Methodenartikel

Behandeling van Monosynaptic verbindingen in Drosophila met behulp van resistente tetrodotoxine natrium kanalen

9.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/57052

⸱

14 februari 2018

 , 
1Department of Biology, University of Maryland

In dit artikel

Samenvatting

Dit artikel biedt een methode om te testen de monosynaptic verbindingen tussen neuronen door tetrodotoxine en het tetrodotoxine-resistente natrium-kanaal, NaChBac.

Samenvatting

Hier, wordt een nieuwe techniek genoemd Tetrotoxin (TTX) Engineered weerstand voor indringende Synapses (kerken) toegepast om te testen voor monosynaptic verbindingen tussen neuronen van de doelgroep. De methode is gebaseerd op co uitdrukking van een transgene activator met het tetrodotoxine-resistente natrium-kanaal, NaChBac, in een specifieke presynaptische neuron. Verbindingen met vermeende post synaptic partners worden bepaald door geheel-cel opnames in aanwezigheid van de TTX, die blokken van elektrische activiteit in de neuronen die niet NaChBac doen uitdrukken. Deze aanpak kan worden aangepast voor het werken met elke activator of calcium imaging als een verslaggever van verbindingen. KERKEN wordt toegevoegd aan de groeiende verzameling van hulpprogramma's voor het bepalen van de connectiviteit binnen netwerken. KERKEN is echter uniek in die zin dat zij ook betrouwbaar bulk of volume transmissie en spill-over transmissie verslag.

Inleiding

Een belangrijk doel van de neurowetenschappen is om de verbindingen tussen neuronen te begrijpen hoe informatie stroomt door schakelingen in kaart. Talrijke benaderingen en middelen zijn beschikbaar om te testen voor functionele verbindingen tussen neuronen in een waaier van model systemen1,2gekomen. Voor het genereren van de meest nauwkeurige schakelschema's met behulp van electrofysiologie, is het belangrijk om op te lossen of waargenomen verbindingen tussen twee cellen directe en monosynaptic versus indirecte en polysynaptic zijn. Een gouden standaard voor het maken van dit onderscheid in zoogdieren neuronen is voor het meten van de latentie tussen enkele action potentials in de presynaptische cellen en het begin van excitatory postsynaptisch stromingen (EPSCs) in het tweede neuron. Monosynaptic verbindingen moeten korte latencies voor een paar milliseconden en lage variabiliteit3. Deze aanpak kan worden gecompliceerd in ongewervelde neuronen omdat synapsen op in hun dendrites ver van de somatische opname site treedt, veroorzaakt door vertragingen in de opsporing als gevolg van lange electrotonic afstanden tussen postsynaptisch conductances en de opname elektrode. Dergelijke vertragingen kunnen leiden tot dubbelzinnigheid over poly-versus monosynaptic bijdragen. Bovendien, kleine synaptic gebeurtenissen kan verval alvorens de site somatische opnames en rijden sterker presynaptische activiteit, dreigt te werven van polysynaptic evenementen.

Diverse technieken zijn ontwikkeld om te testen voor monosynaptic verbindingen in ongewervelden. Een benadering gebruikt hoge divalente kationen oplossingen (Hi-Di) met overtollige Mg++ en Ca++. Deze oplossing blokkeert polysynaptic verbindingen op vermindering release waarschijnlijkheid en toenemende actiepotentiaal drempel om de gunst van de detectie van monosynaptic input4,5. Bepaling van de precieze verhouding van Mg++ aan Ca++ vereist, echter, is niet triviaal en zelfs bescheiden stimulatie6polysynaptic bijdragen kunnen aanhouden. Een alternatieve benadering genaamd GFP reconstitutie in Synaptic Partners (greep) maakt gebruik van de nabijheid tussen pre-en postsynaptisch membraan gevonden op synapsen afleiden een monosynaptic verbinding 7. Hier, een onderdeel van de groen fluorescente proteïne (GFP) wordt uitgedrukt in een neuron en de aanvullende fragment van het molecuul wordt uitgedrukt in een vermeende postsynaptisch partner. De aanwezigheid van fluorescentie geeft aan dat de twee neuronen zijn genoeg dicht bij toestaan reconstitutie van het GFP-molecuul en impliceert het bestaan van een synaps. GREEP kunt melden synapsen ten onrechte, hoewel, als twee cellen hebben nauw apposed membranen, zoals in een zenuw of fascicle. Varianten van greep elimineren deze valse positieven door het binden van de presynaptische fragment van GFP rechtstreeks naar synaptobrevin, waardoor de reconstitutie alleen op actieve synapsen8. Terwijl greep en zijn varianten instrumentaal zijn bij het bepalen van de functionele connectiviteit in de Drosophila CNS, kunnen sommige verbindingen niet zichtbaar worden gemaakt door greep als de afstanden tussen de pre- en postsynaptisch partners is relatief groot. Dit is vooral relevant bij de beoordeling van volume transmissie neuromodulatie9 of10remming GABAergic zijn gekoppeld.

Hier blijkt een complementaire en nieuwe techniek voor het testen van directe monosynaptic verbindingen in de Drosophila CNS. Deze methode, genaamd tetrodotoxine Engineered weerstand voor indringende Synapses (kerken), werkt door co uitdrukking van de tetrodotoxine (TTX)-resistente natrium-kanaal, NaChBac en een optogenetic activator in een presynaptische cel tijdens het opnemen van vermeende postsynaptisch partners9. In aanwezigheid van de TTX, wordt alle actiepotentiaal-gemedieerde activiteit onderdrukt in cellen dan die uiting van NaChBac. Het NaChBac kanaal herstelt selectief prikkelbaarheid in de gerichte presynaptische cel(len), synaptische transmissie licht-opgeroepen het toelaat. Deze methode maakt sterke activering van de presynaptische neuronen, zodanig dat verbindingen postsynaptically kunnen worden opgelost door somatische opname terwijl het verminderen van de kans op polysynaptic schakelingen te werven. Nog belangrijker is, is deze techniek maakt de studie van volume transmissie en onthult de verspreiding van zender vrijgelaten uit een enkel neuron in een circuit. Bovendien kan de kerken de chemische aard van de verbinding via conventionele farmacologie onthullen. KERKEN is geschikt voor gebruik in elk modelsysteem waarmee de transgene uitdrukking van TTX-ongevoelig natrium kanalen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Prepareer vliegen en identificeren GAL4 promotor lijnen

  1. Selecteer een regel van de promotor GAL4 en het Kruis met vliegen met zowel de transgenic UAS-NaChBac en een optogenetic transgenic voor activering.
    Opmerking: UAS-CsChrimson11 is geselecteerd vanwege haar hoge geleidbaarheid en het gemak waarmee het NaChBac-gemedieerde actie potentials activeert. Zowel UAS-NaChBac en UAS-CsChrimson zijn beschikbaar via de Repository van de voorraden Bloomington.
  2. All-trans retinal bereiden als een stamoplossing in ethanol (35 mM) en bewaar de oplossing in de diepvries bij-20 ° C.
  3. Mix 28 µL van dit materieel in ongeveer 5 mL gerehydrateerd aardappel vlok voedsel en voeg dit mengsel aan de bovenkant van een flacon van conventionele Drosophila medium.
  4. Volwassen vliegen uiten van csChrimson over voedsel met 0,2 mM all-trans-retinale voor 1-3 dagen11te verhogen.

2. voorbereiding van de TTX voorraad

  1. Het maken van een stamoplossing van 1 mM TTX in gedestilleerd of gedeïoniseerd water. Bewaar deze oplossing in een lab-koelkast voor enkele maanden. Controleer de instellingen beleid met betrekking tot de opslag van TTX zoals vele instellingen TTX als een stof gevaarlijk of gecontroleerde classificeren.

3. Prepareer vliegen electrofysiologie

  1. 1 – 3-daagse oude volwassene vliegt die zijn gerezen op het voedsel met all-trans-retinale verzamelen.
    Nota: Verwijs naar Murthy en Turner in 2013 voor een gedetailleerde beschrijving van de patch klemmen Drosophila neuronen12,13.
  2. Zet de vliegen in een flesje van glas scintillatie. Plaats de ampul op ijs voor 1 min te immobiliseren van de vliegen.
  3. Grof pincet een vlieg in de kamer van een op maat gemaakte opname invoegen gebruiken De kamer bestaat uit een 3 ½" cirkel laser gesneden uit 1/16" acryl. Knip een gat ¾" is in het midden waarop een aangepaste folie is aangesloten met 2-delige epoxy. De folie bevat een driehoekige vorm van hoop dat de vlieg wordt ingevoegd.
  4. Toepassing wax of UV drogende epoxy rond het dier om het stevig veilig binnen de kamer opnemen.
  5. Verlicht de voorbereiding met een zwanenhals optische vezel voor visualisatie onder een stereomicroscoop. De vezels van de zwanenhals voor schuine verlichting instellen door ze aan te passen zodat zij de vlieg rechtstreeks vanaf de kant verlichten.
  6. Pas het lichtniveau aan de laagst mogelijke instelling waarmee nog duidelijk visualisatie van de vlieg. Deze lichtintensiteit zal variëren van individuele experimenten.
    Opmerking: Dit protocol kan worden aangepast met behulp van een in situ hersenen explant methode14.
  7. Opname van externe bron zoutoplossing halen. De saline bevat in mM: 103 NaCl, 3 KCl, 5 N-tris (hydroxymethyl) methyl-2-aminoethane-Sulfonzure zuur, 8 trehalose, 10 glucose, 26 NaHCO3, 1 NaH2PO4, 1.5 CaCl2en 4 MgCl2 (aangepast aan 270-275 mΩ). De saline is borrelen met 95% O2/5% CO2 (carbogen) en heeft een pH aangepast aan 7.315.
  8. 4-6 druppels extracellulaire opname zoutoplossing op de vlieg voorbereiding plaatst. Op dit punt verhogen het lichtniveau bij de dissectie Microscoop voor betere zichtbaarheid.
  9. Verscherpen een wolfraam draad met behulp van elektrolyse. Om de draad, bereid een verzadigde oplossing van KNO3 en toepassen van ongeveer 20 V van AC-stroom terwijl het uiteinde van de draad in de oplossing 20 keer voor elke 100 ms dompelen totdat de tip is verscherpt. Gebruik de aangescherpte wolfraam draad te verwijderen van de epidermis op het hoofd van de vlieg en dus het blootstellen van de hersenen.
  10. Verder bloot de hersenen door het verwijderen van de luchtpijp en vet organen eromheen. Als toegang tot de antennal lobben, kunt een gebogen wolfraam draad of soortgelijke tool zachtjes plooi antennes onder de folie opname kamer om de zichtbaarheid te vergroten. Hiermee kunt u dat scherpe pincet zachtjes scheur weg het gliale omhulsel van het terrein van belang waar de opnames zullen worden gemaakt.
  11. De opname-zaal overbrengen in de elektrofysiologie tuig. Onmiddellijk start perfusie met opname van externe bron saline borrelen met carbogen voor het behoud van de hersenen. Het reservoir van de zoutoplossing wordt geplaatst boven in het werkgebied van de Microscoop en wordt zwaartekracht-gevoed aan de voorbereiding. Gebruik een vacuüm lijn en een erlenmeyer van 2 L te verzamelen het afval zoutoplossing.

4. het verkrijgen van geheel-cel opname

  1. Patch pipetten op een commerciële Pipetteer trekker trek. Raadpleeg de handleiding voor instellingen om een passende Pipetteer met een tip weerstand in de buurt van 7 mΩ.
  2. Voeg 4 µL van interne opnameoplossing in een patch pipet. De interne zoutoplossing bestaat uit 140 kalium aspartaat, 10 HEPES, 4 MgATP, 0,5 Na3GTP, 1 EGTA en 1 KCl in mM.
  3. Patch-clamp versterker voor geheel-cel opname instellen Nul van de versterker verschuiving en stel de versterker te leveren test pulsen. Hier, wordt een AM systemen Patch klem versterker 2.400 gebruikt.
  4. Toepassen van positieve druk via de pipet en aanpak van de cel. Gebruik een micromanipulator om de pipet direct en contact met de cel. Positieve druk vrij. Set het bedrijf potentieel van het membraan tot -60 mV. De pipet dient een zegel van de gigaohm met het celmembraan zoals blijkt uit een lage sub-picoamp huidige bedrijf vormen.
    Opmerking: Als met behulp van GFP geleid cel targeting, probeer te minimaliseren gebruik van epifluorescerende licht ChR2 activering en potentiële synaptic depressie te voorkomen. Ook enkele minuten wachten voordat u stap 5.
  5. Instellen van de versterker test pulsen om van te verlossen -50 mV tot -60 mV. Deze instelling is standaard op patch-clamp versterkers. Test pulsen zal onthullen een grote capacitative van voorbijgaande aard vertegenwoordigen de huidige nodig om te laden van de patch pipet. Verwijder capacitative transiënten door het aanpassen van de capaciteit compensatie knoppen op de AM 2400 of soortgelijke versterker.
  6. Toepassing korte pulsen van negatieve druk te scheuren van de celmembraan en geheel-cel configuratie te verkrijgen.
    Opmerking: De configuratie van een hele cel wordt waargenomen wanneer er een grote stijging van de capacitative transiënten toont de capaciteit van het neuron. Een kleine toename van het huidige bedrijf (basislijn) zal waarschijnlijk ook worden waargenomen. De versterker aan huidige klem modus instellen en aanpassen van de cel kunnen -50 tot -60 mV.

5. de synaptische verbinding testen

  1. Configureren van de data (DAQ)-acquisitiesysteem te activeren van een LED-driver voor het genereren van lichte pulsen. Hier, wordt een nationale instrumenten DAQ-systeem gebruikt met Matlab te leveren van een analoog signaal aan een LED-driver. De LED-intensiteit wordt aangepast via het analoge signaal naar de chauffeur. De LED is een 620-630 nm golflengte LED.
  2. Plaats de high-powered rode LED direct onder de voorbereiding. De lichtintensiteit zodanig aanpassen dat 0.238 mW/mm2 de vlieg bereikt.
  3. Activeren presynaptische neuronen tijdens het opnemen van het postsynaptisch cel van belang. Bereiken van de cel activeren optogenetically, pharmacogentically, of via zenuwstimulatie. Hier, worden csChrimson en korte pulsen van rood licht toegepast.
    Opmerking: Synaptic verbindingen kunnen worden gecontroleerd in het huidige klem als EPSPs of spanning klem als EPSCs. Een synaptische verbinding moet alvorens TTX in reactie op een lichte puls van 40 ms zichtbaar zijn. Als geen verbinding wordt waargenomen, is het onwaarschijnlijk dat de neuronen synaptically aangesloten of mono - of polysynaptically. Het bedrijf potentiële kan worden aangepast om te benadrukken excitatory of inhiberende verbindingen dienovereenkomstig.
  4. Als een verbinding wordt waargenomen in normale zout, TTX toevoegen aan het systeem van de perfusie om een eindconcentratie van 1 µM. gebruik een circulatiepomp voor vastleggen en opnieuw gebruiken van de zoutoplossing om te besparen TTX. De slangenpomp zal de zoutoplossing trekken uit het bad en terug te sturen naar het zoute reservoir.
  5. Pas de snelheid van de pomp om een sterke constante vacuüm dat staat niet toe dat zoute niveau in het bad te stijgen en dalen.
    Opmerking: De toepassing van de TTX moet leiden tot de beëindiging van de activiteit in het neuron die moet worden gecontroleerd in geheel-cel stekelige. Dit bevestigt dat er voldoende TTX is toegevoegd aan de zoutoplossing.
  6. Korte pulsen van rood licht (40 ms voor elke pulse) opnieuw toepassen. Op dit punt een synaptische verbinding die blijft dreigt monosynaptic. Farmacologische antagonisten aan de recirculatie zoutoplossing om te testen de chemische aard van de synaptische verbindingen die blijven in de TTX toevoegen.
    Opmerking: Bij het combineren van optogenetics en fluorescerende targeting van neuronen, mogelijk het belangrijk niet te hardnekkig activeren de presynaptische bevolking van neuronen terwijl het proberen om het verkrijgen van een opname. Dit kan leiden tot synaptic depressie en maakt het moeilijk om te zien van verbindingen. Omdat csChrimson een lange excitatie-band die zich over het algemeen in het bereik van groen fluorescent proteïne heeft uitstrekt, een rode fluorophore kan worden gebruikt voor het visualiseren van de neuronen en channel2rhodopsin (Ch2R) kan worden gebruikt voor het opwekken van cel populaties. Doen vereist specifieke genetica en een aangepast filter kubus. Maken voor het genereren van geschikte vliegen, vliegen die uitdrukking geven aan de rode fluorophore (RFP of mCherry) onder de LexA of Q systeem binaire expressiesystemen. Deze zal moeten worden gekruist met vliegen uiting geven aan de promotor van een Gal4 en UAS-Ch2R en UAS-NaChBac effector genen. De optimale filter kubus voor epifluorescence zal hebben een smalle excitatie-bereik tot prikkelen de rode fluorophore, maar niet prikkelen de Ch2R. Bovendien, een lange pass emissie filter voor het verzamelen van zoveel uitgestraalde licht moet worden opgenomen door de filter set. We gebruikten een aangepast filter instellen vanuit Chroma die opgenomen deel getallen et580/25 x en t600lpxr (uit de 49306 set), maar met een et610lp barrière/emissie filter.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

KERKEN wordt gebruikt om te onderscheiden tussen mono- en polysynaptic bijdragen in synaptic verbindingen tussen neuronen. Terwijl de zwakke stimulatie van een cel kan worden gebruikt voor rechtstreekse verbindingen testen, werft rijden vaak grotere presynaptische activiteit polysynaptic verbindingen (figuur 1A). KERKEN werkt door mede uiting geven aan de TTX-ongevoelig natrium-kanaal NaChBac en een optogenetic-activator, en het testen van verbindingen in aan...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

KERKEN analyse complimenten huidige technieken die worden gebruikt voor circuit kraken doordat de detectie van synapsen tussen geïdentificeerde neuronen. In het bijzonder blijkt de aanpak monosynaptic verbindingen door in grote lijnen silencing actie potentials met TTX wijl restoring prikkelbaarheid in een select aantal neuronen met de TTX-ongevoelig natrium-kanaal NaChBac. Synaptic release wordt opgewekt door stimulatie van de optogenetic terwijl postsynaptisch gebeurtenissen worden gecontroleerd met de opnames van de g...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

We zouden graag bedanken Joshua Singer, Jonathan Schenk, evenals nadenkende reviewers voor opmerkingen op het manuscript. Wij zouden ook willen bedanken Ben White en Harold Zakon voor discussies over de techniek. Jonathan Schenk de gegevens heeft verschaft voor figuur 3A. Dit werk werd gesteund door een subsidie van de Stichting Whitehall en een NIH R21 naar QG.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
UAS-csChrimsonBloomington Drosophila Stock Center55135Wordt gebruikt als neurale activator
UAS-NaChBacBloomington Drosophila Stock Center9466Resotores exciteerbaarheid in cellen in TTX
TetrodotoxinTochris1078Speciale toestemming kan nodig zijn om TTX te kopen, omdat het een gereguleerde stof is
all trans-RetinalSigma-Aldrichall trans-RetinalR2500Vereist co-factor voor channelrhodopsin
Lasbaar 321 roestvrij staal Vel, 0.002" Dik, 10" BreedMcMaster Carr3254K7Wordt gebruikt om een aangepaste vlieghoudster te maken. Aangepaste folie kan worden gelaserd op pololu.com vanuit het geleverde PDF-bestand
DissectiemicroscoopZeissStemi 2000-CWordt gebruikt voor het dissecteren van preparaten
WaxerAlmoreEectra Waxer 66000Wordt gebruikt tijdens dissectie om de vlieg in folie vast te zetten
ParaffinewasJoann4917217Wordt gebruikt met waxer
Nummer 5 tangFine Science Tools#5COWordt gebruikt voor dissectie en het ontdoen van de schede
DissectiescharenFine Science Tools15001-08Wordt gebruikt om delen van de cuticula te verwijderen tijdens dissectie
WolfraamdraadA-M Systems797500Gebruik met elektrolyse om versterkte naalden voor dissectie te maken
Recirkelende peristaltiekpompSimply Pumps (Amazon)PM200Svoor het recyclen van TTX
Snelheidsregelaar voor peristaltiekpompZitrades (Amazon)N/APWM-dimregeling voor LED-verlichting of lint, 12 Volt 8 Amp, instelbare helderheidslichtschakelaar dimmregeling DC12V 8A 96W voor ledstripverlichting B
Versa-Mount Precisie gecomprimeerde luchtregelaarMcMaster Carr1804T1Voor het aanbrengen van positieve druk tijdens het patchen
Glazen capillairenWorld Precision InstrumentsTW150F-3Voor patchpipetten
Multifunctionele meterMcMaster Carr3846K431Meter voor drukregelaar
ElektrofysiologiecameraDage MTI IR-1000Elke camera die werkt in het IR-bereik (850 nm) zal werken. Je wilt geen rode verlichting gebruiken, omdat dit csChrimson kan activeren
IR LEDThorlabs M850F2Voor schuine verlichting
vezeloptiek voor IR LEDThorlabsM89L01Koppelt aan IR LED
Objectieflens Olympus 40XLUMPlanFLNDit kan op de meeste microscopen worden gebruikt en werkt goed voor het visualiseren van vliegneuronen.
Bernstein LEDThorlabsM590L3dVoor het visualiseren van RFP en mCherry
Blauwe LEDThorlabsM470L3dVoor het visualiseren van GFP
GFP-filtersetChroma49011Voor het visualiseren van GFP of het stimuleren van channel2rhodopsin
Aangepast mCherry-filtersetChroma et580/25x en t600lpxr (uit de 49306-set) maar met een et610lp-barrière/emissie-optiekGebruik alleen als u geïdentificeerde neuronen met channel2rhodopsin wilt patchen
Dichroic om Bernstein en blauwe LED te combinerenThorlabsDMLP550RGebruik alleen voor het patchen onder mCherry en het exciteren van channel2rhodopsin met blauw licht.
Rode LEDLEDSupplyCree XPE 620 - 630 nmWordt gebruikt om csChrimson aan te drijven
LED-driverLEDSupply3021-D-E-1000Wordt gebruikt om LED's aan te drijven voor optogenetische stimulatie
ManipulatorSutter InstrumentsMP-225Wordt gebruikt om de pipet tijdens opnames te positioneren
Patchclamp-versterkerA-M SystemsModel 2400Een gelijkwaardige versterker is geschikt
Bessel-filterWarner Instruments LPF 202AAuxiliaire filter dat wordt gebruikt om de stroomspoor naar de oscilloscoop tijdens het patchen te filteren.
Data-acquisitiesysteem National InstrumentsNI PCIe-6321       781044-01Wordt gebruikt om gegevens van de versterker naar de computer op te nemen
Connectorblok - BNC-aansluiting BNC-2090ANational Instruments779556-01Wordt gebruikt om de versterker aan te sluiten op de DAQ-kaart.
Stalen folie McMaster Carr3254K7Stalen folie voor aangepaste opnamekamer
MagnetenK&J MagneticsD42Om de opnamekamer aan de ringsteun vast te zetten
1/16" Cell Cast Acryl ClearPololuWordt gebruikt om een aangepaste opnamekamer te maken. Acryl kan worden gelaserd op pololu.com vanuit het geleverde PDF-bestand

Referenties

  1. Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nat Neurosci. 10, 663-668 (2007).
  2. Yao, Z., Macara, A. M., Lelito, K. R., Minosyan, T. Y., Shafer, O. T. Analysis of functional neuronal connectivity in the Drosophila brain. J Neurophysiol. , 684-696 (2012).
  3. Doyle, M. W., Andresen, M. C. Reliability of monosynaptic sensory transmission in brain stem neurons in vitro. J Neurophysiol. 85, 2213-2223 (2001).
  4. Nicholls, J. G., Purves, D. Monosynaptic chemical and electrical connexions between sensory and motor cells in the central nervous system of the leech. J Physiol-London. 209, 647-667 (1970).
  5. Byrne, J. H., Castellucci, V. F., Kandel, E. R. Contribution of individual mechanoreceptor sensory neurons to defensive gill-withdrawal reflex in Aplysia. J Neurophysiol. 41, 418-431 (1978).
  6. Liao, X., Walters, E. T. The use of elevated divalent cation solutions to isolate monosynaptic components of sensorimotor connections in Aplysia. J Neurosci Meth. 120, 45-54 (2002).
  7. Feinberg, E. H., et al. GFP Reconstitution Across Synaptic Partners (GRASP) Defines Cell Contacts and Synapses in Living Nervous Systems. Neuron. 57, 353-363 (2008).
  8. Macpherson, L. J., et al. Dynamic labelling of neural connections in multiple colours by trans-synaptic fluorescence complementation. Nat Commun. 6, 10024-10029 (2015).
  9. Zhang, X., Gaudry, Q. Functional integration of a serotonergic neuron in the Drosophila antennal lobe. Elife. 5, (2016).
  10. Wilson, R. I. Early olfactory processing in Drosophila: mechanisms and principles. Annu Rev Neurosci. 36, 217-241 (2013).
  11. Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 11, 338-346 (2014).
  12. Murthy, M., Turner, G. C. Whole-cell in vivo patch-clamp recordings in the Drosophila brain. Cold Spring Harb Protoc. , 140-148 (2013).
  13. Murthy, M., Turner, G. C. Dissection of the head cuticle and sheath of living flies for whole-cell patch-clamp recordings in the brain. Cold Spring Harb Protoc. 2013, 134-139 (2013).
  14. Gu, H., O'Dowd, D. K. Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila. J Vis Exp. , (2007).
  15. Wilson, R. I., Turner, G. C., Laurent, G. Transformation of olfactory representations in the Drosophila antennal lobe. Science. 303, 366-370 (2004).
  16. Kazama, H., Wilson, R. I. Homeostatic Matching and Nonlinear Amplification at Identified Central Synapses. Neuron. 58, 401-413 (2008).
  17. Becnel, J., et al. DREADDs in Drosophila: a pharmacogenetic approach for controlling behavior, neuronal signaling, and physiology in the fly. Cell Reports. 4, 1049-1059 (2013).
  18. Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. P Natl Acad Sci USA. 104, 5163-5168 (2007).
  19. Sun, Q. Q., Wang, X., Yang, W. Laserspritzer: A Simple Method for Optogenetic Investigation with Subcellular Resolutions. PLoS One. 9, e101600-e101608 (2014).
  20. Holloway, B. B., et al. Monosynaptic Glutamatergic Activation of Locus Coeruleus and Other Lower Brainstem Noradrenergic Neurons by the C1 Cells in Mice. J Neurosci. 33, 18792-18805 (2013).
  21. Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457, 1142-1145 (2009).
  22. Kloppenburg, P., Ferns, D., Mercer, A. R. Serotonin enhances central olfactory neuron responses to female sex pheromone in the male sphinx moth manduca sexta. J Neurosci. 19, 8172-8181 (1999).
  23. Suster, M. L., Seugnet, L., Bate, M., Sokolowski, M. B. Refining GAL4-driven transgene expression in Drosophila with a GAL80 enhancer-trap. Genesis. 39, 240-245 (2004).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Drosophila neuronenwhole cell registratiesoptogenetische activatietetrodotoxine toedieningfarmacologische antagonistenvolumetransmissie analysetesten van synaptische verbindingenopstelling elektrofysiologische rig

Gerelateerde artikelen