Een bloed-gebaseerd testen voor de detectie van ROS1 en RET Fusion Transcripts from circulerende RNA zuur met behulp van digitale Polymerase-kettingreactie

Samenvatting

Detectie van circulerende RNA acid (cRNA) van bloed is een unmet behoefte in klinische diagnostiek. Hier beschrijven we methoden die kenmerkend zijn voor cRNA van niet-kleincellige longkanker kankerpatiënten met behulp van gevoelige en specifieke digitale polymerase-kettingreactie. De tests voldoen aan ontwerp te detecteren fusion varianten binnen 72 uur.

Samenvatting

Hebben we nieuwe methoden voor de isolatie en de karakterisering van tumor-afgeleide circulerende RNA acid (cRNA) voor bloed-gebaseerde vloeibare biopsie. Robuuste detectie van cRNA verhaald bloed vormt een oplossing voor een kritische unmet behoefte in klinische diagnostiek. De test begint met het verzamelen van bloed in bloed collectie buizen met conserveringsmiddelen die cRNA stabiliseren. Cel-vrij, exosomal en bloedplaatjes-geassocieerde RNA is geïsoleerd van plasma in deze testsysteem. De cRNA wordt via reverse-herschreven als cDNA (cDNA) en versterkt met behulp van digitale polymerase-kettingreactie (dPCR). Monsters worden geëvalueerd voor zowel het doel biomerker evenals een controle-gen. Validatie test opgenomen limiet van detectie, precisie en robuustheid studies met analytische monsters. De methode ontwikkeld als gevolg van deze studies reproducibly detecteren meerdere varianten van de fusie voor ROS1 (C-Ros oncogen 1; 8 varianten) en RET (herschikt tijdens transfectie oncogen; 8 varianten). De monster verwerking workflow is geoptimaliseerd zodat testresultaten consequent binnen 72 uur na ontvangst van de steekproef kunnen worden gegenereerd.

Inleiding

Tot 25% van de niet-kleincellige longkanker (NKCLK) kunnen patiënten niet hebben voldoende weefsel beschikbaar voor het testen op het moment van diagnose. Zelfs in gevallen waar weefsel beschikbaar is, kan het niet van voldoende hoeveelheid of kwaliteit uit te voeren aanbevelenswaardig moleculaire tests^1,2. In gevallen waar er genoeg weefsel van een biopsie voor Moleculaire profielen, patiënten moeten verscheidene weken of langer wachten op resultaten, of behandeling zonder moleculaire resultaten^3,4te beginnen. Het is echter essentieel dat informatieve moleculaire diagnose beschikbaar gezien de komst van meerdere gerichte behandelingsopties voor patiënten gediagnosticeerd met NKCLK. Testen van circulerende cel-gratis DNA (cfDNA) van vloeibare biopsie is een oplossing voor de uitdagingen van traditionele weefsel testen^4,5,6. Huidige testen opties voor beroep mutaties in NKCLK met behulp van cfDNA en een soortgelijk dPCR gebaseerde workflow voor snelle resultaat generatie, omvatten de epidermale groeifactor receptor (EGFR) sensibiliserend mutaties ΔE746-A750 en L858R, EGFR weerstand mutatie T790M , KRAS oncogen (KRAS) varianten en B-Raf oncogen (BRAF) variant V600E. Hoewel niet zo breed aangenomen door het veld, bieden circulerende tumor afkomstige boodschapper-RNA (mRNA) geïsoleerd van vloeibare biopsie ook belangrijke klinische informatie^7,8,9. Wij hebben eerder ontwikkeld en rapporteerde over methoden voor multiplexed opsporing van de Echinoderm microtubulus geassocieerde eiwitten zoals 4-Anaplastic lymfoom Receptor Tyrosine Kinase (EML4-ALK) fusion varianten van bloedplasma¹⁰. In dit onderzoek hebben we uitgebreid deze methoden om hogere-orde multiplexed RNA doelstellingen voor ROS1 en RET, die betrekking hebben op acht fusion varianten binnen elke bepaling bevatten. Het doel was het ontwikkelen van een snelle, gevoelige, specifieke en reproduceerbare techniek voor het opsporen van deze varianten van de fusie van het plasma van patiënten eerder gediagnosticeerd met NKCLK.

Het testproces wordt gestart in een arts office met behulp van RNA bloed collectie buizen¹¹te stabiliseren. Deze buizen bevatten conserveermiddel evenals RNase remmers cellen. Monsters worden verzonden prioriteit 's nachts naar het centraal College van Amerikaanse pathologen GLB-geaccrediteerde/klinische laboratorium verbetering amendementen (CLIA)-gecertificeerd laboratorium (klinisch laboratorium) voor verwerking door bevoegd personeel. Zodra ontvangen door het klinisch laboratorium, elke stap van de verwerking verloopt onder de erkende Standard Operating Procedures (SOP). Volbloed gecentrifugeerd om te herstellen van plasma, die vervolgens wordt gebruikt om te isoleren circuleren van RNA die vrij in het bloed of binnen het inkapselen van wordt, zoals exosomes en bloedplaatjes^7,8,9. We geselecteerd om te isoleren RNA van deze vakken, het systeem voor RNA herstel gebaseerd op vergelijkingen van verschillende extractiemethoden. De geïsoleerde RNA is geconcentreerd en omgekeerde herschreven als cDNA. Verschillende reverse-transcriptase enzymen en gen-specifieke primers werd geëvalueerd tijdens de optimalisatie van de cDNA synthese methode om te ROS1 en RET doel transcript conversie¹⁰maximaliseren. Dit is essentieel voor lage overvloed circulerende afschriften, zoals fusion tumor-afgeleide varianten. Tot slot, we geoptimaliseerd dPCR primer en sonde concentraties toe voor multiplexed detectie van RET of ROS1 fusion varianten en het controle-gen, glucuronidase-β (GUSB). Wij vervolgens de beste voorwaarden van elk van de optimalisatie-studies gecombineerd in een vergrendelde Slotprotocol voordat met de studies van de analytische validatie in dit verslag beschreven. Dit protocol en deze resultaten verschaft de grondslag voor een snelle en gevoelige workflow voor de routinematige detectie van zeldzame fusion varianten in omloop.

Protocol

De fabrikanten instructies worden gevolgd voor de reagentia die hieronder vermeld, tenzij anders beschreven. De PCR-tests zijn verkrijgbare producten ontworpen voor het opsporen van ROS1 en RET fusies.

1. werken met RNA ter voorbereiding van omgekeerde transcriptie (RT)-dPCR: laboratorium beste praktijken

1. Maak een RNase-vrije omgeving bij het werken met RNA.
   1. Verkrijgbare sprays ter inactivering van besmettelijke RNases gebruiken.
   2. Gebruik gecertificeerde RNase-vrije reagentia, tips en buizen. Gebruik barrière tips voor pipettors om te voorkomen dat de invoering van RNases of kruisbesmetting van monsters.
2. Draag altijd een laboratorium jas om te voorkomen dat deeltjes van kleding in uw sample. Wijst een specifieke lab jas om te gebruiken met RNA verwerking.
3. Draag handschoenen om te voorkomen dat besmetting van de steekproef van RNases in de huid. Handschoenen vaak worden gewijzigd.
   Opmerking: Neem aan dat laboratorium oppervlakken zijn verontreinigd met RNase omdat ze worden blootgesteld aan het milieu. Handschoenen die contact met huid, haar, deurknoppen, vriezer handgrepen, pennen/stiften, etc. wordt verondersteld dat niet langer worden RNase-vrij.
4. Pipettors, benchtops, centrifuges en andere werkoppervlakten ontsmetten met een RNase inactivatie spray voorafgaand aan gebruik.
5. Indien mogelijk, houden een set van apparatuur alleen voor gebruik met RNA.
6. Het minimaliseren van verstoring van de luchtstroom in lab gebieden bij het werken met RNA monsters om te voorkomen dat deeltjes van monsters vallen of verontreiniging van het werkgebied.
7. Winkel gezuiverd RNA bij-80 ˚C.
8. Vermijd meerdere freeze-watervalen van RNA samples, omdat dit leiden tot aantasting van het kan.

2. productie van analytische RNA materiaal voor de positieve controles

1. Synthetisch DNA met behulp van gepubliceerde mRNA opeenvolgingen voor fusion varianten van belang¹⁰ontwerpen.
   1. Selecteer een mRNA fusion-reeks waarin de fusie site plus voldoende lengte flankerende aan elke kant ter dekking van de PCR-amplicon voor een bepaalde fusie variant.
   2. Selecteer nucleotidesequenties tussen 50-250 nt om na te bootsen de grootte van de circulerende gevangen met behulp van bloedplaatjes verrijkte plasma RNA.
   3. Toevoegen van een reeks van de promotor T7 (5'-CAGAGATGCATAATACGACTCACTATAGGGAGA-3') aan het einde 5' van de doel-reeks.
2. De volgorde van synthetische sequenties zoals dubbele gestrande deoxyribonucleic acid (DNA) fragmenten.
3. Synthetisch DNA in Tris-EDTA (TE) buffer om een eindconcentratie van 10 ng/µL reconstrueren.
4. Converteren 60 ng synthetisch DNA naar RNA met behulp van in vitro transcriptie.
5. Zuiveren van RNA afschriften met behulp van fenol/guanidine gebaseerde reagens¹².
   1. Omvatten DNase ik, RNase-vrij om te verwijderen van de resterende sjabloon DNA.
6. Meten van concentratie van gezuiverde in vitro RNA met behulp van een commercieel beschikbare Fluorimeter met RNA-specifieke kleurstoffen en normen. Zorg ervoor dat de RNA is binnen het bereik die aanvaardbaar is voor de gekozen normen. Verdunning kan worden verlangd.
7. Bevestig succesvolle transcriptie door met behulp van een 2% agarose gel gemengd met RNA gel vlek en een hoog bereik RNA ladder met inbegrip van 50-250 nt groottewaaier gelelektroforese.
   1. Belasting 500 ng van elke in vitro RNA op een gel.
   2. Stel de gel 5 V/cm.
   3. Visualiseren van enkele bands met behulp van de verlichting en de resultaten documenteren.
   4. Bevestigen verwachte transcript grootte voor elk van de varianten van de fusie (gebaseerd op ontwerp in stap 2.1.2).
8. Opsporing van elke in vitro RNA door RT-dPCR met behulp van gecompenseerde variant-specifieke PCR-test te bevestigen (Zie stappen 5-8 van dit protocol).
9. Optioneel: Bereiden een mengsel mengsel van in vitro RNA dat elk van de varianten van de fusie en de controle gene GUSB bevat.
10. Als stap 2.9 wordt uitgevoerd: detectie van elk van de varianten van de fusion opgenomen in het mengsel van de controle door de dPCR met behulp van variant-specifieke PCR-testen (zie stap 5-8 van dit protocol) bevestigen.
11. Bepalen de gewenste input concentratie voor analytische positieve controles door het testen van concentraties variërend van 0,25 tot en met 2.5 fg¹⁰. Concentratie op basis van gewenste aantal afdrukken te kiezen.
12. Na bevestiging, 10 µL eenmalig gebruik aliquots van analytische RNA te bereiden voor gebruik in de positieve controle (stap 4.4) en de winkel op-80 ˚C.

3. donor Specimens

1. Het verzamelen van 10 mL menselijk bloed monsters in 10 mL bloed collectie buizen (BCT) met conserveermiddel RNA cel-vrij.
   Opmerking: Alle menselijke donors wordt instemming met het onderzoek van gebruik en geen donor-specifieke identificerende informatie worden verzameld of gebruikt tijdens de test.
2. Proces hele bloedmonsters binnen de termijn die is opgegeven door de fabrikant van de BCT.
3. Gebundelde normaal menselijk plasma kan worden gekocht van een commerciële bron voor gebruik binnen de analytische positieve controle. Eenmalig gebruik, 1 mL aliquots van de gebundelde normaal menselijk plasma en winkel op-80 ˚C voorbereiden voor gebruik met de positieve controle (stap 4.4).

4. herstel van circulerende RNA van Plasma

Opmerking: Het is belangrijk om snel te werken tijdens deze procedure.

1. Volbloed buizen bij 200 x g gedurende 20 minuten centrifugeren.
2. Maximaal 4 mL plasma van gecentrifugeerde bloed collectie buis met behulp van een precisiepipet serologische verzamelen. Wees voorzichtig niet te verstoren of de buffy coat laag gecombineerd.
3. Isoleren van circulerende RNA met behulp van een commercieel beschikbare kit die exosomes, bloedplaatjes en RNA van de cel-vrij van plasma vangen kan. Isoleren RNA van positieve controlemonster naast elke partij.
4. Voorbereiden op de positieve controle elke batch van klinische monsters als volgt:
   1. Ontdooi 1 mL gebundeld normaal menselijk plasma aliquoot (stap 3.3).
   2. Ontdooi 10 µL analytische RNA aliquot (stap 2.12).
   3. Positieve controle voor te bereiden door het toevoegen van 10 µL analytische RNA in het normale menselijk plasma monster zodra ethanol is toegevoegd aan het plasma lysate.
5. Elueer monsters met 100 µL van de nuclease-vrij van het water. Onmiddellijk gaan met RNA opruimen en concentratie.
   1. Monsters kunnen worden opgeslagen op nat ijs, en bedekt, voor maximaal een uur.
6. Concentreer je RNA kolom gebaseerde methode en elueer in 9 µL van RNase-gratis water.
   1. Ga onmiddellijk naar stap 5 of monsters op nat ijs houden voor maximaal één uur.

5. omgekeerde transcriptie van RNA aan cDNA

1. Geconcentreerde circulerende RNA monster omzetten in cDNA met behulp van een commercieel beschikbare omgekeerde transcriptie reactie kit, met inbegrip van willekeurige inleidingen (Zie tabel 1 voor componenten).
   Opmerking: Gene specifieke primers zijn optioneel en kunnen worden ontworpen voor test varianten. Primers zijn ontworpen op basis van het doel van de opeenvolging van RNA. Gebruik variant sequenties van de fusie van de stap 2.1.
   1. Geen reverse-transcriptase controlemonster en geen controlemonster RNA (Zie tabel 1).
2. Isoleren van cDNA van omgekeerde transcriptie reactie met behulp van een commercieel beschikbare DNA concentrator spin kolom.
   Opmerking: Deze stap de verwijdering van enzymen, inleidingen en gratis deoxynucleotide trifosfaat (dNTPs) vergemakkelijkt.
3. Gebruik van cDNA onmiddellijk in PCR reacties of bewaren bij-80 ˚C.

6. digitale PCR

Opmerking: Deze PCR is specifiek voor druppel digitale PCR (Zie Tabel van materialen).

1. PCR mix voorzorgsmaatregelen.
   1. Een wegwerp lab jas en nitril handschoenen dragen.
   2. Gebruik PCR Meng reagentia op een toegewijde reagens voorbereiding gebied. CDNA in het gebied alleen-reagens voorbereiding niet behandelen.
   3. Dekking van sondes tijdens het werken om hen te beschermen tegen licht. Buitensporige licht kunt foto bleken de fluorescente kleurstof gekoppeld aan de sonde.
   4. Vervoer van mixen, bedekt en beschermd tegen licht, in een aparte ruimte van het pre versterking voor cDNA wordt toegevoegd.
   5. Toevoegen van cDNA te beproeven aan PCR mix in een PCR schone kap gelegen in pre amplificatie gebied.
2. PCR mixen voorbereiden op een definitieve reactie volume van 20 µL volgens tabel 2.
3. Distribueren van PCR mixen + cDNA aan PCR platen.
   Opmerking: Gebruik van een lay-out van de plaat zoals een gids is aanbevolen.
4. De afdekplaat met behulp van een verwisselbare plaat sealer.
5. Centrifugeer platen kort monsters te verzamelen aan de onderkant van de putten.
6. Mix op plaat shaker op een lage instelling voor 10 s.
7. Centrifugeer platen kort voor het verzamelen van monster bij de bodem van de put.
8. Plaat sealer verwijderen. Een handmatige of automatische druppel-generatiesysteem druppel generatie voor PCR-cDNA mix met ofwel uitvoeren.
   1. Draag voor een handmatige druppel generatie, 20 µL PCR-mix monster putjes op de druppel generatie cartridge. Voeg 70 µL van druppel generatie olie. Bedek met rubber pakking en overdracht cartridge aan handmatige druppel generator om te initiëren druppel generatie. Na druppel generatie, door druppeltjes te overbrengen in een verse PCR plaat met behulp van tips die door de fabrikant aanbevolen. Gecombineerd en afzien van de druppels langzaam, over 5 tot en met 6 s elk, zonder te raken de opening van de tip om de druppel cassette of plaat.
   2. Zegel voor geautomatiseerde druppel generatie, de plaat met een folie afdichting en transfer naar de droplet-generator. Alle tips, cartridges, zorgen en platen zijn in plaats voordat druppel generatie.
9. Volgende generatie van de druppel en overdracht van druppels aan een verse PCR plaat, zegel met een folie plaat sealer en thermische cyclus platen met de instellingen in tabel 3.
10. Nadat de thermische cycler is run voltooid, de plaat met behulp van een droplet-reader gelezen. Maken van een plaat lay-out voor reader-software waarmee de locatie van controle, monsters, enz., en laden in software om te beginnen met lezen.

7. de data-analyse en beoordeling, en generatie van resultaten

1. Plaat Lees resultaten met behulp van commercieel verkrijgbare software analyseren.
2. Ga naar het menu analyseren om te bekijken van tweedimensionale (2D) amplitude percelen.
3. Evalueren de algehele kwaliteit van de gegevens door het bestuderen van de gegevens van de druppel.
   1. Evalueren van gegevens voor totaal aanvaarde gebeurtenis getallen met behulp van het menu gebeurtenissen. Als er minder dan 10.000 evenementen per putje, zorgvuldig evalueren de gegevens voor extra problemen.
   2. Controleer gegevens voor afwijkende fluorescentie amplitudes. Amplitude van de aanzienlijke verschillen en concentratieverschillen tussen monsters geven aan slechte behandeling of vermenging van monsters.
   3. Maak notities van druppel clusters met spray patronen op een 45 graden as, die is een indicatie van slechte kwaliteit druppels of problematisch monsters.
   4. Positieve controle, geen Reverse Transcriptase (RT No) en No RNA controle (NRC) gegevens eerst onderzoeken. Selecteer alle controlemonsters en onderzoeken van cluster kwaliteit bij 2D perceel. Voor juiste drempelmethode, moet een duidelijke scheiding tussen druppel clusters blijken.
4. Voor elke assay instellen variant, de drempel op basis van controleputjes.
   1. Drempelwaarde op 2D percelen hulpprogramma voor het dradenkruis te scheiden van de dubbel negatief druppel bevolking van het besturingselement gene bevolking (aangeduid met 5'-hexachloro-fluoresceïne-CE phosphoramidite sonde), y-as en variant gene bevolking, als presenteren) gelabeld met fluoresceïne amidite OR 6-carboxyfluorescein sonde), x-as.
   2. Som opgehaald uit elk repliceren putje voor één sample.
   3. Express testresultaten als het aantal variant exemplaren aangetroffen.
      Opmerking: Bepalen van de analytische grenswaarde voor het bellen van een positief of negatief monster, het uitvoeren van een normale gezonde donor monster (ten minste 10 afzonderlijke monsters) via de gefinaliseerde proces ingesteld en stellen de cutoff boven geen signaal detecteerbare achtergrond voor de mutatie van belang. Bovendien stellen het aantal controle-exemplaren van de gene moeten noemen een positief of negatief resultaat. Dit besturingselement gene cut-off fungeert als een interne kwaliteitscontrole (QC) voor de evaluatie van de kwantiteit en kwaliteit van elk monster RNA dat wordt verwerkt.

8. controle van de RT-dPCR reactie voorwaarden gebruik cellijnen (optioneel)

1. Gebruiken om te controleren of de detectie van fusion varianten, commercieel beschikbare cellijnen-uiting geven aan de ROS1 of RET smelting mRNA van belang. Ga als volgt te werk:
   1. Meng flash-bevroren cellen in een lysis van de guanidinium gebaseerde oplossing direct uit de bevroren toestand. Zelfs korte ontdooien voordat homogenisering kan leiden tot aantasting van het RNA en verlies.
   2. Isoleren met behulp van silica-membraan spin kolommen ontworpen voor RNA RNA.
   3. Het meten van de concentratie van RNA monsters met behulp van een Fluorimeter RNA-specifieke reagentia en normen.
   4. Verdun geïsoleerde RNA in een achtergrond van wild-type RNA van plasma of een andere commerciële bron.
2. Stappen van omgekeerde transcriptie van RNA, cDNA, digitale PCR, en Data-analyse en beoordeling uitvoeren, en generatie van resultaten vermeld in dit protocol ter detectie van de gewenste variant.

Resultaten

Dit protocol beschrijft een testsysteem ontwikkeld voor de opsporing van RNA fusion varianten voor gebruik bij de meting van de bestuurder mutaties binnen het plasma van de NKCLK patiënten(Figuur 1). Fusion mRNA producten uit de expressie van de meest voorkomende herschikkingen van de RET en ROS1 in de NKCLK bevolking waren geïdentificeerd^{13,14,15,16,17}. Multiplexed PCR testen werden vervolgens ontworpen voor het opsporen van de acht meest voorkomende transcript varianten voor elke doelstelling in NKCLK binnen een enkele reactie. De meest voorkomende translocaties bij de locus ROS1 genereren verenigingen met de delen 5' van de CD74, SDC4, SLC34A2, EZR of TPM3 genen (Figuur 1B). De meest voorkomende translocaties bij de RET -locus leiden tot nevenschikking met KIF5B, waarvoor de bepaling omvat zes exon kruispunten. Extra RET -partners die vallen onder andere met CCDC6 en TRIM33 (Figuur 1C) zijn. In totaal, de tests omvatten ongeveer 88% van ROS1 en 99% van de RET wijzigingen optreden in de NKCLK populatie¹⁷.

De specificiteit van de test onderdelen was eerst geëvalueerd aan de hand van acht individuele in vitro RNAs die de opeenvolging van mRNA bevatten voor de transcripten van de fusie de ROS1 of RET vallende multiplexed testen. Elke soort RNA werd getest tegen elke individuele variant assay dat bestaat uit de multiplexed versie. Er was geen Kruisallergie van deze tests, dus het aantonen van 100% analytische specificiteit binnen de ontworpen multiplex assays (gegevens niet worden weergegeven). Om te bepalen de ondergrens voor detectie van het testprotocol, waren totaal RNA afgeleid van cellijnen uiting van een variant van de fusion opgenomen in de bepaling gemengd in een achtergrond van normale RNA bij concentraties van 5%, 1%, 0,2% en 0,04%. De multiplexed RET en ROS1 variant PCR testen ontdekt zo weinig als variant van de fusion 0,2% (Figuur 2A-B). Bovendien, een voorbereiding van 5% korting-target cellijn afgeleide RNA (het uiten van een afschrift van de fusion EML4-ALK) is niet aangetroffen met de multiplexed ROS1 en RET testen, verder aan te tonen de specificiteit (Figuur 2A-B).

Precisie van het proces van de RT-dPCR werd getest voor beide ROS1 en RET. analytische controle materiaal bestaat uit een mengsel in vitro RNAs was verwerkt in drie concentraties (High, Medium en Low) via omgekeerde transcriptie en dPCR op drie verschillende gelegenheden binnen dezelfde dag (intra-day), op drie opeenvolgende dagen (tussen dag), en met twee-exploitanten (inter operator). Resultaten van het testen van de precisie aangetoond nauwkeurige detectie van zowel het transcript van de fusie van belang, evenals een controle-gen, GUSB, die meegeleverd als een interne QC-metric (figuur 2C-D wordt).

Naast de interne controle van GUSB, werd elke batch van klinische monsters uitgevoerd met een set besturingselementen van de partij. Een positieve controle werd ontwikkeld uit een mengsel van analytische in vitro RNA dat elk van de varianten van de fusion getest in RT-dPCR vertegenwoordigd, evenals analytische in vitro RNA voor GUSB. Deze RNA was spiked in normale menselijk plasma lysate tijdens de RNA extractie en naast de klinische monsters in het gehele protocol werd verwerkt. De geen reverse-transcriptase (No RT) was inderdaad een negatieve controle om te bevestigen de afwezigheid van verontreinigende stof in de workflow van RNA extractie en demonstreren van de specificiteit van de inleidingen voor RNA. Het besturingselement geen RT werd gegenereerd met behulp van hetzelfde materiaal als positieve controle, maar het bevat geen enzym binnen de cDNA synthese reactie. De geen RNA controle (NRC) is een negatieve controle ter bevestiging van de afwezigheid van besmetting van afschriften in de omgekeerde transcriptie reactie componenten. Dit besturingselement werd geïntroduceerd in de workflow bij de cDNA synthese stap, en water is toegevoegd in de reactie in plaats van een RNA-sjabloon. De besturingselementen geen RT en NRC moet negatief in beide kanalen als accurate resultaten te leveren. Tabel 1 bevat een overzicht van de omgekeerde transcriptie reactie onderdelen voor elk besturingselement. Voorbeelden van de 2D percelen voor elk van deze controles worden weergegeven voor de ROS1 (Figuur 3 A-C) en de multiplex assays RET (Figuur 3 E-G). Fusion varianten werden waargenomen met behulp van een sonde met fluoresceïne amidite (FAM) en langs de y-as worden weergegeven terwijl het besturingselement gen, GUSB, werd ontdekt met behulp van een sonde met 5'-hexachloro-fluoresceïne-CE phosphoramidite (HEX) en is op de x-as. Deze batch-besturingselementen werden geëvalueerd in de loop van de 21 dagen om te bepalen van de robuustheid van de test. Fusion positieve druppels en GUSB controle gene druppels werden waargenomen voor ROS1 en RET in alle 21 punten, uitgevoerd in de loop van de studie (Figuur 3D, H). Alle negatieve controles (No RT en NRC) negatieve resultaten opgeleverd over de gehele 21 dagen (gegevens niet worden weergegeven).

De mogelijkheid om op te lossen is een essentieel onderdeel van elke test-protocol moet worden uitgevoerd in de instelling van de klinisch laboratorium. Wij bieden hier, echte wereld voorbeelden van sub-optimale resultaten met behulp van de RT-dPCR-protocol. De eerste is een voorbeeld van een 2D intrige aantonen van het belang van de reverse-transcriptase oncontroleerbaar (Figuur 4A). In dit voorbeeld waren mutant positieve druppels aanwezig ook al er geen conversie van cDNA wegens was het ontbreken van een enzym. Dit resultaat was waarschijnlijk te wijten aan dPCR inleidingen af-target genomic DNA frequentiebanden te versterken. Ontwerp van een bepaling van intron-spanning zal in dit geval te voorkomen dat versterking van genomic DNA. U kunt ook een RNase-vrije DNase enzym kan worden gebruikt voor het elimineren van de besmettende DNA, maar dit wordt niet aanbevolen voor detectie van zeldzame streefcijfers, omdat sommige aantasting van het RNA tijdens de incubatie met het enzym optreden kan. De volgende voorbeeld 2D plot was een NRC met positieve druppels in beide kanalen (Figuur 4B). Dit aangegeven besmetting op enig moment in de installatie van de RT-dPCR. De aanbeveling is in dit geval negeren elke gebruikte bij het testen van potentieel verontreinigd(e) reagentia, grondig ontsmetten van alle apparatuur, en opnieuw testen met verse reactie componenten. Het derde voorbeeld 2D plot gepresenteerd als een nevel van druppels langs een 45° lijn (Figuur 4C). Dit wordt vaak veroorzaakt door scheren en samenvloeiing van druppels. Zorgvuldige druppel behandeling voorafgaand aan temperatuurcycli is essentieel, aangezien druppels gevoelig zijn voor schade. Wij raden het gebruik van geautomatiseerde druppel generatie, indien beschikbaar. Als druppeltjes overdracht handmatig worden gegenereerd, worden bepaalde om te kiezen van de aanbevolen wide-boring tips en zorgvuldige pipetting techniek in dienst. Druppel overdracht vereist traag aspiratie en verstrekking, met elke plaatsvindt meer dan 5-6 seconden, en het is essentieel dat de pipette uiteinde opening niet de druppel cartridge aanraken of goed. Wanneer verstrekking, houd het uiteinde van de pipet op het vloeistofniveau en verhogen het langzaam als druppels zijn verdeelde (Bekijk video demonstratie). De definitieve 2D perceel voorbeeld van een gebrek aan scheiding tussen de positieve en negatieve druppel populaties (Figuur 4 d). Dit kan verschillende oorzaken hebben. Sterke PCR-remmers, zoals detergentia gebruikt in cellysis buffers en een overmaat aan zeer gedegradeerde DNA, kunnen leiden tot verlies van scheiding. In dit geval kunt u overwegen een opschonen stap tussen cDNA synthese en dPCR (zoals beschreven in stap 5 van dit protocol). Ten slotte, gebrek aan scheiding kan ook worden veroorzaakt door versterking van de sub-optimale voorwaarden, en optimalisatie van de PCR-stap moet ook worden overwogen.

Gegevens in Figuur 5 vertegenwoordigen 984 echte wereld patiënt proef turn-around tijden en toont de snelle aard van deze test-workflow. Resultaten werden gemeld aan de behandelende arts zo vroeg als binnen 48 uur (79% van de gevallen) van monster ontvangst en in 95% van de gevallen binnen 72 uur. Kortom, kan het gebruik van gestabiliseerd circulerende RNA bloed collectie buizen, geoptimaliseerde RNA extractie procedures van bloed en RT-dPCR uitgevoerd aan de hand van een geoptimaliseerde protocol met de juiste interne en batch besturingselementen, bieden een snelle testsysteem voor de nauwkeurige detectie van fusion RNA varianten relevante in NKCLK.

Figuur 1 : Overzicht van bloed monster verwerking stappen voor Fusion Variant detectie met behulp van tests die specifiek zijn voor de meest voorkomende RET en ROS1 varianten in NKCLK. (A) monster testen wordt gestart wanneer volbloed wordt getekend en een BCT wordt geleverd binnen de specimen collection kit om het klinisch laboratorium. Circulerende RNA wordt teruggewonnen uit meerdere bronnen binnen de bloedplaatjes verrijkte plasma, reverse transcriptie met gene specifieke priming- en gezuiverd voor gebruik in dPCR. Monsters worden verwerkt met gebruik van een commercieel beschikbare systeem dat bestaat uit druppel generatie (emulsie), versterking en druppel rekenen. Gegevens wordt geanalyseerd met behulp van commercieel beschikbare software. De testresultaten zijn dan gedocumenteerd en gemeld aan de arts test-aanvragen. Het proces is ontworpen om te werken binnen een termijn van 72 uur na ontvangst van het monster naar resultaat release. Acht varianten voor (B) ROS1 en (C) RET vallen binnen de multiplexed testen. Aangepast van Biodesix website met toestemming. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2 : Analytische validatie. Cellijnen uitdrukken (A) SDC4-ROS1 fusion en (B) CCDC6-RET fusion waren verdund in een achtergrond van totale menselijke wild-type RNA (WT RNA). Met elke variant van de fusie, de limiet van detectie opgericht met 0,2% variant frequentie met behulp van voorgedefinieerde criteria voor elke variant assay. Alle monsters boven deze drempel bevatte ook ten minste 21 kopieën van controle gen. 5% EML4-ALK (ALK) standaard in een achtergrond van wild-type RNA werd getest om aan te tonen van de specificiteit van de test, die werd bevestigd door een negatief resultaat. Analytische multiplexed RNA normen werden gemeten op de hoge, middellange, en lage concentraties voor ROS1 (C) en (D) RET. precisie werd geëvalueerd over drie runs op dezelfde dag (Intra-day), drie punten op drie opeenvolgende dagen (tussen dag), en met twee onafhankelijke marktdeelnemers (inter operator). De middelen van het exemplaaraantal gemiddelde en standaardafwijking worden weergegeven. Aangepast van Biodesix website met toestemming. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 3 : Batch verwerking controle voorbeelden en robuustheid gegevens. 2D plot van de ROS1 multiplexed assay dPCR resultaten voor de positieve controle (A), (B) geen reverse-transcriptase controle, en (C) geen controle van de sjabloon RNA. (D) controles werden uitgevoerd op 21 opeenvolgende dagen (met uitzondering van weekends en feestdagen). Exemplaaraantal +/-standaarddeviaties voor positieve controle waren 439 +/-141 ROS1 betekenen. Geen reverse-transcriptase en geen sjabloon besturingselementen werden ook worden uitgevoerd op elke dag, en deze waren allemaal negatief (gegevens niet worden weergegeven). 2D plot van de RET multiplexed assay dPCR resultaten voor de positieve controle (E), (F) geen reverse-transcriptase controle en (G) geen RNA sjabloon controle. (H) controles werden uitgevoerd op 21 opeenvolgende dagen (met uitzondering van weekends en feestdagen). Kopieën +/-standaarddeviaties voor RET positieve controle waren 586 +/-182 betekenen. Niet afgebeeld zijn geen reverse-transcriptase en geen sjabloon-besturingselementen die werden ook uitvoeren op elke dag en het waren allemaal negatief. Aangepast van Biodesix website met toestemming. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 4 : Oplossen van problemen met RT-dPCR. 2D percelen die sub-optimale dPCR verkregen resultaten wanneer er (A) besmetting binnen de omgekeerde transcriptase oncontroleerbaar, (B) besmetting binnen het RNA oncontroleerbaar, (C is) scheren en samenvloeiing van druppels en (D ) slecht geoptimaliseerde PCR voorwaarden of PCR remming. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 5 : Draai rond tijd (TAT). TAT (in uren) werd samengesteld voor tests aanvraagt een RNA-variant (n = 984). Gegevens uitsluit weekends, feestdagen en monsters gedurende > 24 h als gevolg van onvolledige klinische informatie op het laboratorium Test aanvragen vormen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Tabel 1: Voorbereiding van omgekeerde transcriptie reagentia voor procesbeheersingsmaatregelen.

Component	Volume
2 x dPCR supermix voor sondes (geen 2'-deoxyuridine 5'-trifosfaat)	10 ΜL
20 x variant doel inleidingen/sondes instellen (450 nmol/L primers, 250 nmol/L FAM sonde)	1 ΜL
20 x besturingsset doel inleidingen/sonde (450 nmol/L primers, 250 nmol/L HEX sonde)	1 ΜL
Nuclease-gratis water	1 ΜL
cDNA	7 ΜL

Tabel 2: Voorbereiding van de master mix voor dPCR.

Fietsen van de stap	Temperatuur	Tijd	# Cycli	Oprit tarief
Enzymactivering	95 ° C	10 min	1	~ 2 oC/s
Denaturatie	94 ° C	30 s	40
Gloeien/extensie	55 ° C	1 min
Enzym deactiveren	98 ° C	10 min	1
Greep (optioneel)	4 ° C	oneindige	1	~ 1 oC/s

Tabel 3: Thermische fietsen omstandigheden.

Discussie

RET en ROS1 herschikkingen maken samen ~ 3% van de mutaties van de bestuurder binnen de NKCLK bevolking¹⁸. Hoewel zeldzaam, zijn de detectie van deze genetische veranderingen onontbeerlijk. NKCLK patiënten met deze veranderingen kunnen profiteren van gerichte therapieën die specifiek remmen de afwijkende kinaseactiviteit die voortvloeit uit de onco-eiwit-¹³. Sommige dergelijke therapieën zijn al goedgekeurd door de FDA voor gebruik in ROS1 positieve NKCLK, terwijl anderen hebben aangetoond doeltreffend tegen RET in klinische proeven¹⁹.

Digitale technologie van de PCR biedt gevoeligheid die ideaal is voor vloeibare biopsie toepassingen²⁰. Er was aanzienlijke goedkeuring van deze technologie voor gebruik met de circulerende DNA cel-gratis voor de meting van tumor mutaties bij patiënten met NKCLK^4,6,21,22,23 . Naast cfDNA ontwikkelden we een protocol ontworpen voor robuuste meting van de meest voorkomende varianten van de fusie bij patiënten met NKCLK tumor RNA (Figuur 1A)¹⁰blijven circuleren.

Onze gangbaar protocol voorziet in analytische grenzen van detectie tot 0,2% (Figuur 2). Terwijl de RT-dPCR buitengewoon specifieke en gevoelige is, zijn de tests beperkt tot het panel van bekende fusion varianten die zijn gekozen en multiplexed voor de detectie in de PCR-test. Dus, fusies moeten worden opgenomen in een multiplexed testen moeten zorgvuldig worden geselecteerd om te zorgen voor goede dekking binnen de populatie van patiënten met NKCLK. Wij hebben met succes testen voor RET en ROS1 dat gelijktijdig acht fusion varianten resulterende uit herschikkingen van de RET of ROS1 loci detecteren en dekking van 99% en 88% van de RET en ROS1 positieve bevolking, respectievelijk ontworpen (Figuur 1-B-C )¹⁷.

De workflow van de laatste test zoals beschreven in deze studie omvat batch besturingselementen om te zorgen voor samenhang van resultaten. Deze besturingselementen omvatten zowel een positieve analytische standaard, alsmede twee negatieve controles, die samen zorgen er is geen besmetting of PCR remming die zich voordoen binnen de partij (Figuur 3). Om ervoor te zorgen de robuustheid van de test, werd een studie uitgevoerd met behulp van de batch controle op een periode van 21 dagen (Figuur 3D, H). Deze gegevens tonen aan dat de consistentie van het RNA-proces zoals vastgesteld in dit protocol.

Goede laboratoriumpraktijken en passende RNA behandeling zijn belangrijke componenten van het waarborgen van de robuuste en nauwkeurige resultaten. Laboratorium ruimte en apparatuur gewijd te gebruiken met RNA, reiniging van apparatuur na elk gebruik, met behulp van RNase-vrije reagentia en verbruiksartikelen en een RNase inactivatie spray op de werkplek die alle bijdragen aan het verminderen van contaminerende RNases toe te passen. Zorgvuldige behandeling van RNA monsters door technici, met inbegrip van een speciale laboratoriumjas, frequente veranderingen van de handschoen, snel werkend via de RNA extractie procedure, en houden monsters op ijs zijn van het grootste belang aan het behoud van de integriteit van de steekproef. Zodra RNA is omgekeerde herschreven als cDNA, is het monster in een meer stabiele vorm die minder gevoelig is voor aantasting. Naast praktijken die ondersteuning bieden voor RNA integriteit, moeten PCR onderdelen en monsters worden gehandhaafd in gescheiden gebieden ter voorkoming van kruisbesmetting, die tot valse positieve resultaten leiden kan. De voorraad PCR Reagentia en voorbereiding van PCR master mixen moeten gescheiden worden gehouden van PCR sjablonen en grote zorg moet worden genomen om te scheiden van de versterkte sjabloon (post-PCR) van alle vooraf versterkte materialen en reagentia, RNA, cDNA monsters. Ten slotte, juiste generatie en de behandeling van geëmulgeerd PCR mixen vóór versterking is centraal aan het behoud van de integriteit van de druppel en optimale dPCR voorwaarden. Voorzorgsmaatregelen als deze zijn kritisch tijdens de uitvoering van dit protocol om consistente en accurate resultaten te verkrijgen. Alle gegevens moeten worden onderzocht door geschoold personeel vóór het uitbrengen van de resultaten om zeker te zijn dat alle QC statistieken is voldaan. In het geval van suboptimaal resultaten (Figuur 4), de partij moet worden herzien door technisch personeel en de directeur van het laboratorium en moet u mogelijk opnieuw verwerken.

RT-dPCR resultaten kunnen worden geproduceerd zo spoedig 24 uur na ontvangst van de steekproef en 95% van voorbeeldresultaten binnen de test instellen in deze studie gebruikt (n = 984) werden gemeld bij de bestellen arts in minder dan 72 uur vanaf het moment van ontvangst (Figuur 5). Deze turn-around tijd biedt artsen met veel moleculaire informatie in een tijdsbestek waarmee initiatie van de juiste therapie nodig. Deze resultaten zijn eerder dan die verkregen met behulp van een conventionele weefsel biopsie normaal gesproken beschikbaar zijn. Extra biomarkers voor NKCLK en andere vormen van kanker zou kunnen worden ontwikkeld met behulp van soortgelijke circulerende RNA gebaseerde benaderingen en zou profiteren van dezelfde snelle tijd-aan-resultaten. Meting van het afschrift van de geprogrammeerde dood Ligand 1 (PD-L1) mRNA met behulp van RT-dPCR zou bijvoorbeeld artsen informeren over immunotherapie opties. Er is ook een groeiende interesse in het nut van vloeibare biopsie en dPCR bij het toezicht op voor de therapeutische werking. Eerdere vermeldingen voor de heropleving van de tumor met behulp van genomic testen voor specifieke varianten kunnen artsen aan te passen behandeling regimes voordat patiënten symptomatisch standaard van zorg maatregelen zijn zoals imaging²⁴. Protocollen zoals gemeld in deze studie zijn ideaal voor het toezicht als gevolg van hun niet-invasiviteit, de gevoeligheid, de snelle turn-around tijd, en de kosteneffectiviteit. De bepaling hierin beschreven geeft resultaten binnen 72 uur na monster ontvangst, met minimale vals-positieve opsporingstarieven, ter vergemakkelijking van de snelle behandeling besluiten en enkele beperkingen ervaren met weefsel gebaseerde testen⁴omzeilt.

Onze protocol en gegevens tonen een robuuste testsysteem voor het identificeren van lage overvloed RNA varianten, evenals het potentieel voor bloed gebaseerde mutatie testen in de klinische praktijk. Voor die patiënten die niet over een beroep stuurprogramma beschikken benaderingen mutatie geïdentificeerd door snelle gerichte vloeibare biopsie zoals deze, de toevoeging van meer uitgebreide genoom en Proteoom testen van zowel weefsel en bloed kan nog bredere klinische informatie verschaffen ter ondersteuning van de planning van de behandeling.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Ultrapure Gedestilleerd Water (DNAse, RNAse Vrij) (500 mL)	Life Technologies	10977-015	1604071
Ultrapure Gedestilleerd Water (DNAse, RNAse Vrij) (500 mL)	Life Technologies	10977-015	1809353
Nuclease-vrij water (moleculair graad)	Ambion	AM9938	1604071
Nuclease-vrij water (moleculair graad)	Ambion	AM9938	1606077
Fosfaatbufferoplossing 1X, steriel	Amresco	K812-500mL	1446C189
Fosfaatbufferoplossing 1X, steriel – 500 mL	Invitrogen	10010023	1916C092
RNase Zap (Life Tech) (250 mL)	Ambion	AM9780	353952
Beta-Mercaptoethanol (BME)  (250 mL)	CalbioChem	6050	W105B
OmniPur Ethyl Alcohol	CalbioChem	4455-4L	56054611
OmniPur Ethyl Alcohol	CalbioChem	4455-4L	56238638
Isopropyl Alcohol	VWR	0918-4L	2116C416
TranscriptAid T7 High Yield Transcription Kit	Thermo Scientific	K0441	403648
TranscriptAid T7 High Yield Transcription Kit	Thermo Scientific	K0441	288461
DNase I	Thermo	K0441	371299
QIAzol Lysis Reagens	Qiagen	79306	54809699
20x TE buffer pH 8.0	Alfa Aesar	J62388	R13C548
UltraPure Agarose	Invitrogen	16500-100	552730
10x TBE buffer	Invitrogen	AM9863	353065
Cell-Free RNA BCT	Streck	218976	60110327
Cell-Free RNA BCT	Streck	218976	61900327
Cell-Free RNA BCT	Streck	218976	61480327
Cell-Free RNA BCT	Streck	218976	62320327
Plasma/Serum Circulating en Exosomal RNA Purification Kit (Slurry Format) 50 preps	Norgen	42800	585849
Plasma/Serum Circulating en Exosomal RNA Purification Kit (Slurry Format) 50 preps	Norgen	42800	588308
Lysis Buffer	Norgen	21205	A5F61E
RNA Cleanup and Concentration Micro-Elute Kit (Norgen) 50 preps	Norgen	61000	585848
RNA Cleanup and Concentration Micro-Elute Kit (Norgen) 50 preps	Norgen	61000	588309
DNA Clean and ConcentratorTM- 5  200 preps (samples)	Zymo	D4014	ZRC186976
DNA Clean and ConcentratorTM- 5  200 preps (samples)	Zymo	D4014	ZRC188077
DNA Clean and ConcentratorTM- 5  200 preps (samples)	Zymo	D4014	ZRC188413
Collectiebuizen 500 verpakking	Zymo	C1001-500	N/A
SuperScript IV First Strand Synthesis System 200 rxn (samples)	Life Technologies	18091200	391657
SuperScript IV First Strand Synthesis System 200 rxn (samples)	Life Technologies	18091200	392504
SuperScript IV First Strand Synthesis System 200 rxn (samples)	Life Technologies	18091200	448001
SuperScript IV Reverse Transcriptase	Life Technologies	18090200	451702
Qubit HS RNA Assay Kit (500)	Life Technologies	Q32854	1745264
Qubit assaybuizen (500)	Life Technologies	Q32856	13416Q311
ddPCR Supermix voor Probes (geen dUTP)	Bio-Rad	1863023	64031651
ddPCR Supermix voor Probes (geen dUTP)	Bio-Rad	1863023	64063941
ddPCR Supermix voor Probes (geen dUTP)	Bio-Rad	1863023	64065740
ddPCR Supermix voor Probes (geen dUTP)	Bio-Rad	1863023	64065741
ddPCR Supermix voor Probes (geen dUTP)	Bio-Rad	1863023	64079083
ddPCR Buffer Control voor Probes	Bio-Rad	1863052	64025320
ddPCR Buffer Control voor Probes	Bio-Rad	1863052	64052358
gBlock KIF5B-RET K15:R12	IDT	151004172	4-Oct-16
gBlock KIF5B-RET K16:R12	IDT	151004173	4-Oct-16
gBlock KIF5B-RET K22:R12	IDT	151004174	4-Oct-16
gBlock KIF5B-RET K23:R12	IDT	151004175	4-Oct-16
gBlock KIF5B-RET K24:R11	IDT	151004176	4-Oct-16
gBlock KIF5B-RET K24:R8	IDT	151004177	4-Oct-16
gBlock CCDC6-RET C1:R12	IDT	151004178	4-Oct-16
gBlock TRIM33-RET T14:R12	IDT	15100