotti, D. The biology of CML blast crisis. Blood. 103 (11), 4010-4022 (2004).
  26. Ren, R. Mechanisms of BCR-ABL in the pathogenesis of chronic myelogenous leukaemia. Nat Rev Cancer. 5 (3), 172-183 (2005).
  27. Schuster, C., et al. The effects of Bcr-Abl on C/EBP transcription-factor regulation and neutrophilic differentiation are reversed by the Abl kinase inhibitor imatinib mesylate. Blood. 101 (2), 655-663 (2003).
  28. Chang, J. S., et al. High levels of the BCR/ABL oncoprotein are required for the MAPK-hnRNP-E2 dependent suppression of C/EBPalpha-driven myeloid differentiation. Blood. 110 (3), 994-1003 (2007).
  29. Velten, L., et al. Human haematopoietic stem cell lineage commitment is a continuous process. Nat Cell Biol. 19 (4), 271-281 (2017).
  30. Jorda, M. A., Rayman, N., Valk, P., De Wee, E., Delwel, R. Identification, characterization, and function of a novel oncogene: the peripheral cannabinoid receptor Cb2. Ann N Y Acad Sci. 996, 10-16 (2003).
  31. Wurm, A. A., et al. Disruption of the C/EBPalpha-miR-182 balance impairs granulocytic differentiation. Nat Commun. 8 (1), 46(2017).
  32. Agliano, A. M., et al. On chromosomal instability: what is the karyotype of your 32D CI3 cell line. Blood. 95 (11), 3636-3637 (2000).
  33. Wang, G. G., et al. Quantitative production of macrophages or neutrophils ex vivo using conditional Hoxb8. Nat Methods. 3 (4), 287-293 (2006).
  34. Houston, I. B., Huang, K. J., Jennings, S. R., DeKoter, R. P. PU.1 immortalizes hematopoietic progenitors in a GM-CSF-dependent manner. Exp Hematol. 35 (3), 374-384 (2007).
  35. Calvo, K. R., Sykes, D. B., Pasillas, M., Kamps, M. P. Hoxa9 immortalizes a granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-dependent promyelocyte capable of biphenotypic differentiation to neutrophils or macrophages, independent of enforced meis expression. Mol Cell Biol. 20 (9), 3274-3285 (2000).
  36. Calvo, K. R., Sykes, D. B., Pasillas, M. P., Kamps, M. P. Nup98-HoxA9 immortalizes myeloid progenitors, enforces expression of Hoxa9, Hoxa7 and Meis1, and alters cytokine-specific responses in a manner similar to that induced by retroviral co-expression of Hoxa9 and Meis1. Oncogene. 21 (27), 4247-4256 (2002).
  37. Fossati-Jimack, L., et al. Phagocytosis is the main CR3-mediated function affected by the lupus-associated variant of CD11b in human myeloid cells. PLoS One. 8 (2), e57082(2013).
  38. Schwable, J., et al. RGS2 is an important target gene of Flt3-ITD mutations in AML and functions in myeloid differentiation and leukemic transformation. Blood. 105 (5), 2107-2114 (2005).
  39. Worch, J., et al. The serine-threonine kinase MNK1 is post-translationally stabilized by PML-RARalpha and regulates differentiation of hematopoietic cells. Oncogene. 23 (57), 9162-9172 (2004).
  40. Rowley, J. D. Letter: A new consistent chromosomal abnormality in chronic myelogenous leukaemia identified by quinacrine fluorescence and Giemsa staining. Nature. 243 (5405), 290-293 (1973).
  41. Stam, K., et al. Evidence of a new chimeric bcr/c-abl mRNA in patients with chronic myelocytic leukemia and the Philadelphia chromosome. N Engl J Med. 313 (23), 1429-1433 (1985).
  42. Holly, S. P., Larson, M. K., Parise, L. V. The unique N-terminus of R-ras is required for Rac activation and precise regulation of cell migration. Mol Biol Cell. 16 (5), 2458-2469 (2005).
  43. Pierce, J. H., et al. Macrophage-colony-stimulating factor (CSF-1) induces proliferation, chemotaxis, and reversible monocytic differentiation in myeloid progenitor cells transfected with the human c-fms/CSF-1 receptor cDNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (15), 5613-5617 (1990).
  44. Pierce, J. H., et al. Signal transduction through the EGF receptor transfected in IL-3-dependent hematopoietic cells. Science. 239 (4840), 628-631 (1988).
  45. Oomen, S. P., et al. Somatostatin modulates G-CSF-induced but not interleukin-3-induced proliferative responses in myeloid 32D cells via activation of somatostatin receptor subtype 2. Hematol J. 2 (5), 322-329 (2001).
  46. Oomen, S. P., et al. Somatostatin is a selective chemoattractant for primitive (CD34(+)) hematopoietic progenitor cells. Exp Hematol. 30 (2), 116-125 (2002).
  47. Nogami, A., et al. FLT3-ITD confers resistance to the PI3K/Akt pathway inhibitors by protecting the mTOR/4EBP1/Mcl-1 pathway through STAT5 activation in acute myeloid leukemia. Oncotarget. 6 (11), 9189-9205 (2015).
  48. Rodel, J. E., Link, D. C. Suppression of apoptosis during cytokine deprivation of 32D cells is not sufficient to induce complete granulocytic differentiation. Blood. 87 (3), 858-864 (1996).
  49. Daley, G. Q., Baltimore, D. Transformation of an interleukin 3-dependent hematopoietic cell line by the chronic myelogenous leukemia-specific P210bcr/abl protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 85 (23), 9312-9316 (1988).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

32D G CSF R cellenproliferatie en differentiatie assaysneutrofiele differentiatielentivirale en retrovirale transductiecytokinedependente cellijngenetische manipulatiestudiesflowcytometrie analyseMay Gr nwald Giemsa kleuringRPMI 1640 medium

Gerelateerde artikelen