Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Zygotic fluorescentie herstel na het ontkleuren aangebracht van foto analyse voor chromatine losheid waarmee voldragen ontwikkeling

7.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/57068

⸱

12 juni 2018

 ,  ,  , 
1Faculty of Life and Environmental Sciences, Department of Biotechnology, University of Yamanashi, 2Department of Integrated Bioscience, Graduate School of Frontier Sciences, University of Tokyo, 3Advanced Biotechnology Center, University of Yamanashi

In dit artikel

Samenvatting

Chromatine losheid lijkt te worden betrokken in het ontwikkelings potentieel van blastomeren. Het is echter niet bekend of chromatine losheid kan worden gebruikt als een betrouwbare index voor de ontwikkelings potentieel voor embryo's. Hier, is een experimenteel systeem waarin chromatine losheid-geëvalueerd zygoten tot volledige termijn ontwikkelen kunnen beschreven.

Samenvatting

Levende imaging is een krachtig hulpmiddel waarmee voor de analyse van de moleculaire gebeurtenissen die tijdens de ribben. Onlangs, chromatine losheid of openheid is aangetoond te worden betrokken in het potentieel van de celdifferentiatie van pluripotente embryonale stamcellen. Eerder werd gemeld dat in vergelijking met embryonale stamcellen, zygoten haven een uiterst losgedraaide chromatine-structuur, die haar relatie met hun totipotent duiden. Echter, tot nu toe, het niet is beantwoord of de structuur van deze uiterst losgemaakt/open chromatine belangrijk voor de embryonale ontwikkelings potentieel is. In de huidige studie, om te onderzoeken van deze hypothese, werd een experimenteel systeem welke zygoten die werden geanalyseerd door fluorescentie herstel na foto-bleken zich tot termijn zonder significante schade ontwikkelen kan ontwikkeld. Nog belangrijker is, moet dit experimenteel systeem alleen een kachel van thermos-plaat naast een confocale laser scanning microscoop. De bevindingen van deze studie suggereren dat herstel van de fluorescentie na foto-bleken analyse (FRAP) analyse kan worden gebruikt om te onderzoeken of de moleculaire gebeurtenissen in zygotic chromatine belangrijk voor de ontwikkeling van de voldragen zijn.

Inleiding

Na de bevruchting, de structuur van de chromatine is dynamisch gewijzigd en zygotic chromatine structuur is dan uiteindelijk gevestigde1,2. Tijdens deze periode, in de vaderlijke pronuclei, is de dominante chromatine proteïne veranderde van tijdje in Histon. De resulterende chromatine is zeer verschillend van die van sperma en eicellen van de vrouw in verschillende punten (bijvoorbeeld, histone variant samenstelling, histone wijziging). Aldus wordt gevormde zygotic chromatine gezien als belangrijk voor de latere ontwikkeling van het embryo. Echter, ondanks pogingen om de details van de structuur van de chromatine zygotic onthullen over lange periodes, methoden voor de beoordeling van de kwaliteit van zygoten of te voorspellen hun voldragen ontwikkeling in het stadium van een cel door het analyseren van de structuur van de chromatine nooit geweest opgericht.

In de vorige studie, is het ontdekt dat zygoten een uiterst losgedraaide chromatine structuur3 hebben. Op dit moment de losheid van de chromatine of openheid wordt verondersteld te zijn een belangrijke factor voor celdifferentiatie potentieel in embryonale stamcellen (ES) cellen4. ES-cellen homogeniteit in de natuur geen vertonen, maar zijn nogal heterogene; in de kolonies van de cel van de ES verwerven sommige Transient een hogere differentiatie mogelijkheden vergelijkbaar met blastomeren van twee cellen fase embryo's. Tijdens deze overgang in de twee-cel als staat cellen chromatine losheid in ES verandert in wat vergelijkbaar met twee-cel fase embryo's5 is. Zo lijkt de chromatine losheid van belang voor celdifferentiatie potentieel en het is mogelijk dat uitgebreid open chromatine in zygoten is handig voor de evaluatie van zygotic ontwikkelings potentieel.

Levende imaging is een krachtig hulpmiddel waarmee voor de analyse van de moleculaire gebeurtenissen die tijdens de ribben omdat deze methode geschikt is voor verdere ontwikkeling en zelfs voldragen ontwikkeling6. Als een van de levende imaging methoden, is FRAP analyse gebruikt om te onderzoeken van de chromatine losheid in voor inplanting embryo's en ES cellen3,4,5. Als zygotic chromatine losheid kan worden geanalyseerd zonder een schadelijk effect op voldragen ontwikkeling door FRAP analyse, kan het zijn een waardevol instrument voor de beoordeling van de kwaliteit van de embryo's in het stadium van de één-cel. Echter zijn de effecten op voldragen ontwikkeling door deze experimentele methode niet onderzocht. Onlangs, een experimenteel systeem met behulp van FRAP te evalueren zygotic chromatine losheid werd ontwikkeld. Omdat dit een nieuwe waarnemingssysteem voor zygoten was, werd het genoemd als zygotic FRAP (zFRAP). zFRAP beïnvloedde niet kritisch voldragen ontwikkeling en is elders7gemeld. In dit verslag, wordt het protocol voor deze experimentele methode beschreven.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Deze studie werd uitgevoerd in strikte overeenstemming met de aanbevelingen in de gids voor de zorg en het gebruik van de dieren van het laboratorium van de Universiteit van Yamanashi. Het protocol is goedgekeurd door de Commissie op de ethiek van dier experimenten van de Universiteit van Yamanashi (toestaan nummer: A24-50). Alle operaties werden uitgevoerd onder tribromoethanol narcose en inspanningen werden geleverd om het leed te minimaliseren. Een geïllustreerd overzicht van de procedures en het tijdschema worden weergegeven in Figuur 1 en tabel 1, respectievelijk.

1. voorbereiding van de boodschapper-RNA (In Vitro transcriptie van mRNA eGFP-H2B)

  1. Linearize 5 µg sjabloon DNA pTOPO-eGFP-H2B3,7 met 30 U van niet ik in 50 µL bij 37 ° C's nachts.
  2. Verzamelen 1.5 µL van verteerd DNA voor bevestiging of volledig verteerd door elektroforese.
    1. Toepassing 1.5 µL en 3-5 µL van onverteerd DNA met laden kleurstof naar de waterput van 2% agarose gel, respectievelijk, en onder voorbehoud van elektroforese.
      Opmerking: Als volledig verteerd, een enkele band (ca. 5 kb) wordt waargenomen. Onverteerd DNA wordt gebruikt als een besturingselement, die wordt weergegeven op een andere positie.
  3. Voeg 151.5 µL van ddH2O en 200 µL van fenol/chloroform/Isoamylalcohol (25:24:1) naar de resterende verteerd DNA.
    1. Meng krachtig door vortex.
    2. Centrifugeer bij de maximale snelheid gedurende 15 minuten.
  4. Herstellen van het supernatant en voeg vervolgens 200 µL van chloroform.
    1. Meng krachtig door vortex.
    2. Centrifugeer bij maximale snelheid gedurende 15 minuten.
  5. Herstellen van het supernatant en voeg vervolgens 20 µL van 3M natriumacetaat en 1,5 µL van ethachinmate.
    1. Meng krachtig door vortex.
    2. Voeg 550 µL van 100% ethanol en meng krachtig door vortex.
    3. Centrifugeer bij maximale snelheid gedurende 15 minuten.
    4. Verwijder het supernatant en daarna wassen de pellet met 70% ethanol.
    5. Droog de pellet door verdamping voor 5-10 min.
  6. Ontbinden geprecipiteerde plasmide DNA in 8 µL van nuclease-gratis water.
  7. Beoordelen van de plasmide concentratie (verwachte concentratie is ongeveer 300-500 ng/µL) met nanodrop volgens instructie van de fabrikant.
  8. In vitro transcriptie voor mRNA eGFP-H2B met 1 microgram van gezuiverde DNA codering als een sjabloon in 20 µL van totale reactie volume door het volgen van de instructies van de fabrikant uitvoeren.
    1. Na in vitro transcriptie, 36 μL van water toevoegen en vervolgens herstellen 1.5 µL van 56 µL van gesynthetiseerde mRNA voor analyse door elektroforese (zoals zonder poly A).
  9. Poly A tailing voor gesynthetiseerde mRNA in een 100 µL reactie volume uitvoeren door het volgen van de instructies van de fabrikant.
  10. 60 µL van lithium chloride neerslag oplossing toevoegen aan de poly een staart mRNA van eGFP-H2B en meng het krachtig.
    1. Cool op-30 ° C gedurende 30 minuten.
    2. Centrifugeer bij maximale snelheid gedurende 15 minuten.
    3. Verwijder het supernatant en daarna wassen de pellet met 70% ethanol.
    4. Droog de pellet door verdamping voor 5-10 min.
  11. De pellet met 20 µL nuclease-gratis water oplossen door te verwarmen bij 55 ° C gedurende 30 minuten.
  12. De concentratie van de neergeslagen mRNA met nanodrop beoordelen. Verdun tot 500 ng/µL met nuclease-gratis water en winkel bij-80 ° C tot gebruik.
  13. Bevestigen van voorkeur mRNA productie; onderwerp 1 µL van mRNA met/zonder (verkregen in 1.8.1 en 1.12 stappen, respectievelijk) poly een staart gemengd met 1,5 µL van ethidiumbromide 0,1 mg/mL en 3 µL van monster laden kleurstof de elektroforese analyse. Toegepaste volume was 5.5 µL.
    Opmerking: Indien Poly A tailing succesvol was, de verschoven band in vergelijking met het mRNA zonder poly een tailing moet worden in acht genomen (figuur 2A).

2. bereiding van Vasectomized mannelijke muizen

  1. Weeg de ICR mannelijke muizen op 8-12 maanden met behulp van een gewicht-schaal.
  2. Intraperitoneally injecteren mannelijke muizen met 0.7 - 0,9 mL 1,2% tribromoethanol verdoving.
    Nota: Het bedrag van de verdoving is afhankelijk van de grootte van de muis. Bijvoorbeeld wordt een muis met een gewicht van 40 g geïnjecteerd met 0,8 mL tribromoethanol verdoving.
  3. Natte de BES met 70% ethanol.
  4. Het maken van een klein gesneden (3-5 mm) op de Bes en maak vervolgens een sneetje op de muur van de spier met behulp van schaar.
    Opmerking: Schaar en pincet moeten worden gereinigd met 70% ethanol vóór het begin van de operatie.
  5. Greep van een vet pad met een tang en trek het voorzichtig uit. Vervolgens weergegeven de testis en zaadleiders.
    Opmerking: Zaadleiders is een U-vormige buis en met een rode bloedvat.
  6. Tie uit de zaadleiders op twee punten met chirurgische hechtingen en vervolgens uitknippen de middelste deel tussen de verbonden punten.
  7. Duw voorzichtig terug de vet pad en de testis in de bessen.
    1. Herhaal de operatie met de resterende testis.
  8. Naai de spier muur met twee steken met chirurgische hechtdraad.

3. IVF

  1. Injecteren van 8 - 10 - weken oude vrouwelijke B6D2F1 (BDF1) muizen intraperitoneally met 7,5 IU paarden choriongonadotrofine (eCG) en humaan choriongonadotrofine (hCG) 46-50 h tussenpozen.
  2. Druppels 300 µL menselijke tubal vloeistof (HTF)8 media voorbereiden op rechtsbevoegdheid en inseminatie 1 dag vóór IVF in een schotel van 30 mm, dekken deze druppels met de minerale olie op de Bank laboratorium en daarna preincubate in een incubator's nachts.
  3. Offeren gerijpte mannelijke ICR muizen door cervicale dislocatie. Ontleden cauda bijbal met een 27-G naald en zaadcel verzamelen. Cultuur ze voor rechtsbevoegdheid in 300 µL van HTF media voor 1-2 h bij 38 ° C.
  4. 16 uur na de hCG-inspuiting, offeren super algemeen vrouwelijke muizen door cervicale dislocatie. Breng de ampul oviduct in minerale olie naast HTF media en vervolgens trekken uit cumulus cellen en eicellen complexe deze oviduct ampul door een 30-G naald in het gepreïncubeerd inseminatie-HTF medium.
    Opmerking: Sommige vrouwelijke muizen vertonen vaak geen eisprong ondanks super ovulatie behandeling. Uitgebreide oviduct ampul is een teken van de eisprong.
  5. Pipetteer 2-3 µL van het capacitated zaadcel in inseminatie-HTF media waarin de ovulated eicellen werden verzameld na rechtsbevoegdheid.
  6. 1 h na inseminatie, verzamelen de bevruchte zygoten en behandel hen met hyaluronidase bij 100 µg/mL gedurende 10 minuten in CZB9 media.
    Opmerking: Wanneer inseminatie wordt naar behoren uitgevoerd, 1 h na inseminatie, de bevruchte zygoten met het lichaam van de polar 2nd in acht worden genomen. Als minder of lage kwaliteit sperma wordt gebruikt, worden slechts weinig zygoten met het lichaam van de polar 2nd waargenomen. Ook, als vele zaadcellen worden gebruikt voor de inseminatie, polyspermy optreedt. Juiste inseminatie leidt tot zygoten met mannelijke en vrouwelijke pronuclei. Met behulp van deze criteria, is het mogelijk om te vinden of inseminatie wordt gedaan goed of niet.
    1. Na het wassen in CZB media, onverminderd de de zygoten met een tweede polar lichaam microinjection met eGFP-H2B mRNA.

4. voorbereiding van de kamer en Microinjection pipetten

  1. Verdun RNA eGFP-H2B met behulp van water nuclease-gratis te verkrijgen van een concentratie van 250 ng/µL-codering.
  2. Bereiden van 2-3 druppels PVP-HTF eGFP-H2B druppels mRNA en 5-6 druppels Hepes gebufferd CZB (H-CZB) druppels op de schotel van 60 mm. Betrekking hebben op deze druppels met minerale olie.
    Opmerking: Deze preparaten kunnen worden uitgevoerd op de laboratorium-Bank. Er is geen vereiste voor het gebruik van laminaire luchtstroming kabinet.
  3. Borosilicaat glas met een micropipet-trekker trek (bijvoorbeeld, P = 500, warmte = 825, pull = 30, vel = 120, en tijd = 200)
  4. Na het breken buig het uiteinde van de pipet, de getrokken glazen microinjection pipet dicht bij de tip (−300 terug µm) op ongeveer 30 °, met behulp van een microforge.

5. microinjection

  1. De plaat kachel uitschakelen op het podium van micromanipulator om te voorkomen dat het doden van de zygoten met een piëzo tijdens mRNA injectie.
  2. Wassen en de binnenkant van de injectie naalden in HEPES-buffer-HTF jas met 10% PVP (PVP-HTF).
  3. De bevruchte zygoten met een 2nd polar lichaam (figuur 2B) verzamelen en overbrengen van 20-25 zygoten op de kamer van het stadium van de Microscoop vastgehecht door middel van een micromanipulator.
  4. Vul de verdunde eGFP-H2B mRNA in borosilicaatglas haarvaten van de tips.
  5. Houd de zygote met een pipet bedrijf en verbreekt u daarna de zona zitten en het cytosolische membraan met een piëzo-aandrijving.
  6. Injecteren van ongeveer 10 pL van mRNA in het cytoplasma van de zygoten. Afwerking mRNA-injectie binnen 10 min ter voorkoming van schade veroorzaakt door langere kweken de zygoten buiten de incubator.
    Opmerking: Het geïnjecteerde volume moet zo groot zijn als het lichaam van de polar 2nd . Als het bedrag van mRNA geïnjecteerd te groot is, is het mogelijk tot de gratis eGFP-H2B breuk, die gevolgen voor de mobiele breuk hebben kan.
  7. 10 min na microinjection, wassen in ten minste 3 druppels en cultuur dan de ingespoten zygoten in CZB bij 38 ° C tot zFRAP analyse.

6. zFRAP analyse

  1. 1 uur vóór de zFRAP analyse, zet de laser en de hete plaat gekoppeld aan de fase van de confocal microscoop. Stel de temperatuur van 38 ° C.
  2. Zet 6-10 µL van CZB HEPES-buffer media bedekt met minerale olie op de 60-mm glas onder schotel en warm op de kachel tot zygote collectie.
  3. 8 - 12 uur na de inseminatie, verzamelen 5-10 zygoten eGFP-H2B-uiten en overdracht in 6-10 µL van vooraf verwarmd HEPES-buffer CZB middellange drop.
    Opmerking: Om te vermijden langer culturing buiten incubator, 5-10 eGFP-H2B-uiten zygoten werden gebruikt bij elke analyse. 5 tot 10 zygoten kunnen binnen 1 uur worden geanalyseerd.
  4. Stel de bleken en imaging voorwaarden volgens de instructies van de fabrikant. Het geval een confocale laser scanning microscoop (Tabel of Materials) wordt hieronder weergegeven:
    1. Gebruik 60 X olie lens (60 X 60 X / 1.35 olie).
      Opmerking: Lenzen met hogere vergroting (hogere numerieke diafragma) Toon hogere gevoeligheid.
    2. Stel scansnelheid als 4.0 µs/Pixel grootte als "512" op "Overname instelling" (aanvullende figuur 1).
    3. Verhoging van de digitale zoom op "5" (aanvullende figuur 1).
      Opmerking: Een hogere zoom is vereist om te herkennen of focus drift wordt gebruikt of niet.
    4. Open lijst met kleurstof (aanvullende figuur 1) en vervolgens koos "EGFP". Observatietijdstip instellen als 1.6 s (interval is ingesteld als de instelling van de "vrije termijn") (aanvullende figuur-1)
      Opmerking: Meer waarnemingspunten kunnen veroorzaken meer gedetailleerde gegevens, maar het kan ook leiden tot fototoxiciteit. In de analyse van de zFRAP lijkt een 1.6 s-observatietijdstip genoeg om te ontdekken de ouderlijke asymmetrie van chromatine losheid.
    5. Het aantal foto's instellen als 12 in totaal (aanvullende figuur 1).
    6. Start van "Stimulus instelling" paneel en klik op "Main" op UseScanner. Scansnelheid als 10.0 µs/Pixel instellen Klik op "Activeren in de reeks" en stel PreActivation als "3 frames" en activering tijd als "5 sec" (aanvullende figuur 1).
    7. Klik op "Focus x 2" en de focus vervolgens 'Stop'.
    8. Bleken en imaging laser macht (477 nm) op 110 en 15 μW, respectievelijk door aanpassen "laser gage macht" (aanvullende figuur 1).
      Opmerking: Zeer sterke bleken een grotere gebleekte gebied, waardoor moeilijkheden voor de kwantitatieve analyse kan veroorzaken. Gebruiken voor het meten van de kracht van de laser, een Energiemeter. Het is belangrijk om te bevestigen de kracht van de laser om te voorkomen dat het effect van de tijdsgebonden verslechtering van de kracht van de laser.
    9. Klik op "Clip Rect" (aanvullende figuur 1) in Stimulus instelling Configuratiescherm. Instellen van de regio van belang (ROI; rood; ROI #1B) als 40 x 40 pixels (7.6 µm2). Bereiden van een referentie-regio (REF; groen; ROI #2), en een achtergrond (BG; blauw; ROI #3) met behulp van "Kopieer ROI" en "plak ROI" (Klik met de rechtermuisknop knop op de muis).
      Opmerking: Pixelgrootte kan worden ingesteld via "ROI-manager", die kan worden aangeroepen door te klikken op de rechterknop van de muis wanneer de cursor zich op de ROI. Grotere ROIs worden verondersteld beter te zijn aangezien zij de spreiding van de zFRAP-score kunnen standaardiseren. Worden echter te groot voor een ROI kan niet gebruikt voor deze analyse omdat het maakt het moeilijk om te voorkomen dat het lichaam voorloper nucleolus (NPB). eGFP-H2B in dit compartiment was dacht vrij te zijn van de chromatine en toonde opmerkelijke hogere mobiliteit3. ROI en REF gebieden moeten zoveel mogelijk worden gescheiden. Als deze twee regio's nauwe, bleken kan ook invloed op de regio van REF.
    10. Klik op "Live" op de werkbalk en start "Live Plot" (aanvullende figuur 1).
      Opmerking: Live plot geeft de signaalsterkte fluorescentie binnen elke ROI en wordt gebruikt voor het aanpassen van de kracht van de laser met behulp van HV. Merk op dat als ROI is niet ingeschakeld, geen intensiteit zou worden gevonden op Live perceel paneel.
    11. Bepalen van de positie van de ROI
      Opmerking: ROI kan worden verplaatst door te slepen naar de gewenste positie in pronuclei. (1) zijn zeker te vermijden de nucleolus (2) de hele ROI past door de nucleoplasm. Bevatten niet de regio buiten het gebied van het kernmembraan (cytoplasma) in ROI. De lokalisatie van eGFP-H2B is zeer beperkt in de nucleoplasm, zodat is het gemakkelijk te vinden of ROI cytoplasma bevat of niet door de fluorescentie van eGFP-H2B. Mannelijke pronuclei zijn doorgaans groter dan die van vrouwtjes, die vaak zijn gelokaliseerd in de buurt van het lichaam van de polar 2nd . Keurmeester tijdens het gebruik van deze criteria, de mannelijke of vrouwelijke pronuclei.
    12. Klik op "Focus x 2" (aanvullende figuur 1) en pas vervolgens de HV macht gage van het kanaal voor EGFP in intensiteit van de fluorescentie naar ongeveer 2000 (intensiteit van de fluorescentie te zien in het venster "live plot").
  5. Klik op "Tijd" en vervolgens "XY" (aanvullende figuur 1) om te beginnen met de analyse van de zFRAP.
    Opmerking: Als "Tijd" knop is voldoende geselecteerd, "t" verschijnt op de knop "XY".
    1. Klik op "Reeks gedaan" (aanvullende figuur 1), dat verschijnt nadat FRAP beeldvorming in de buurt van de "XY button" en dan het verkrijgen van gegevens FRAP-geanalyseerd.
    2. Sla het bestand "2D weergave-Image XXXXX" als een voorkeur benoemde bestand (file format oib.) door "opslaan als" (Ctrl + Shift + S kan ook worden gebruikt).
    3. ROI, REF en BG selecteren en klik vervolgens op (Ctrl + A kan ook worden gebruikt) "Serie Analysis" in "2D weergave" afbeeldingsvenster.
    4. FRAP rijgegevens verkrijgen en klik op "opslaan" knop in het venster live plot.
      Opmerking: Rij FRAP kwantitatieve gegevens wordt opgeslagen als een CSV-bestand.
  6. Geen controle van de zFRAP, plaatst enkele van de zygoten ingespoten met mRNA op de daling, die in de buurt van de rand van het glas onder gerechten om te voorkomen dat het effect van fluorescentie observatie.

7. gegevens berekening

  1. Tijdens het gebruik van maken de verkregen kwantitatieve gegevens, de grafiek van de "herstel curve" en "mobiele fractie" door Excel zoals in de verwijzingen3,7 , met enkele wijzigingen (zie hieronder en aanvullend excel-bestand).
  2. Bereken de relatieve intensiteit door de waarde voor BG van die van ROI en REF in 12 afbeeldingen voor elk punt van de tijd af te trekken.
  3. Deelt u de waarde van ROI door die van de REF. Dientengevolge, kunnen 12 gestandaardiseerde relatieve intensiteit scores op elk tijdstip worden verkregen.
  4. Bereken het gemiddelde van de relatieve score voor ROI in 3 beelden genomen voordat foto bleken.
  5. Berekenen van de terugvinding. Verdeel die de 12 verkregen relatieve scores voor ROI in de foto's genomen op elk punt van de tijd (verkregen op 7.1.2.) door het gemiddelde van de relatieve score voor foto bleken (verkregen op 7.1.3.). Herstel curve met behulp van deze scores tekent (figuur 2E).
  6. Bereken het bleken percentage.
    Opmerking: Bleken percentage (%) = 100 - opbrengst van 4th afbeelding.
  7. De mobiele breuk (MF) berekenen met behulp van de formule als volgt10,11,12
    MF (%) = 12th terugvinding (op het eindpunt) - 4th terugbezorgd / bleken tarief × 100.

8. de embryotransfer

  1. Metgezel gerijpte ICR vrouwtjes op 8-12 maanden met vasectomized mannelijke ICR muizen de nacht voordat de embryotransfer door hen worden in de dezelfde kooi 's nachts te laten.
  2. Het verzamelen van de embryo's die werden zFRAP-geanalyseerd en vastbesloten om te ontwikkelen tot de fase twee-cel.
  3. Intraperitoneally injecteren vrouwelijke muizen met 0.7 - 0,9 mL 1,2% tribromoethanol anesthesie of met 0.35 - 0,45 mL 0.75/4/5mg/kg medetomidine/midazolam/Butorfanol gemengde agenten voorafgaand aan de embryotransfer.
    Opmerking: Het volume van de verdoving wordt bepaald door het lichaamsgewicht van muizen. Tribromoethanol: 0,2 mL/10 g van het lichaamsgewicht; Medetomidine/midazolam/Butorfanol gemengd agenten: 0,1 mL/10 g van het lichaamsgewicht.
    1. Breng deze twee-cel fase embryo's in de oviducts van pseudopregnant vrouwelijke ICR muizen met een vaginale stekker aan 0.5 dagen post coitum (dpc).
    2. Na de embryotransfer, door de vrouwelijke muizen te zetten door de kachel ingesteld bij 37 ° C totdat ze wakker worden.
  4. 18.5 dpc, offeren de surrogaat-moeder door cervicale dislocatie en herstellen van de pups zygoten zFRAP-geanalyseerd door keizersnede afgeleid. Enkele van de teruggekregen pups werden geleverd aan de pleegmoeder en hun lichaam gewichten per week werden beoordeeld.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

zFRAP analyse met eGFP-H2B

MRNA codering eGFP-H2B, die wordt gezien als een verschoven band door poly een tailing (figuur 2A veroorzaakt), goed geproduceerd en werd geïnjecteerd in het cytoplasma van zygoten met een 2e polar lichaam 1-3 uur na inseminatie (figuur 2B). Acht tot 12 uur na de inseminatie, zygoten met 2 pronuclei tonen de expressie van eGFP-H2B werden verzamel...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Zoals geopenbaard in deze studie, veroorzaakt de analyse van de zFRAP geen kritische schade aan voldragen ontwikkeling, suggereert dat deze methode is een zeer nuttig instrument om te onthullen van de associatie tussen moleculaire gebeurtenissen en het embryonale ontwikkelings potentieel. Tijdens de herprogrammering, in de twee-cel als staat van ES-cellen, waardoor de differentiële potentieel van deze cellen zo hoog als die van twee cellen fase embryo's wordt, verandert chromatine losheid in die vergelijkbaar zijn met tw...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Wij danken Satoshi Kishigami, Sayaka Wakayama Hiroaki Nagatomo, Satoshi Kamimura en Kana Kishida voor kritische opmerkingen en technische ondersteuning. Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door het programma van het ministerie van onderwijs, cultuur, sport, wetenschap en technologie voor het bevorderen van de hervorming van nationale universiteiten M.O.; de Society van Japan voor de bevordering van de wetenschap (16H 02593), Asada Science Foundation en de Stichting van de wetenschap van de Takeda aan T.W. De financiers had geen rol in de studie ontwerp, gegevensverzameling en analyse, besloten tot bekendmaking of voorbereiding van het manuscript.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Confocal laser scaning microscopeOlympusFV1200FV1000 kan ook worden gebruikt voor FRAP-analyse (referentie #7)
Thermo plateTokai HitTP-110RH26
Inverted microscopeOlympusIX71
Micro manupilatorNarishigeMMO-202ND
Pieze Micro MicromanipulatorPrime techPMAS-CT150
35 mm culture dishFalcom35100835 x 100 mm stijl; voor IVF
60 mm culture dishFalcom35100760 x 15 mm stijl; voor embryocultuur
50 mm culture dishFalcom35100650 x 9 mm stijl; voor manipulatie op het podium
50 mm glass bottom dishMatsunamiD91040050 mm schaal, 27 mm φ gat grootte; voor FRAP-analyse
Mineral oilOrganic spceiality chemicals625071Voor FRAP-analyse op de glazen bodem schalen
Mineral oilSigmaM8410-1LVoor IVF en embryocultuur
glass capillaryDrummond1-000-1000Voor het hanteren van muizen zygoten
Borosilicate glassPrime techB100-75-10-PTVoor micro-injectie van mRNA
Micropipett pullerSutter instrumentP-97/IVFVoor de voorbereiding van de injectie of holding neadle (buiten diameter: 80 µm, binnendiameter: 10 µm) 
Microforge NarishigeMF-900
mMESSAGE MACHINE SP6 Transcription kitThermo
Fisher scientific		AM1340
Poly (A) tailing kitThermo
Fisher scientific		AM1350
PVP solution 10% (PVP-HTF)IrvineSceientific99311HEPES gebufferde HTF bevattende 10% PVP
Sodium HEPESSigmaH3784
pTOPO eGFP-H2BTemplate plasmid voor eGFP-H2B mRNA (referentie #6)
NorthernMax Gly Sample loading Dye Thermo
Fisher scientific		AM8551Voor elektroforese van in vitro getranscribeerd mRNA
Phenol chloroform isamyl alcoholnacalai tesque25970-14
Chloroformnacalai tesque 08401-65
Not ITOYOBONOT-111X
EthachinmateWAKO318-01793
3664 Otical power meterHioki3664 Vermogensmeter voor laservermogen
StereomicmicroscopeOlympusSZX16

Referenties

  1. Burton, A., Torres-Padilla, M. E. Epigenetic reprogramming and development: a unique heterochromatin organization in the preimplantation mouse embryo. Brief Funct Genomics. 9, 444-454 (2010).
  2. Okada, Y., Yamaguchi, K. Epigenetic modifications and reprogramming in paternal pronucleus: sperm, preimplantation embryo, and beyond. Cell Mol Life Sci. 74, 1957-1967 (2017).
  3. Ooga, M., Fulka, H., Hashimoto, S., Suzuki, M. G., Aoki, F. Analysis of chromatin structure in mouse preimplantation embryos by fluorescent recovery after photobleaching. Epigenetics. 11, 85-94 (2016).
  4. Meshorer, E., et al. Hyperdynamic plasticity of chromatin proteins in pluripotent embryonic stem cells. Dev Cell. 10, 105-116 (2006).
  5. Boskovic, A., et al. Higher chromatin mobility supports totipotency and precedes pluripotency in vivo. Genes Dev. 28, 1042-1047 (2014).
  6. Yamagata, K., Ueda, J. Long-term live-cell imaging of mammalian preimplantation development and derivation process of pluripotent stem cells from the embryos. Dev Growth Differ. 55, 378-389 (2013).
  7. Ooga, M., Wakayama, T. FRAP analysis of chromatin looseness in mouse zygotes that allows full-term development. PLoS One. 12, e0178255(2017).
  8. Quinn, P., Begley, A. Effect of human seminal plasma and mouse accessory gland extracts on mouse fertilization in vitro. Australian journal of biological sciences. 37, 147-152 (1984).
  9. Chatot, C. L., Lewis, J. L., Torres, I., Ziomek, C. A. Development of 1-cell embryos from different strains of mice in CZB medium. Biology of reproduction. 42, 432-440 (1990).
  10. Bae, J., Sung, B. H., Cho, I. H., Song, W. K. F-actin-dependent regulation of NESH dynamics in rat hippocampal neurons. PLoS One. 7, e34514(2012).
  11. Dieteren, C. E., et al. Defective mitochondrial translation differently affects the live cell dynamics of complex I subunits. Biochim Biophys Acta. 1807, 1624-1633 (2011).
  12. Subramanian, V., et al. H2A.Z acidic patch couples chromatin dynamics to regulation of gene expression programs during ESC differentiation. PLoS Genet. 9, e1003725(2013).
  13. Hayashi-Takanaka, Y., et al. Tracking epigenetic histone modifications in single cells using Fab-based live endogenous modification labeling. Nucleic Acids Res. 39, 6475-6488 (2011).
  14. Yamazaki, T., Yamagata, K., Baba, T. Time-lapse and retrospective analysis of DNA methylation in mouse preimplantation embryos by live cell imaging. Dev Biol. 304, 409-419 (2007).
  15. Puschendorf, M., et al. PRC1 and Suv39h specify parental asymmetry at constitutive heterochromatin in early mouse embryos. Nat Genet. 40, 411-420 (2008).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Zygotische FRAPconfocale microscopiemicro-injectieeGFP-H2B mRNAzygoteontwikkelinglive imagingverwarmingsplaat voor thermos-plate
Zygotic fluorescentie herstel na het ontkleuren aangebracht van foto analyse voor chromatine losheid waarmee voldragen ontwikkeling
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.