Een eenvoudige en efficiënte methode voor In Vivo Cardiac-specifieke genetische manipulatie door Intramyocardial injectie in muizen

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol voor cardiale-specifieke genetische manipulatie in muizen. Onder verdoving, werden de muis harten externalized door de Vierde intercostale ruimte. Vervolgens blot adenovirussen coderen specifieke genen werden ingespoten met een injectiespuit in het myocardium, gevolgd door eiwit expressie meting via in vivo imaging en Western analyse.

Samenvatting

Genetische manipulatie specifiek in het hart aanzienlijk versterken het onderzoek van hart ziekte pathomechanisms en hun therapeutisch potentieel. In vivo cardiale-specifieke gen levering wordt vaak bereikt door lokale of systemische levering. Systemische injectie via staart ader is eenvoudig en efficiënt in de cardiale genexpressie manipuleren met behulp van recombinant adeno-associated virus 9 (AAV9). Echter, deze methode vereist een relatief hoge hoeveelheid vector voor efficiënte signaaltransductie, en kan resulteren in nontarget orgel gene transductie. Hier beschrijven we een eenvoudige, efficiënte en tijdbesparende methode van intramyocardial injectie voor in vivo cardiale-specifieke genetische manipulatie in muizen. Onder verdoving (zonder ventilatie), de primaire en secundaire borstspieren waren ronduit ontleed, en het hart van de muis was snel blootgesteld door handmatige externalization via een kleine incisie in de Vierde intercostale ruimte. Adenovirus codering luciferase (Luc) en vitamine D-receptor (VDR), of korte haarspeld RNA (shRNA) gericht op VDR, werd vervolgens met een spuit Hamilton geïnjecteerd in het myocardium. Latere in vivo imaging aangetoond dat luciferase was succesvol overexpressie specifiek in het hart. Bovendien bevestigd westelijke vlekkenanalyse de succesvolle overexpressie of zwijgen van VDR in het hart van de muis. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek worden gebruikt voor genetische manipulatie, evenals de injectie van cellen of andere materialen zoals nanogels in het hart van de muis.

Inleiding

Cardiale ziekte is de belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit wereldwijd^1,2. Het gebrek aan effectieve therapeutische strategieën voor levensbedreigende hartaandoeningen met inbegrip van myocardinfarct en hartfalen trekt intensieve verkenning van onderliggende pathomechanisms en identificatie van nieuwe therapeutische opties³. Voor deze wetenschappelijke verkenningen is cardiale-specifieke genetische manipulatie gebruikte^4,5. Cardiale genetische manipulatie kan worden bereikt door het genoom bewerken met behulp van de krachtige transcriptie activator-achtige effector nuclease (TALEN) en geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische herhaalt (CRISPR) / CRISPR geassocieerde eiwit 9 (Cas9) hulpmiddelen, of door levering van ectopische genetische materialen (bijv., virus vectoren uitvoering genen coderend voor eiwitten van belang)⁶. Hoewel genoom bewerken kunt wijzigingen van de precieze en Spatio genoom in levende muizen, is het nog steeds een tijdrovend en arbeidsintensief praktijk⁶. Als alternatief, cardiale-specifieke genetische manipulatie door virus vector of kleine interfereren RNA (siRNA) complexe levering worden routinematig uitgevoerd⁶.

Virus vector levering aan het hart volwassen muis wordt bereikt door ruwweg twee strategieën: systemische of lokale injectie. Systemische injectie van cardiotropic serotype van AAVs zoals AAV9 is noninvasive voor cardiale specifiek gen manipulatie⁷. Echter, deze methode vereist een relatief hoge hoeveelheid vector nodig voor efficiënte transductie en genexpressie, en kan resulteren in aanzienlijke transductie van nontarget organen zoals de spieren en de lever⁷. Lokale virus injectie wordt bereikt door intramyocardial injectie of intracoronary levering⁷. Intracoronary levering leidt tot een meer gelijkmatige verdeling van het virus binnen het hart in vergelijking met intramyocardial injectie. De nadelen van deze techniek zijn echter de snelle wash out van virale vectoren aan de systemische circulatie en Signaaltransductie in nontarget organen⁸, en de eis van apparaten voor de meting van de druk tijdens de operatie. Intramyocardial injectie maakt betere retentie van het virus in het myocardium evenals Sitespecifiek levering, maar het mislukt gelijkmatig verdelen virale vector daarentegen,⁷. Voor kleine dieren is intracoronary levering technisch moeilijk uit te voeren, terwijl de systemische AAV9 injectie en intramyocardial injectie meer algemeen beoefend^{4,5,7 zijn}. Hoewel systemische injectie gemakkelijk uit te voeren is, conventionele intramyocardial injectie vereist mechanische ventilatie en Thoracotomie, uitgebreide weefselschade veroorzaakt, en tijdrovend is.

In dit verslag beschreven we een eenvoudige, tijdbesparende en zeer efficiënte methode voor intramyocardial injectie. Adenovirus codering luciferase en VDR of shRNA targeting VDR, werd geïnjecteerd om te manipuleren cardiale genexpressie. Eenmaal onder de knie, kan deze methode worden gebruikt voor genetische manipulatie, evenals de injectie van cellen of andere materialen in het hart van de muis.

Protocol

Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens de nationale instituten van gezondheid richtsnoeren inzake het gebruik van proefdieren, en door het Vredesinstituut dier ethisch comité zijn goedgekeurd. Mannelijke C57BL/6J muizen (leeftijd 8-10 weken) werden gebruikt voor alle experimenten. Muizen werden gehuisvest onder pathogenen vrije voorwaarden bij 24 ° C ± 4 ° C, onder een 12-h licht/donker cyclus, met gratis toegang tot water en voedsel.

1. bereiding van de oplossing van het Adenovirus

1. Bij aankomst van de gezuiverde adenovirus oplossing, bewaar de oplossing in een vriezer-80 ° C.
   Opmerking: Het adenovirus injectie werd uitgevoerd in levensvatbare muizen. Om ervoor te zorgen de steriliteit van de adenovirus vector, adenovirus (codering luciferase, VDR of shRNA targeting VDR) waren voorbereid en gezuiverd commercieel^9,10.
2. Op de dag van de operatie, neem de gezuiverde adenovirus oplossing (3 x 10¹⁰ plaque vormende eenheden [pfu] /mL) uit de vriezer-80 ° C en adenovirus vector oplossing op ijs ontdooien.
3. Zet op een gelaatsmasker, steriele handschoenen en steriele jurk.
4. Bereiden van een 50-µL Hamilton spuit die de dag vóór de operatie is gesteriliseerd.
   Opmerking: Voor sterilisatie, de spuit Hamilton was gewikkeld in gaas en geplaatst in een sterilisator van hoge temperatuur/hoge druk. De wijze van "Sterilisatie bij de solid" werd geselecteerd en sterilisatie werd begonnen door op de "start"-knop te drukken.
5. Na het volledig ontdooien van de gezuiverde adenovirus oplossing, spuiten van de buis met adenovirus oplossing met 75% ethanol, en verplaats het adenovirus oplossing in een laminaire flow steriele kap.
6. Gecombineerd in een laminaire flow steriele kap, 50 µL adenovirus oplossing met behulp van de Hamilton spuit zonder naald, gevolgd door beslag op een 30 G naald op de spuit Hamilton.
7. Houdt de spuit met de naald 30 G omhoog en duw voorzichtig de plunjer van de injectiespuit totdat de naald is gevuld met adenovirus oplossing (bevestigd door de verschijning van de eerste druppels van de oplossing van de punt van de naald).
   Opmerking: Het duurt ongeveer 45 µL oplossing te vullen de 30 G naald, dus nu bijna geen oplossing zichtbaar in de spuit is.
8. Gebruik de bovenstaande bereid spuit aan zorgvuldig gecombineerd een andere 30 µL adenovirus oplossing, en plaats de losjes afgetopte spuit op ijs voor later gebruik.

2. narcose en operationele voorbereiding

1. Voeg 20 mL Isofluraan in een vaporizer Isofluraan en de vaporizer Isofluraan verbinden met een zuurstoftank.
2. Open de klep en laat de zuurstof vloeien voort uit de zuurstoftank aan de Isofluraan vaporisator. Het debiet van de zuurstof op 2 L/min via een zuurstof stroom monitor in de vaporizer Isofluraan handhaven.
3. Verdoving van de muis met 4% Isofluraan in 100% zuurstof (2 L/min) induceren gedurende 2 min. in een kunststof kooi verbonden aan de Isofluraan vaporisator.
4. Neem uit de narcose muis uit de kunststof kooi, en veilig op een kunststof platform in de vatbaar positie in een laminaire flow steriele kap, en onderhouden van anesthesie met 2% Isofluraan in 100% zuurstof (2 L/min) via een neus kegel.
5. Bevestig voldoende verdoving door het uitblijven van Teen snuifje antwoord.
6. Steriele ophthalmic crème toepassen op elk van beide ogen te behoeden voor het hoornvlies drogen.
7. Het scheren van de borst en bovenbuik. Verkrijgbare ontharende room van toepassing op de geschoren site voor 1 min. verwijderen de ontharende room en de resterende bont met natte gauzes.
8. Het steriliseren van de chirurgische site (linker onderste deel van de borst) met 3 scrubs van jodium-chloorhexidine gebaseerd antiseptisch middel (bijvoorbeeld entoiodine). Dekking van de chirurgische site met een steriele draperen.

3. Intramyocardial injectie van Adenovirus in muis hart

1. Uittrekken van de handschoenen en zetten van een nieuw paar steriele handschoenen.
2. Steriliseer de pincet, een micro-mug hemostat, een paar chirurgische scharen, en de houder van een naald op de dag vóór de operatie in een hoge temperatuur/hoge druk sterilisator (zienoot stap 1.4).
3. Het maken van een 0,5 cm huid incisie langs de verbindingslijn tussen twee van de xiphoid en oksel. Bot ontleden de pectoral grote en kleine borstspieren met pincet en een micro-mosquito hemostat.
4. Bloot de intercostale ruimte door het intrekken van de pectoral grote en kleine borstspieren. Doorboren via en open de Vierde intercostale ruimte (of de breedste intercostale ruimte door observatie) met een hemostat micro-mug.
5. Duw het hart naar de incisie te belichamen het hart met de wijsvinger van de niet-dominante hand door zachtjes te drukken tegen de rechterzijde van de borstwand.
6. Zachtjes beveiligen het externalized hart met de wijsvinger en de duim van de niet-dominante hand.
7. Het injecteren van een totaal van 30 µL adenovirus oplossing in het myocardium van het linkerventrikel in drie locaties (ventrale dorsale en laterale wand van de linkerventrikel) via de Hamilton spuit gevuld met adenovirus (Figuur 1 c) met de dominante hand.
8. Na voltooiing van de injectie, het hart onmiddellijk terug in de intrathoracale ruimte te plaatsen.
9. Handmatig het evacueren van de lucht in de intrathoracale ruimte door zachtjes te drukken op de borstwand richting de huid incisie site.
   Opmerking: Succesvolle lucht evacuatie kan worden aangetoond door het klapperen van de pectoral grote en kleine borstspieren veroorzaakt door de verdreven lucht.
10. Sluit de huid door horizontale matras hechtdraad met een 5-0 zijde hechtdraad.
    Opmerking: De pectoral grote en kleine borstspieren moeten niet worden ingehecht, omdat zij alleen bot zijn ontleed en hun anatomische structuren intact gedurende de operatie zijn.

4. postoperatieve Management

1. Beheren buprenorfine (3 mg/kg) tweemaal dagelijks via subcutane injectie postoperatieve om pijn te verminderen voor de eerste 48 uur na operatie¹¹.
2. Na operatie, onmiddellijk handhaven de muizen op een warmte pad (37 ° C) volledig hersteld. Nadat het volledig herstelt, plaatst u de muisaanwijzer naar de kooi.
3. De gebruikte Hamilton spuit en 30 G naald van de spuit in een hoge temperatuur/hoge druk sterilisator steriliseren (zienoot stap 1.4). Het verzamelen van de gesteriliseerde 30 G naald van de spuit in een container slijpsel.

5. in Vivo Imaging voor het meten van de cardiale Luciferase expressie

1. Op dag 5 na het adenovirus inspuiten, bereiden een verse stockoplossing van luciferine bij 15 mg/mL in een Dulbecco van fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS). Filtreer de oplossing door een 0,2 µm filter.
2. Tijdens peritoneally injecteren de wakker muizen met de luciferine oplossing bij 150 mg/kg lichaamsgewicht.
3. Hiermee zet u de imaging system.
4. Na automatische zelftest van de imaging systeem, selecteer de grafische modus als "Verlichte" en maken de volgende instellingen: blootstelling: automobiel; Weggooien: 8; FStop: 1; Excitatie: Blokkeren; Emissie: Open.
5. Anesthetize op 10 min. na luciferine injectie, de muizen door Chloraalhydraat injectie (300 mg/kg lichaamsgewicht). Bevestig voldoende verdoving door het uitblijven van Teen snuifje antwoord.
6. Beveilig de narcose muizen op een verwarmde imaging podium in de vatbaar positie, met de borst die gericht zijn op de camera.
7. Verzamelen van beelden (1 beeld voor elke muis) en kwantificeren van de intensiteit van de signalen door te tekenen van identieke circulaire meting regio's van belang (ROI) rond de borst.
8. Na de verzameling van beelden, offeren de muizen en de weefsels verzamelen zoals vermeld in de volgende sectie.

6. het oogsten van weefsels

1. Op verschillende tijdstippen na injectie van virus (figuur 1B), anesthetize van de muizen met 4% Isofluraan, handhaven van anesthesie met 2% Isofluraan via een neus kegel en veilig op een kunststof platform in de vatbaar positie.
2. Maak een ventral midline-incisie in de voorste hals. De juiste gemeenschappelijke halsslagader bloot door het intrekken van de omohyoid en de sternocleidomastoideus spieren.
3. De muizen door transecting de juiste gemeenschappelijke halsslagader en zuig het bloed offeren.
4. Maak een ventral midline-snede in de buik. Delen van de ribben aan weerszijden van de ribbenkast langs de midclavicular-lijn en transect van het middenrif.
5. Het hart door het opheffen van de xiphoid bloot. Vinden de oplopende aorta en zachtjes verwijderen de gerelateerde vetweefsel.
6. Cannulate van de aorta en de retrogradely het perfuse van het hart met een 30 G naald gekoppeld aan een 1 mL spuit gevuld met 0,5 mL van 4 ° C fosfaatbuffer (PBS).
7. Na perfusie, accijnzen het hart en het in de linker en rechter ventrikel verdelen. Accijnzen op de lever, de longen, en de milt.
8. Bewaar alle verzamelde weefsels na twee wasbeurten in koude PBS (4 ° C), afzonderlijk in cryogene flesjes in vloeibare stikstof.

7. bepaling van eiwit expressie

1. Bereiden homogenisering buffer door protease inhibitor cocktail in de handel verkrijgbare lysis-buffermengsel in een verhouding van 1:100 toe te voegen. Berekenen van het totale volume op basis van het aantal monsters dat moet worden verwerkt. Houd de bereid homogenisering buffer bij 4 ° C voor later gebruik.
2. Neem uit de weefsels uit de vloeibare stikstof tank. Weeg het weefsel op hoge-precisie weegschaal (ongeveer 60 mg voor elk stukje weefsel).
3. Het weefsel overbrengen in een nieuwe 1.5-mL microcentrifuge buis. Voeg onmiddellijk 200 µL homogenisering buffer en precooled 1.5-mm stalen ballen (4 ° C) in de microcentrifuge buis.
4. Beveilig de buizen van de microcentrifuge in precooled (4 ° C) metalen houders in een automatische weefsel schuurmachine en homogenisering beginnen door het starten van de machine met de volgende instellingen: frequentie: 70 Hz; tijd: 120 s.
5. Na homogenisatie, Centrifugeer het homogenaat (16.000 × g, 4 ° C) en het supernatant zorgvuldig overbrengen in een nieuwe 1.5-mL-buis met een pipet 100 µL.
6. Toevoegen van laden buffer oplossing (5 x) aan het supernatant proteïne in een verhouding van 1:4 en denatureren van het eiwit bij 100 ° C gedurende 5 minuten.
7. De eiwit expressie niveaus in het hart en andere orgel weefsels worden verder gecontroleerd door westelijke vlekkenanalyse (vertegenwoordiger van de resultaten worden weergegeven in figuur 2C en Figuur 3) volgens het protocol beschreven¹².

Resultaten

Het experiment-protocol en een aantal van de belangrijkste stappen voor de gerapporteerde methode worden weergegeven in Figuur 1. 5 dagen na intramyocardial injectie van adenovirus coderen luciferase (Adv-luc), in vivo imaging in adv-luc geïnjecteerd muizen aangegeven robuuste overexpressie van luciferase specifiek in het hart (figuur 2A, B), die was bevestigd door westelijke vlekkenanalyse (

Discussie

Het onderhavige verslag toont een gemodificeerde techniek voor intramyocardial injectie van virale vectoren voor cardiale genetische manipulatie, die werd gewijzigd van een methode voor myocardiaal infarct inductie door Gao et al. ¹³ momenteel, in vivo karakterisering van specifiek gen functies meestal betrekking hebben op de generatie van knock-out of transgenic muizen^3,14,15,

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Uitrustingen
Laminair stroming steriele kap	Fengshi Animal Experimenteel   Apparatuur Techonology Co., Ltd. (Soochow, China)	FS-CJ-2F
Centrifuge	Thermo Scientific (Waltham, USA)	75005282
Weefsel maalmachine	Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China)	Scientz-48
Hoge temperatuur/hoge druk sterilisator	Hirayama (Saitama, Japan)	HVE-50
Isoflurane verdamper	Matrix (Orchard Park, USA)	VIP3000
IVIS   Lumina III beeldvormingssysteem	PerkinElmer (Waltham, USA)	CLS136334
Precisie   weegschaal	Sartorius (Göttingen, Duitsland)	28091873
Instrumenten
Eppendorf pipet (100 µL)	Eppendorf (Westbury, USA)	4920000059
Eppendorf pipet (10 µL)	Eppendorf (Westbury, USA)	4920000113
Pincet	Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp.	JD4020	Geboogde punt
Hamilton spuit	Hamilton (Nevada, USA)	80501	Volume 50 μL
Micro-muggenstang	F.S.T (Foster City, USA)	13011-12	Geboogd, puntbreedte 1,3 mm
Nadelhouder	Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China)	J32110
Chirurgische schaar	F.S.T (Foster City, USA)	14002-12
1-mL Spuit	WeiGao Group Medical Polymer Co.,Ltd. (ShangDong, China)
Materialen en reagentia
Anti-GAPDH antilichaam	CST (Danvers,   USA)	#2118
Anti-Luciferase antilichaam	Abcam (Cambridge, UK)	ab187340
Anti-konijn IgG	CST (Danvers,   USA)	#7074
Anti-VDR antilichaam	Abcam (Cambridge, UK)	ab109234
Buprenorfine	Thermo Scientific (Waltham, USA)	PA175056
Chloraalhydras	LingFeng Chemical (ShangHai, China)
Cryogene Vials	Thermo Scientific (Waltham, USA)	375418	1,8 mL
Ontharingscreme	Veet (Shanghai, China)
Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing	Gibco (Grand Island,   USA)	14040133
Entoiodine	LiKang (Shanghai, China)	310132
EP buis	Sarstedt (Newton, USA)	PCR001
Filter	Millipore (Bedford, USA)		Poriegrootte 0,2 µm
Isofluraan	Yipin Pharmaceutical Company (Hebei, China)
Luciferine	Promega (Madison, USA)	P1041
Lyse buffer voor western   blot	Beyotime (Shanghai, China)	P0013J	Zonder remmers
Oftalmische crème	Apex Laboratories ( Melbourne, Australië))
PBS	Gibco (Grand Island,   USA)	10010023
Protease remmer cocktail	Thermo Scientific (Waltham, USA)	78438
5-0 zijdedraad	Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China)
Stalen bal	Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China)		Breedte 1,5 mm
Spuitnaald	Kindly Medical Devices Co., Ltd. (Zhejiang, China)		30 gauge
Warme mat	Warmtact Electrical Heating Technology Co., Ltd. (Guangdong, China )	NF-GNCW