Karakterisering en isolatie van de primaire Microglia muis door dichtheid kleurovergang centrifugeren

Summary

Een protocol voor de isolatie van primaire microglia vanuit lymfkliertest brains wordt gepresenteerd. Deze techniek helpt bij het bevorderen van het huidige begrip van neurologische aandoeningen. Dichtheid kleurovergang centrifugeren en magnetische scheiding worden gecombineerd om voldoende opbrengst van een zeer zuivere monster. Voorts schetsen we de stappen voor de karakterisering van microglia.

Abstract

Microglia, de resident immune cellen in de hersenen, zijn de eerste responders aan ontsteking of een letsel in het centrale zenuwstelsel. Recent onderzoek heeft geopenbaard microglia als dynamische, staat van de veronderstelling dat zowel pro-inflammatoire en anti-inflammatoire fenotypen. Zowel M1 (pro-inflammatoire) en M2 (pro-herstellend) fenotypen spelen een belangrijke rol in neuroinflammatoire aandoeningen zoals perinatale hersenletsel en vertonen verschillende functies in reactie op bepaalde milieu stimuli. De modulering van de activering van het microglial is te verlenen neuroprotectie dus suggereren microglia wellicht therapeutisch potentieel in hersenletsel geconstateerd. Echter meer onderzoek nodig om de rol van microglia in de ziekte beter te begrijpen is, en dit protocol dat vergemakkelijkt. Het protocol beschreven hieronder combineert een dichtheid kleurovergang centrifugeren proces ter vermindering van de cellulaire puin, met magnetische scheiding, produceren een zeer zuiver voorbeeld van primaire microglial cellen die kunnen worden gebruikt voor in vitro experimenten, zonder de nodig voor 2-3 weken kweken. Bovendien, opbrengst de karakterisering stappen robuuste functionele gegevens over microglia, medeplichtigheid aan studies om beter ons begrip van de polarisatie en priming van deze cellen, die sterke implicaties op het gebied van regeneratieve geneeskunde heeft.

Introduction

Schade verworven in de perinatale periode van ontsteking, hypoxische-ischemie en bloedingen kan een matrix van lange termijn gevolgen hebben. De complexe pathofysiologie van perinatale hersenletsel is theorie ontsteking en ischemie met daaropvolgende neuronale en axonale dood¹te betrekken. De aangeboren immuunrespons speelt een belangrijke rol in de opeenvolging van gebeurtenissen die leiden tot letsel².

Microglia, de resident immuuncellen in het centrale zenuwstelsel (CNS), zijn de eerste responders aan schade³. Microglia zijn kunststof celtypes met het vermogen om zow....

Protocol

De volgende procedures zijn goedgekeurd door de ethische commissie van het dier aan de Monash Universiteit. Gezonde onbehandelde neonate C57Bl6/J P3-6 muizen werden gebruikt om de representatieve resultaten te genereren.

1. enzymatische spijsvertering

Opmerking: Het is belangrijk dat de steriliteit bij isoleren en kweken van primaire cellen. Waarbij dat het milieu zo steriel mogelijk is, kunnen de eerste dissectie en de oogst van lymfkliertest hersenen worden uitgevoerd buiten een laminaal stroom kap, met alle volgende stappen die worden uitgevoerd binnen een laminaire flow-kap.

1. Met behulp van steriele ....

Results

Gebruik de methoden hier, kunnen pure populaties van microglia kunnen worden geïsoleerd en klaar voor karakterisering met behulp van in vitro en FACS analyse. Om te beginnen met, kunnen tot 18 dieren worden gebruikt per slachten, met een verwachte opbrengst van ongeveer 450.000-600.000 microglial cellen. Het is cruciaal dat de zuiverheid van de geïsoleerde cellen eerst te bevestigen, en hiervoor FACS analyse werd uitgevoerd door de kleuring van de twee markeringen, CD45 en CD11b........

Discussion

Microglia hebben de mogelijkheid om zowel pro- en anti-inflammatoire, gewijzigd door prikkels van de omgeving. Eerdere studies hebben aangetoond dat de modulatie van microglia activering neuroprotectie kan verlenen. Hun vermogen om te beveiligen neuronen en schade reparatie vereist meer onderzoek ter bevordering van de huidige kennis van deze complexe cellen. Isolatie van hoge zuiverheid primaire microglia is dus een belangrijke en nuttige techniek. Dit is een relatief snelle methode voor het verkrijgen van zeer zuivere .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM, low glucose, pyruvate	Gibco	11885084
Antibiotic-Antimycotic (100X)	Gibco	15240062
DNaseI grade II from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	10104159001
Papain from papaya latex, buffered aqeuous solution	Sigma-Aldrich	P3125-100mg
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated	Gibco	16140071
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01
Hank's Balanced Salt Solution (1X)	Gibco	14175-103
Hank's Balanced Salt Solution (10X)	Gibco	14185052
EasySep Mouse CD11b Positive Selection Kit	StemCell Technologies	18770	EasySep magnet variant
EasySep magnet	StemCell Technologies	18000
EasySep Buffer	StemCell Technologies	20144
Dulbecco's Phosphate buffered saline	Gibco	14040182
Trypsin (2.5%) (10X)	Gibco	15090-046
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™)	BD Biosciences	553141
Falcon 5mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, with Snap Cap, Sterile	Corning	352063
175cm² Angled Neck Cell Culture Flask with Vent Cap	Corning	431080
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O127:B8	Sigma-Aldrich	L5024
96 Well TC-Treated Microplates size 96 wells, clear, polystyrene, round bottom	Corning	CLS3799
Paraformaldehyde (powder, 95%)	Sigma-Aldrich	158127
Triton-X	Sigma-Aldrich	X100
Rabbit Anti-Iba1	Wako	01919741
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488)	Abcam	ab150077
FACS Antibodies	Company	Catalog Number
V450,Rat,Anti-Mouse,CD45,30-F11,RUO	BD Biosciences	560501
PerCP-Cy5.5 CD11b	eBiosciences	45-0112-82
ZombieNIR	Biolegend	423105
pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate	Thermo Fisher Scientific	P35361
Annexin.V_FITC	Miltenyi Biotech	130-093-060
Propodium Iodide solution	Miltenyi Biotech	130-093-233