Methodenartikel

Onderzoek van RNA-synthese met behulp van de 5-Bromouridine etikettering en Immunoprecipitation

8.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/57056

⸱

3 mei 2018

 ,  ,  ,  , 
1DANDRITE - Danish Research Institute of Translational Neuroscience, Dept. of Biomedicine, Aarhus University, 2Dept. of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University

In dit artikel

Samenvatting

Deze methode kan worden gebruikt voor het meten van RNA-synthese. 5-Bromouridine is toegevoegd aan de cellen en opgenomen in gesynthetiseerde RNA. RNA-synthese wordt gemeten door RNA extractie onmiddellijk na de etikettering, gevolgd door 5-Bromouridine-gerichte immunoprecipitation van gelabelde RNA en analyse door omgekeerde transcriptie en kwantitatieve polymerase-kettingreactie.

Samenvatting

Steady-state RNA niveaus zijn vergelijking tussen de twee voorwaarden, is het niet mogelijk om te onderscheiden of wijzigingen worden veroorzaakt door wijzigingen in de productie of degradatie van RNA. Dit protocol beschrijft een methode voor het meten van RNA productie, met 5-Bromouridine etikettering van RNA gevolgd door immunoprecipitation, waarmee onderzoek van RNA gesynthetiseerd binnen een korte termijn (bijvoorbeeld, 1 h). Het voordeel van 5-Bromouridine-etikettering en immunoprecipitation over het gebruik van giftige transcriptionele-remmers, zoals α-amanitine en actinomycin D, is dat er geen of weinig gevolgen voor de levensvatbaarheid van de cellen tijdens kortstondig gebruik. Omdat 5-Bromouridine-immunoprecipitation alleen RNA geproduceerd binnen de korte etikettering vastlegt, langzaam geproduceerd, evenals snel gedegradeerd kan RNA echter moeilijk te meten door deze methode. De 5-Bromouridine-geëtiketteerd RNA gevangen genomen door 5-Bromouridine-immunoprecipitation kan worden geanalyseerd door omgekeerde transcriptie, kwantitatieve polymerase-kettingreactie, en de volgende generatie sequencing. Alle soorten RNA kunnen worden onderzocht, en de methode is niet beperkt tot het meten van de mRNA zoals in dit voorbeeld wordt gepresenteerd.

Inleiding

5-Bromouridine (BrU) immunoprecipitation (IP) maakt de studie van RNA productie in cellen met geen of zeer beperkte effecten op cel fysiologie tijdens de briefing etikettering van periode1,2. De methode berust op de opname van de afgeleide van de synthetische uridine BrU in nieuw samengestelde RNA gevolgd door IP van gelabelde RNA met anti-BrU antilichamen (Figuur 1).

Het is al bekend voor decennia die eiwitsynthese transcriptionally kan worden geregeld, en het bestaan van transcriptiefactoren was meer dan 50 jaar geleden hypothetische3. Vandaag, het is bekend dat verschillende ziekten worden veroorzaakt door disregulatie van transcriptie en RNA stabiliteit (aanvullende figuur S1 in referentie4), en de mogelijkheid voor het meten van veranderingen in RNA productie is van groot belang in het begrip ziekte ontwikkeling.

Aan de andere kant, bieden tools voor het regelen van RNA productie nieuwe mogelijkheden voor de behandeling van ziekten veroorzaakt door te weinig of te veel eiwit expressie, of ophoping van eiwitten zoals in ziekte Parkinson's (PD). De overheersende eiwit zich ophopen als onoplosbare aggregaten in PD is α-synuclein, en het niveau van α-synuclein is direct gekoppeld aan de ziekte, zoals gene vermenigvuldiging van de α-synuclein-gen familiale PD-5 veroorzaakt. Bovendien, α-synuclein aggregaten in een concentratie afhankelijke wijze. Downregulatie van α-synuclein mRNA niveaus is dan ook een interessante therapeutische strategie, die met succes met behulp van RNA-interferentie geboekt te verlagen van neuronale cel verlies in PD knaagdier modellen6,7.

Het is belangrijk om het meten van de veranderingen in de productie van RNA veroorzaakt door ziekte of therapeutische ingrepen te kunnen. State of the art methoden voor meten steady-state niveaus van RNA, zoals omgekeerde transcriptie gevolgd door kwantitatieve polymerasekettingreactie (RT-qPCR), zijn niet in staat zijn onderscheid te maken tussen wijzigingen veroorzaakt door transcriptionele verordening of gewijzigd RNA stabiliteit. Een veel gebruikte methode voor het onderzoek van RNA verval tarieven is het blokkeren van de transcriptionele machine met behulp van verbindingen zoals α-amanitine of actinomycin D gevolgd door metingen van de rottende RNAs. Er zijn echter enkele problemen in verband met een totale blokkade van transcriptie in cellen, zoals inductie van apoptosis8,9. Naast de cytotoxische effecten presenteren transcriptionele remmers ook verschillende technische problemen, zoals trage cellulaire verbreiding van α-amanitine en gebrek aan specificiteit van actinomycin D (herzien in verwijzing10).

Om te voorkomen dat de totale blokkade van transcriptie, zijn nucleotide analogen gebruikt, zoals 5-ethynyl uridine (5-EU), 4-thiouridine (4-TU) en BrU. Deze zijn gemakkelijk in beslag genomen door de cellen van zoogdieren en opgenomen in de nieuw samengestelde RNA, waardoor pulse-etikettering van RNA binnen een bepaald tijdsbestek. BrU is minder toxisch dan 5-EU- en 4-TU, waardoor het de voorkeur analogon van keuze11,12.

BrU-IP kan worden gebruikt om de onderzoeken van zowel het tarief van de RNA-synthese en stabiliteit, en dus onderscheid worden gemaakt tussen de onderliggende oorzaken van veranderingen in de totale RNA. Dit artikel zal zich richten op de meting van RNA-synthese en verwijst als u verwijst naar de2 voor meer informatie over het onderzoek van RNA stabiliteit. Om te onderzoeken RNA-synthese, worden de cellen kort geëtiketteerd met BrU bv voor 1 h gevolgd door BrU-IP-1 (Figuur 1 c). Hierdoor kunnen metingen van RNA gesynthetiseerd in de korte tijd van de etikettering en waargenomen wijzigingen zal een betere raming van de verordeningen in RNA synthese dan door het meten van veranderingen in totaal RNA door RT-qPCR. Dient te worden vermeld, echter, dat hoewel de etikettering tijd, bijvoorbeeld, slechts 1 h is, afbraak nog steeds een invloed op de waargenomen niveaus van RNA hebben kan.

RNA van BrU-IP experimenten zijn geschikt voor downstream analyse door zowel de RT-qPCR1 of de volgende generatie sequencing-2,13. Andere standaard RNA detectiemethoden, zoals het noordelijke bevlekken of ribonuclease bescherming assay, kunnen ook gelden voor bepaalde RNAs.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Opmerking: Alle stappen bij kamertemperatuur, tenzij anders vermeld en houden van buffers op ijs of in de koelkast (met uitzondering van de elutie van de buffer waarin SDS). Het protocol is verdeeld in 5 secties: voorbereiding van RNA monsters; voorbereiding van kralen voor IP; binding van BrU-gelabelde RNA aan kralen; elutie en zuivering van afhankelijke BrU-gelabelde RNA door 3 stappen fenol-fenol/chloroform-chloroform extractie; analyse van RNA (in dit voorbeeld met behulp van RT-qPCR)

1. bereiding van de monsters van RNA

  1. Graaf HEK293T cellen met behulp van een geautomatiseerde cel teller en zaad van 3,500,000 cellen in een petrischaal 10 cm in 10 mL groei media (Dulbecco van bewerkt Eagle's Medium aangevuld met 10% foetaal kalfsserum en 50 µg Mo/mL penicilline/streptomycine) voor een totaal van > 40 µg RNA na extractie 48 uur later. Houden cellen bij 37 ° C en 5% CO2.
  2. 48 uur na het zaaien, 8 mL groei media gecombineerd en 2 mL achterlaten om te voorkomen dat de cellen uitdrogen. Voeg 2 mM BrU en elke behandeling om de 8 mL aanzuiging groei media, en de resterende 2 mL uit de cellen te verwijderen alvorens het opnieuw toepassen van de 8 mL BrU met groei media. Vermijd het gebruik van nieuwe media op verzoek van de BrU op de cellen, aangezien dit leiden wijzigingen in genexpressie tot kan.
  3. Incubeer de cellen gedurende 1 uur met BrU en behandeling. Wassen van de cellen in 5 mL Henks buffer en trypsinize van de cellen met behulp van 2 mL 0,05% trypsine. 8 mL groei media zet de reactie stop, de cellen overbrengen in een tube van 15 mL en spin down de cellen gedurende 2 minuten op 1000 x g toevoegen.
  4. Verwijder het supernatant en totaal RNA uittreksel uit de pellet van de cel met behulp van een RNA-isolatie kit (Zie Tabel van materialen) of enige andere methode de voorkeur, en elueer in RNase-vrije H2O. winkel de RNA-80 ° c tot klaar om verder te gaan.

2. voorbereiding van kralen voor IP

  1. Kralen in batches voorbereiden op het aantal monsters worden onderzocht plus één extra ter compensatie van verlies tijdens pipetteren en dwarrelen mengen. Resuspendeer anti-muis IgG magnetische kralen grondig door het mengen van de werveling en neem uit 20 µL kralen per monster in een tube 1,5 mL RNase-vrij. Plaats de buis 1,5 mL in een magnetische standaard en laat ongeveer 20 s voor de kralen te verzamelen aan de kant.
  2. Verwijder het supernatant, nemen de buis van de magnetische standaard en resuspendeer in 400 µL 1 x BrU-IP buffer door pipetteren. Draai de buis kort voor 2 s in een centrifuge tafelblad, plaatst u deze terug in de magnetische standaard en verwijder het supernatant. De wassen stap eenmaal herhaald.
  3. Blok aspecifieke binding aan de parels met behulp van heparine. Resuspendeer de kralen in 1 mL 1 x BrU-IP + 1 mg/mL heparine buffer en laat draaien voor 30 min. Wash de kralen eens, zoals in stap 2.2.
    Opmerking: Heparine is een negatief-geladen polymeer, die met RNAs voor een inbinding concurreren zal. tRNA of andere irrelevante RNAs kunnen ook worden gebruikt als de downstream toepassing is niet sequencing.
  4. Resuspendeer de kralen in 1 mL 1 x BrU-IP buffer en 1,25 µg/monster anti-α-Bromodeoxyuridine antilichaam, die herkent ook BrU toe te voegen. Incubeer de kralen voor 1 h terwijl het draaien of overnachting bij kamertemperatuur.
  5. Wassen van de kralen driemaal zoals in stap 2.2. Resuspendeer de kralen in 50 µL/monster 1 x BrU-IP buffer aangevuld met 1 mM BrU en laat draaien voor 30 min te verlagen van de gevoeligheid van het antilichaam gebonden aan de kralen en hierbij het risico van aspecifieke bindende onderzoektijdvak.
  6. Wassen van de kralen driemaal zoals in stap 2.2 en resuspendeer in 50 µL/monster 1xBrU-IP-buffer.

3. bindende van BrU-gelabelde RNA aan kralen

  1. RNA concentraties in RNA extracten van stap 1.3 meten met behulp van UV-zichtbaar spectrofotometrie, en 40 µg RNA van elk monster in RNase-vrije H2O tot een totaal volume van 200 µL verdunnen.
  2. Verwarm RNA monsters gedurende 2 minuten bij 80 ° C tot het denatureren van RNA en spin kort in een tafelblad centrifuge. Voeg 200 µL 2 x BrU-IP + BSA/RNAse remmer.
  3. Voeg 50 µL geresuspendeerde en kralen uit stap 2.6 aan elk monster bereid en laat draaien 1 h. Wash de kralen viermaal zoals in stap 2.2.

4. elutie en zuivering van RNA door 3 stappen fenol-fenol/Chloroform-chloroform extractie

  1. Elueer RNA en fenol extractie uit te voeren
    1. Resuspendeer de kralen in 200 µL elutie buffer Elueer van RNA, en snel daarna voeg 200 µL fenol, pH 6.6 (Let op: giftig, zie opmerking hieronder stap 4.1.2) te verwijderen van een niet-RNA-moleculen uit het monster.
    2. Werveling mix het monster, en spin 3 min op 25.000 x g in een tafelblad centrifuge.
      Opmerking: Fenol is giftig en moet worden behandeld in een zuurkast dragen van bescherming van de huid. De licht zure pH-waarde zorgt ervoor dat alleen RNA en DNA niet, wordt gewonnen. Het RNA blijft in de bovenste waterfase het hydrofiele karakter van kosten. De hydrofobe kernen van eiwitten zal binden van fenol en verplaatsen naar de lagere biologische fenol-fase.
  2. Uitvoeren van fenol-chloroform extractie
    1. Gecombineerd zoveel Opper-fase mogelijk (ongeveer 190 µL van de 200 µL, afhankelijk van ervaring in behandeling) en verplaats het naar een buis met 200 µL fenol/chloroform, pH 6.6 (Let op: giftig, zie opmerking). Zorg ervoor dat hetzelfde bedrag in verschillende steekproeven gecombineerd.
    2. Werveling Meng het monster en de spin voor 3 min op 25.000 x g.
      Opmerking: Chloroform is giftig en moet worden behandeld in een zuurkast dragen van bescherming van de huid. Chloroform wordt toegevoegd aan het verwijderen van fenol, die kan invloed hebben op de downstream-analyse van RNA door remming van omgekeerde transcriptie14 en polymerase kettingreactie15.
  3. Chloroform extractie uit te voeren door het aspirating van de bovenste waterfase als vóór (nu ongeveer 180 µL) en overbrengen in een buis met 200 µL chloroform. Werveling Meng het monster en spin 3 min op 25.000 x g.
  4. De bovenste waterfase als vóór (nu ongeveer 170 µL) gecombineerd en overbrengen naar een buis met 17 µL (1/10 volume) 3 M CH3COONa, pH 6.0. Toevoegen om te neutraliseren en RNA precipiteren uit de waterige oplossing, 2 µL glycogeen (20 mg/mL), die samen met RNA precipitaten en de RNA-pellet zichtbaarder maakt.
  5. Voeg toe 500 µL 96% ethanol te verhogen van binding tussen de zout ionen en RNA en meng door het omkeren van de buis een paar keer. Laat de buis 's nachts bij-20 ° C of 15 min op droog ijs.
  6. Draai het monster bij 25.000 x g, 4 ° C gedurende 30 min. Discard bovendrijvende vloeistof zonder verstoring van de pellet en wassen van de pellet in 185 µL 75% ethanol te verwijderen van alle resterende zout. Draaien op 25.000 x g, 4 ° C gedurende 5 minuten.
  7. Vloeistof wordt weggeworpen volledig zonder de pellet te verstoren en laat de pellet te drogen van 5-10 minuten met een open deksel. Resuspendeer in 10 µL RNase-vrije H2O toegepast aan de kant van de buis om te voorkomen dat de pellet te verstoren.

5. analyse van RNA

  1. Bereiden van cDNA met behulp van een omgekeerde transcriptie van cDNA kit (Zie Tabel van materialen) of een andere voorkeur methode met behulp van 2 µL RNA steekproef en totaal RNA van 1 µg gist als drager RNA voor de cDNA synthese reactie (niet gebruikt als cDNA wordt gebruikt voor het rangschikken van volgende generatie). Gebruik 1 µg RNA zonder gist RNA voor cDNA voorbereiding van overeenkomstige input.
  2. Verdunde cDNA 1:25 en mix de cDNA 9 µL verdund met 10 µL qPCR Master mix en 1 µL fluorogenic sonde, beide opgegeven in de Tabel van materialen.
    Opmerking: De cDNA verdunning hangt de cDNA voorbereiding en qPCR methode die wordt gebruikt.
  3. Voer het volgende qPCR-programma (bijvoorbeeld op een 7500 snel Real-time PCR-systeem of gelijkwaardige): 2 min bij 50 ° C, 20 s bij 95 ° C, 40 cycli van 3 bij 95 ° C en 30 s s bij 60 ° C.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Onze eerste tests van BrU-etikettering tijd werden uitgevoerd in de cellen van de AsPC-1. De cellen werden behandeld met BrU voor 0, 1, 2 en 4.5 h, gevolgd door de totale RNA extractie en BrU-IP. GAS5 en GAPDH werden gemeten in BrU-IP RNA, die aangetoond dat 1 h etikettering voldoende was om het bereiken van een ongeveer 9 - en 44 keer verandering in vergelijking met achtergrond (0 h) voor GAPDH en GAS5, respectievelijk.

BrU-IP ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit protocol bevat een beschrijving van het gebruik van BrU-IP voor bepaling van RNA productie door etikettering van nieuw RNA voor 1 h met BrU geproduceerde, gevolgd door onmiddellijke RNA extractie en immunoprecipitation van BrU-gelabelde RNA. Deze methode is eerder beschreven in referentie16en dit artikel bevat enkele extra stappen ter verbetering van de specificiteit van de IP- en RNA zuiverheid, door vooraf behandelen kralen met lage concentraties van BrU, alsmede de zuivering van een fenol-c...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De Stichting Lundbeck, Universiteit van Aarhus, Dandrite en Lundbeck A/S ondersteund dit werk.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Ribolock Rnase inhibitorThermoFisherEO0381
Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgGLife Technologies11202D
α-Bromodeoxyuridine mouse antibodyBD Bioscience555627
Nanodrop 1000Thermo FisherUltraviolet-visible spectrofotometrie
Water-Saturated Phenol pH 6.6ThermoFisherAM9712
Phenol:Chloroform:IAA 25:24:1 pH 6.6ThermoFisherAM9732
High Pure RNA isolation KitRoche11828665001
High Capacity cDNA Reverse Transcription KitThermoFisher4368814
Taqman Fast Advanced Master MixThermoFisher4444557qPCR Master Mix
Taqman RNA probesThermoFisherSNCA: Hs01103383_m1, 18sRNA: Hs03928985_g1, ACTB: Hs01060665_g1, HMBS: Hs00609296, NADH: Hs01072843_m1Flurogenic probes
7500 Fast Real-Time PCR systemApplied Biosystems
HEK293T cell lineATCC
Dulbecco's Modified Eagle's MediumLonzaBE12-604F
Fetal calf serumBiochromS0115
Penicillin/StreptomycinBiochromA2213
Hank's buffer5,3 mM KCl, 0,44 mM KH2PO4, 0,2 mM Na2HPO4 en 136,8 mM NaCl pH 6,77, geautoclaveerd.
DEPC-H2O0,1% diethylpyrocarbonaat behandeld H2O
2xBrU-IP Buffer40 mM Tris-HCl pH 7,5 en 500 mM NaCl in DEPC H2O
2xBrU-IP+BSA/RNAse inhibitor2xBrU-IP buffer aangevuld met 1 μg/μL BSA en 80 U/mL Ribolock
BrU-IP+ 1 mg/mL heparin2xBrU-IP buffer verdund 1:1 DEPC-H2O en aangevuld met 1 mg/mL heparine
1xBrU-IP2xBrU-IP buffer verdund 1:1 in DEPC-H2O en aangevuld met 0,5 μg/μL BSA en 20 U/mL Ribolock
Elution buffer0,1% SDS in RNAse-vrij H2O

Referenties

  1. Kofoed, R. H., et al. Polo-like kinase 2 modulates α-synuclein protein levels by regulating its mRNA production. Neurobiol. Dis. 106, 49-62 (2017).
  2. Imamachi, N., et al. BRIC-seq: A genome-wide approach for determining RNA stability in mammalian cells. Methods. 67, 55-63 (2014).
  3. Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J. Mol. Biol. 3, 318-356 (1961).
  4. Lee, T. I., Young, R. A. Transcriptional Regulation and its Misregulation in Disease. Cell. 152, 1237-1251 (2014).
  5. Farrer, M., et al. Comparison of kindreds with parkinsonism and α-synuclein genomic multiplications. Ann. Neurol. 55, 174-179 (2004).
  6. Khodr, C. E., Becerra, A., Han, Y., Bohn, M. C. Targeting alpha-synuclein with a microRNA-embedded silencing vector in the rat substantia nigra: Positive and negative effects. Brain Res. , 47-60 (2014).
  7. Cooper, J. M., et al. Systemic exosomal siRNA delivery reduced alpha-synuclein aggregates in brains of transgenic mice. Mov. Disord. 29, 1476-1485 (2014).
  8. Magdalan, J., et al. alpha-Amanitin induced apoptosis in primary cultured dog hepatocytes. Folia Histochem. Cytobiol. 48, 58-62 (2010).
  9. Lu, D. F., et al. Actinomycin D inhibits cell proliferations and promotes apoptosis in osteosarcoma cells. Int. J. Clin. Exp. Med. 8, 1904-1911 (2015).
  10. Bensaude, O. Inhibiting eukaryotic transcription. Which compound to choose? How to evaluate its activity? Transcription. 2, 103-108 (2011).
  11. Tani, H., et al. Nuclear Bodies and Noncoding RNAs. Methods in Molecular Biology. 1262, 305-320 (2015).
  12. Meneni, S., et al. 5-Alkynyl-2'-deoxyuridines: chromatography-free synthesis and cytotoxicity evaluation against human breast cancer cells. Bioorg. Med. Chem. 15, 3082-3088 (2007).
  13. Meola, N., et al. Identification of a Nuclear Exosome Decay Pathway for Processed Transcripts. Mol. Cell. 64, 520-533 (2016).
  14. Zhao, B. S., Roundtree, I. A., He, C. Post-transcriptional gene regulation by mRNA modifications. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 18, 31-42 (2016).
  15. Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. PCR inhibitors - occurrence, properties and removal. J. Appl. Microbiol. 113, 1014-1026 (2012).
  16. Paulsen, M. T., et al. Use of Bru-Seq and BruChase-Seq for genome-wide assessment of the synthesis and stability of RNA. Methods. 67, 45-54 (2014).
  17. Dölken, L., et al. High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay. Rna. , 1959-1972 (2008).
  18. Raghavan, A., et al. Genome-wide analysis of mRNA decay in resting and activated primary human T lymphocytes. Nucleic Acids Res. 30, 5529-5538 (2002).
  19. Sharova, L. V., et al. Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells. DNA Res. 16, 45-58 (2009).
  20. Pandya-Jones, A., et al. Splicing kinetics and transcript release from the chromatin compartment limit the rate of Lipid A-induced gene expression. RNA. 19, 811-827 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

RNA immunoprecipitatiemeting van RNA syntheseHEK293T cellenRNA extractiemagnetische beadsanti bromodeoxyuridine antilichaamBromouridine IP buffermeting van RNA concentratiefenol chloroformextractie

Gerelateerde artikelen