Methodenartikel

Een Time-lapse, Label-vrije, kwantitatieve fase Imaging studie van slapende en actieve menselijke kankercellen

DOI:

10.3791/57035

⸱

16 februari 2018

 ,  , 
1Vascular Biology Program, Boston Children's Hospital, 2Department of Surgery, Harvard Medical School and Boston Children's Hospital

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Slapende en actieve kanker cel fenotypen werden gekenmerkt met behulp van kwantitatieve fase imaging. Cel proliferatie, migratie en morfologie assays werden geïntegreerd en geanalyseerd in één eenvoudige methode.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De overname van het fenotype van de angiogenic is een essentieel onderdeel van de ontsnapping uit de tumor rustperiode. Hoewel verschillende klassieke in vitro testen (bijvoorbeeld, proliferatie, migratie en anderen) en in vivo modellen zijn ontwikkeld om te onderzoeken en karakteriseren van angiogenic en niet-angiogenic cel fenotypen, zijn deze methoden tijd en intensieve arbeid, en vereisen vaak dure reagentia en instrumenten, alsmede aanzienlijke deskundigheid. In een recente studie gebruikten we een nieuwe kwantitatieve fase imaging (QPI) techniek te voeren time-lapse en labeling-gratis karakterisaties voor angiogenic en niet-angiogenic menselijke Osteosarcoom KHOS cellen. Een panel van cellulaire parameters, met inbegrip van de morfologie van de cel proliferatie en motiliteit, werden kwantitatief gemeten en geanalyseerd met behulp van QPI. Deze roman en kwantitatieve benadering biedt de mogelijkheid om voortdurend en niet-gebeurt studie relevante cellulaire processen, gedrag, en kenmerken van kankercellen en andere celtypes in een eenvoudige en geïntegreerde wijze. Dit verslag beschrijft onze experimentele protocol, met inbegrip van de voorbereiding van de cel, QPI acquisitie en data-analyse.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een van de vroegste controlepunten in de ontwikkeling en de vooruitgang van een solide tumor is de overname van het fenotype van de angiogenic, een kenmerk van kanker. Deze progressie omvat allerlei biochemische en moleculaire processen1,2,3. Een technische uitdaging in de studie van deze belangrijke stap in de tumor progressie is het gebrek aan tools om continu en kwantitatief karakteriseren en onderscheid maken tussen angiogenic en niet-angiogenic fenotypes van levende kankercellen op onpartijdige wijze. De traditionele testen wordt gebruikt om te onderzoeken het cellulaire gedrag van angiogenic en niet-angiogenic cellen meestal dure reagentia en instrumenten vereisen, bijvoorbeeld cel proliferatie/migratie testen4,5, 6,7,8,9,10,11,12,13,14 of aanvullende in-vivo evaluaties4,5,6,8,15,16, evenals vereisen aanzienlijke expertise en intensieve tijd en arbeid consumptie.

Onlangs, kwantitatieve fase imaging (QPI) heeft ontpopt als een nieuwe techniek waarmee time-lapse en labeling-vrije beoordeling van een verscheidenheid van cel morfologie en gedrag parameters17,18,19, 20 , 21 , 22. in tegenstelling tot conventionele optische microscopie, QPI kwantificeert variaties van faseverschuiving pixel voor pixel nadat licht een optische object passeert, en een holograaf reconstrueert met geconverteerde optische dikte en volume, waardoor de directe analyse van levende cellen en de volgende functies: (1) kwantitatieve beeldvorming, (2) niet-invasieve en time-lapse imaging, beeldvorming (3) label-vrij, en (4) gelijktijdige Multi-parameter imaging. Deze eigenschappen maken QPI een krachtig hulpmiddel om te beoordelen en begrijpen van pathologische processen op cellulair niveau.

In een recente studie, die we gebruikt QPI kwantitatief karakteriseren en onderscheid maken tussen angiogenic KHOS-A en niet-angiogenic KHOS-N fenotypes van menselijke Osteosarcoom cellen op een systematische en kwantitatieve wijze combineren van analyses van cel morfologie, proliferatie, en motiliteit23. Met behulp van de software van de analyse van de afbeelding, een panel van cel morfologische en gedrag parameters werden kwantitatief vergeleken tussen angiogenic en niet-angiogenic menselijke Osteosarcoom cellen en vijf kenmerkende verschillen tussen deze twee werden geïdentificeerd fenotypen. Deze nieuwe benadering biedt een geïntegreerde en kwantitatieve platform voor de beoordeling van een verscheidenheid aan biologisch relevante cellulaire kenmerken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle methoden die hier worden beschreven zijn door de Boston Children's Hospital institutionele bioveiligheid Comité goedgekeurd.

1. cel voorbereiding

  1. Ontdooien KHOS-A en -N cellen
    1. Opwarmen kweekmedium, dat wil zeggen, de Dulbecco bewerkt Eagle medium aangevuld met 10% (vol/vol) foetaal kalfsserum (FBS) en 1% (vol/vol) penicilline/streptomycine.
    2. Nemen van de cryogene flesjes van cellen uit de vloeibare stikstof tank, de onderkant van de flesjes onderdompelen in warm water in een waterbad 37 ° C en zachtjes schudden de cryogene flesjes om het ontdooien te versnellen. Houd het deksel van cryogene flesjes contact met water om besmetting te voorkomen. Zodra de cellen worden ontdooid, steriliseren de cryogene flacon in 70% ethanol oplossing spuiten en de flacon af te vegen.
    3. In een laminaire flow hood, onmiddellijk de celsuspensie van de cryogene flacon gecombineerd en zachtjes schorten in 10 mL opgewarmd kweekmedium (beschreven in 1.1.1). Centrifugeer cel schorsingen bij ongeveer 200 x g gedurende 5-7 min.
    4. Resuspendeer de pellet cel met 10 mL opgewarmd cultuurmedium en breng in een maatkolf T75. Pipetteer zachtjes meermaals op te schorten cellen gelijkmatig met behulp van een pipet 10 mL.
    5. Plaats de kolf in een incubator 37 ° C met 5% (vol/vol) CO2 en bevochtigde sfeer. Cellen toevoegen voor ten minste 12 uur toestaan.
    6. Incubeer de cellen gedurende ongeveer 3-7 dagen tot 80-100% heuvels. Het kweekmedium elke 2-3 dagen wijzigen.
  2. Splitsen van KHOS-A en -N cellen
    1. Verwijder het medium van de cultuur van de kolf.
    2. De cellen met 5 mL steriele PBS te wassen (1 x) zonder calcium en magnesium, niet Adherente cellen of breuk te verwijderen.
    3. Voeg 1 mL 0,05% trypsine-EDTA-oplossing in de kolf en kort swirl de kolf om ervoor te zorgen dat de trypsine-EDTA gelijkmatig is verspreid.
    4. Laat de kolf gedurende 2-3 min in een incubator 37 ° C of 3-5 min bij kamertemperatuur inwerken. Controleer de cellen onder een microscoop op ongeveer 400 x vergroting om ervoor te zorgen dat de cellen zijn afgerond en vrijstaand.
    5. Zodra de cellen worden losgemaakt, toevoegen van 10 mL gestolde voedingsbodem en zachtjes Pipetteer het medium op en neer meerdere malen te breken cel aggregaten in een enkele celsuspensie, met behulp van een pipet 10 mL.
    6. Cellen tellen met behulp van een cel counter. Beënt de celsuspensie in nieuwe T75 kolven op een bevolkingsdichtheid van 2 × 10-6 cellen of een verhouding van 1:4.
    7. Cellen groeien tot 80-100% samenkomst vóór het zaaien voor de QPI experiment toestaan.
  3. Zaaien van KHOS-A en -N cellen voor QPI
    1. Zaad KHOS-A en -N cellen in 6-Wells-platen op de dichtheid van 50.000-300.000 cellen per putje met 5 mL gestolde voedingsbodem na tellen met een teller van de cel.
      Opmerking: De seeding dichtheid is afhankelijk van de snelheid van de cel proliferatie, en de beeldvorming periode om < 100% samenvloeiing tijdens imaging acquisitie.
    2. Incubeer de cellen gedurende ten minste 12 uur om bijlage.
    3. Het medium met verse media vóór het uitvoeren van QPI wijzigen

2. QPI overname

  1. Cover slip instellen
    1. De cover slip door meerdere keren te spoelen met stromend gedeïoniseerd water reinigen en steriliseren met 75% ethanol oplossing door onderdompeling gedurende 15 minuten de cover slip gestoken met een steriele laminar flow hood te drogen.
    2. Zorgvuldig plaatst de cover slip op een 6-well bord om te voorkomen dat duidelijk bubbels. Zorg ervoor dat de onderkant van de cover slip is ondergedompeld in de cultuur-media (minimaal 5 mL/putje).
    3. Plaats de plaat in de incubator (37 ° C, 5% CO2en bevochtigde sfeer) equilibreer gedurende ten minste 15 minuten. Als mist op de cover slip vormt, gebruik een steriel katoenen doekje te vegen het schoon.
  2. Cellen Imaging met een Microscoop
    1. Open de software om te initialiseren van het systeem, inclusief zelf kalibratie van belichtingstijd, patroon contrast en hologram ruis. Zorg ervoor dat de waarden worden ingesteld (afgebeeld in groen of geel bereik).
    2. Plaats de plaat 6-well op het podium van de QPI Microscoop.
    3. Klik op 'Capture Live', en selecteer "Manual" in "Software focus." Grof richten de beelden van de fase van cellen door het aanpassen van de afstand van het werk in "Microscoop instelling" te verkrijgen van contouren voor alle cellen in fase beelden. Wijzigen in "Automatische" in "Software focus."
    4. Klik op "Nieuw experiment" een nieuw experiment maken. Begin met de selectie van afbeelding overname posities met de muis of de pijltoetsen op het numerieke pad. Klik op "Remember" na elke selectie. Normaal gesproken worden 3-5 locaties voor elk monster geselecteerd.
    5. Instellen van de imaging-intervallen en de periode in de sectie "Timelapse".
      Opmerking: Als u wilt bijhouden kankercellen duidelijk, de intervallen moet korter zijn dan 5 min. 48 uur is ingesteld als de periode voor de combinatie QPI analyse.
    6. Start het experiment door te klikken op 'Capture', die automatisch zal concentreren en het verwerven van de beelden op de tijdstippen van de instelling.

3. de gegevensanalyse

  1. Cel morfologie analyse
    1. Klik op "Identificeren cellen." Aanpassen van de numerieke instelling voor "Achtergrond drempel", zodat de cel gebieden goed van achtergrondgeluiden zijn gescheiden. Het nummer van de instelling van "De grootte van het Object" aanpassen om ervoor te zorgen dat elke cel een kern heeft. Behoud consistente parameters voor monsters die worden vergeleken, moeten zoals deze van invloed kunnen zijn op de laatste metingen van oppervlakte en volume. Handmatig wijzigen cel segmenten met behulp van "Handmatige wijzigingen," indien nodig.
    2. Gebruik de functie "Analyseren gegevens" in de software voor het analyseren van de cellen. Een nieuwe data-analyse starten door te klikken op "Nieuwe analyse." Sleep geselecteerde afbeeldingen naar de "Bron frames" tabblad en cel morfologie parameters waaronder cel gebied (µm2), optische dikte (µm) en volume (µm3) voor elke afzonderlijke cel. Scatter plot of histogram modus en export gegevens als tabellen of figuren kiezen.
  2. Cel proliferatie analyse
    1. Selecteer ten minste 5 afbeeldingen voor de verschillende tijd-points of interest (b.v., eerste, 12 h, 24 h, 36 h, en 48 uur). Record cel nummers die zijn verstrekt door de software.
    2. Als u wilt schatten de verdubbeling tijd, plot cel nummers na normaliseren met de eerste nummers en passen bij exponentiële groei bochten.
  3. Cel bewegingsanalyse
    1. Gebruik de "Track cellen" functie in de software. Klik op "Nieuwe analyse" om te beginnen met een nieuwe data-analyse. 10-30 cellen kiezen slepen serie opnamen voor een geselecteerde periode (bijvoorbeeld, 4 h na 24 uur incubatie) in het "Bron frames" tab. willekeurig door op cellen te klikken onder de selectiemodus "Cellen toevoegen". Uitsluiten van de cellen aan de randen en de verhuizing van het gezichtsveld.
    2. Controleer zorgvuldig het volgen in de reeks van beelden. In het geval dat het systeem spoor van een cel verliest of de verkeerde cel worden bijgehouden, pas handmatig de tracking-cel door te klikken op "Identificeren" ter identificatie van de cellen of te klikken op "Wijzig locatie" onder de "Select" modus te wijzigen van de locatie van de cel.
    3. Kies roos plot van cel trajecten in "Plot beweging" of perceel voor de andere beweging-gerelateerde parameters in 'Plot functies,' zoals motiliteit snelheid (µm/h), motiliteit (µm), migratie (µm) en migratie directheid. Gegevens exporteren als tabellen of figuren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Figuur 1 toont een typische cel morfologie karakterisering. Afbeeldingen worden gepresenteerd als holographs (figuur 1A-B) en 2D-afbeeldingen (Figuur 1 c-D). Optische cel diktes (berekend op basis van de brekingsindex en optische weglengte) zijn gekwantificeerd via lijn-profiel of een hele cel meting. Scatter percelen van het gebied en de dikte van KHOS-A en KHOS-N c...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In deze studie beschrijven we een in vitro, niet-invasieve en label-vrije methode QPI met kwantitatief karakteriseren de fenotypen van het angiogenic en niet-angiogenic van menselijke Osteosarcoom cellen. Meerdere cellulaire parameters hebben gelijktijdig met deze geïntegreerde, hoge-doorvoer methode, met inbegrip van cel gebied, de dikte van de cel, cel volume, proliferatie tarief, verdubbeling van de tijd, migratie directheid, beweeglijkheid, snelheid, migratie en motiliteit is geanalyseerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geen belangenconflicten verklaard.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs mijn dankbaarheid uitspreken voor de steun van de Breast Cancer Research Foundation en de Advanced Medical Research Foundation.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
T75 flaconCorning, NY, USA353136
6-well platen Corning, NY, USA3506
Dulbecco’s gemodificeerd Eagle-medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific, MA, USA11965092
Foetaal bovien serum (FBS) Atlanta Biologicals, GA, USAS11550
Penicilline StreptomycineThermo Fisher Scientific, MA, USA15140122
Fosfaat buffer oplossing (PBS)Thermo Fisher Scientific, MA, USA10010023
Beckman Z1 Coulter tellerBeckman Coulter, IN, USAZ1 
HoloMonitor M4Phase Holographic Imaging Phi AB, Lund, ZwedenM4Microscoop
HololidPhase Holographic Imaging Phi AB, Lund, ZwedenPHI 8020
HStudioM4Phase Holographic Imaging Phi AB, Lund, ZwedenHStudioM4Software

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Folkman, J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease. Nature Medicine. 1 (1), 27-31 (1995).
  2. Hanahan, D., Folkman, J. Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis. Cell. 86 (3), 353-364 (1996).
  3. Harper, J., Moses, M. A. Molecular regulation of tumor angiogenesis: mechanisms and therapeutic implications. EXS. (96), 223-268 (2006).
  4. Naumov, G. N., et al. A model of human tumor dormancy: an angiogenic switch from the nonangiogenic phenotype. Journal of the National Cancer Institute. 98 (5), 316-325 (2006).
  5. Fang, J., et al. Matrix metalloproteinase-2 is required for the switch to the angiogenic phenotype in a tumor model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (8), 3884-3889 (2000).
  6. Almog, N., et al. Transcriptional switch of dormant tumors to fast-growing angiogenic phenotype. Cancer Research. 69 (3), 836-844 (2009).
  7. Hu, J., et al. Gene expression signature for angiogenic and nonangiogenic non-small-cell lung cancer. Oncogene. 24 (7), 1212-1219 (2005).
  8. Harper, J., et al. Repression of vascular endothelial growth factor expression by the zinc finger transcription factor ZNF24. Cancer Research. 67 (18), 8736-8741 (2007).
  9. Jia, D., et al. Transcriptional repression of VEGF by ZNF24: mechanistic studies and vascular consequences in vivo. Blood. 121 (4), 707-715 (2013).
  10. Jia, D., Huang, L., Bischoff, J., Moses, M. A. The endogenous zinc finger transcription factor, ZNF24, modulates the angiogenic potential of human microvascular endothelial cells. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 29 (4), 1371-1382 (2015).
  11. Almog, N., et al. Prolonged dormancy of human liposarcoma is associated with impaired tumor angiogenesis. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 20 (7), 947-949 (2006).
  12. Almog, N., et al. Consensus micro RNAs governing the switch of dormant tumors to the fast-growing angiogenic phenotype. PloS One. 7 (8), e44001(2012).
  13. Satchi-Fainaro, R., et al. Prospective identification of glioblastoma cells generating dormant tumors. PloS One. 7 (9), e44395(2012).
  14. Almog, N., et al. Transcriptional changes induced by the tumor dormancy-associated microRNA-190. Transcription. 4 (4), 177-191 (2013).
  15. Gao, D., Nolan, D. J., Mellick, A. S., Bambino, K., McDonnell, K., Mittal, V. Endothelial progenitor cells control the angiogenic switch in mouse lung metastasis. Science. 319 (5860), New York, N.Y. 195-198 (2008).
  16. Folkman, J., Watson, K., Ingber, D., Hanahan, D. Induction of angiogenesis during the transition from hyperplasia to neoplasia. Nature. 339 (6219), 58-61 (1989).
  17. Popescu, G. Quantitative phase imaging of cells and tissues. , McGraw-Hill: New York. (2011).
  18. Lee, K., et al. Quantitative Phase Imaging Techniques for the Study of Cell Pathophysiology: From Principles to Applications. Sensors. 13 (4), 4170-4191 (2013).
  19. Mir, M., Bhaduri, B., Wang, R., Zhu, R., Popescu, G. Quantitative Phase Imaging. Progress in Optics. 57, 133-217 (2012).
  20. Marrison, J., Räty, L., Marriott, P., O'Toole, P. Ptychography--a label free, high-contrast imaging technique for live cells using quantitative phase information. Scientific Reports. 3, 2369(2013).
  21. Falck Miniotis, M., Mukwaya, A., Gjörloff Wingren, A. Digital holographic microscopy for non-invasive monitoring of cell cycle arrest in L929 cells. PloS One. 9 (9), e106546(2014).
  22. Popescu, G., et al. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. AJP: Cell Physiology. 295 (2), C538-C544 (2008).
  23. Guo, P., Huang, J., Moses, M. A. Characterization of dormant and active human cancer cells by quantitative phase imaging. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Advancement of Cytometry. 91 (5), 424-432 (2017).
  24. Mir, M., Bergamaschi, A., Katzenellenbogen, B. S., Popescu, G. Highly sensitive quantitative imaging for monitoring single cancer cell growth kinetics and drug response. PloS One. 9 (2), e89000(2014).
  25. Mir, M., Tangella, K., Popescu, G. Blood testing at the single cell level using quantitative phase and amplitude microscopy. Biomedical Optics Express. 2 (12), 3259-3266 (2011).
  26. Park, Y., et al. Measurement of red blood cell mechanics during morphological changes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (15), 6731-6736 (2010).
  27. Pham, H. V., Bhaduri, B., Tangella, K., Best-Popescu, C., Popescu, G. Real time blood testing using quantitative phase imaging. PloS One. 8 (2), e55676(2013).
  28. Sridharan, S., Macias, V., Tangella, K., Kajdacsy-Balla, A., Popescu, G. Prediction of prostate cancer recurrence using quantitative phase imaging. Scientific Reports. 5, 9976(2015).
  29. Park, H., et al. Measuring cell surface area and deformability of individual human red blood cells over blood storage using quantitative phase imaging. Scientific Reports. 6, 34257(2016).
  30. Bishitz, Y., Gabai, H., Girshovitz, P., Shaked, N. T. Optical-mechanical signatures of cancer cells based on fluctuation profiles measured by interferometry. Journal of Biophotonics. 7 (8), 624-630 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Time lapse ImagingCell Morphology AnalysisProliferation Rate MeasurementMotility Speed TrackingAngiogenic Phenotype CharacterizationNon angiogenic Phenotype CharacterizationHuman Osteosarcoma CellsLabel free ImagingCancer Cell Dormancy

Gerelateerde artikelen