Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Micro-dissectie van glazuur orgel van snijtand van ratten blootgesteld aan toxische stoffen in het milieu

10.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/57081

⸱

29 maart 2018

 ,  ,  ,  , 
1Institut National de la Santé et Recherche Médicale (INSERM) UMRS 1138, Paris-Diderot University, Pierre & Marie Curie University, Paris-Descartes University, Laboratory of Molecular Oral Pathophysiology, Cordeliers Research Centre, 2Unit of Formation and Research (UFR) of Odontology, Paris-Diderot University

In dit artikel

Samenvatting

Begrip glazuur vorming en mogelijk wijzigingen vereist de studie van ameloblast activiteit. Hier beschrijven we een betrouwbare en consistente methode voor micro-ontleden glazuur organen met secretie - en rijping-fase-ameloblasts die kunnen worden gebruikt voor verdere kwantitatieve en kwalitatieve experimentele procedures.

Samenvatting

Emaille gebreken als gevolg van omgevingscondities en manieren van leven zijn de volksgezondheid zorgen vanwege hun hoge prevalentie. Deze gebreken het gevolg zijn van de gewijzigde activiteit van cellen verantwoordelijk voor emaille synthese met de naam ameloblasts, die in emaille orgel. Ameloblasts Volg tijdens amelogenesis, een specifieke en nauwkeurige opeenvolging van gebeurtenissen van proliferatie, differentiatie en dood. Een voortdurend groeiende snijtanden rat is een geschikt experimenteel model om te studeren ameloblast activiteit en differentiatie stadia in fysiologische en pathologische omstandigheden. Hier beschrijven we een betrouwbare en consistente methode voor micro-ontleden glazuur orgel van ratten blootgesteld aan toxische stoffen in het milieu. De micro-ontleed tandheelkundige epithelen bevatten secretie - en rijping-fase-ameloblasts die kunnen worden gebruikt voor de kwalitatieve experimenten, zoals het testen van immunohistochemistry en in situ hybridisatie, evenals voor kwantitatieve analyses zoals RT-qPCR, RNA-seq en westelijke bevlekken.

Inleiding

Vele developmental glazuur gebreken kunnen voortvloeien uit blootstelling aan toxische stoffen in het milieu en/of ongepaste levensstijl1,,2,,3,4. Karakterisatie van het verstoren van de gebeurtenissen en moleculen van amelogenesis met behulp van de momenteel beschreven procedure zal het promoten van het gebruik van resulterende glazuur gebreken als vroege markers van blootstelling aan toxische stoffen in verschillende, en kan helpen om te reconstrueren van de geschiedenis van de gezondheid van elke patiënt tijdens de perinatale periode wanneer email synthetized1,2 is. Emaille synthese kan worden onderverdeeld in vier belangrijkste fasen afhankelijk van ameloblast activiteit5. De eerste stap hergroepeert voorloper cel en pre-ameloblast proliferatie. Tijdens de tweede stap afscheiden gedifferentieerde ameloblasts glazuur matrix eiwitten (EMPs), voornamelijk amelogenin, enamelin en ameloblastin, die de dikte van het definitieve glazuur bepalen. Dus, verstoring van het EMP synthese leidt tot kwantitatieve gebreken van glazuur. Na de afzetting van de dikte van de volledige glazuur begint de rijping fase. Tijdens dit stadium kunt apatiet crystallite groei in de breedte en dikte van het glazuur te bereiken van de hoogste mineralisatie verhouding gevonden in een biologisch weefsel, met korting tot 96% van het gewicht. Ontwrichtende gebeurtenissen die zich tijdens de rijping fase tot kwalitatieve voordoen geëmailleerde gebreken. Tot slot ameloblasts Voer een fase van na rijping, een afkorting voor pigmentatie bij knaagdieren en apoptosis ondergaan tijdens tand uitbarsting glazuur gebreken te maken (indien aanwezig) onherstelbare en onherstelbare, dus gebreken bieden potentiële retrospectieve opname van Ameloblast benadrukt. Bij knaagdieren volgt amelogenesis een gelijkaardige opeenvolging van gebeurtenissen met de bijzonderheid dat hun snijtanden voortdurend groeien, waardoor ze een geschikt model voor het bestuderen van het algemene proces van amelogenesis. Dus, verstoring van het amelogenesis resulteert in veranderingen van glazuur kwaliteit en/of hoeveelheid, afhankelijk van de tijd-venster van het storende evenement. In die zin, blootstelling aan dioxine, lood en hormoonontregelende chemische stoffen (EDCs) zoals Bisfenol A (BPA), genistein en vinclozolin, is gebleken dat voor het genereren van emaille hypomineralizations1,2,3 ,6,7,8. Asymmetrische witte dekkende vlekken werden geïdentificeerd op de snijtanden van ratten blootgesteld aan een lage dosis BPA dosis tijdens de foetale periode en de eerste maand na de geboorte1. Deze glazuur gebreken bij ratten, en die van menselijke molaire snijtand hypomineralization (MIH), delen vergelijkbare klinische, structurele en biochemische kenmerken. MIH is een recent beschreven tandheelkundige glazuur pathologie, voor die de etiologie is nog steeds onduidelijk9,,10 , ondanks vele oorzakelijke factoren heb hypothetische9,10,11 ,12.

Een ander belangrijk emaille hypomineralization pathologie te wijten aan milieufactoren is tandheelkundige fluorose (DF), die het gevolg van overmatige fluoride absorptie is (> 0,1 mg/kg/dag)13,14. De hoofdbron van fluoride is drinkwater, dat is aangevuld of natuurlijk verrijkt met fluoride. Fluoride wordt ook vaak voorgeschreven ter voorkoming van cariës, maar de profylactische dosis is slechts 50% lager dan de toxische één (≤0.05 mg/kg/dag). MIH en DF, twee frequente aandoeningen als gevolg van blootstelling aan milieufactoren, kan gemeenschappelijke kenmerken die moeten worden gekenmerkt door de potentiëring van hypomineralizing effecten van fluoride in combinatie met andere toxische stoffen zoals EDCs2 presenteren of amoxicilline15.

Micro-dissectie van rat glazuur orgel met ameloblasts in verschillende differentiatie stadia zal helpen om te begrijpen van het werkingsmechanisme van moleculen kunnen verstoren ameloblast activiteit en veroorzaken glazuur gebreken na uitbarsting van de tand worden gediagnosticeerd. Met andere woorden, de karakterisatie van veranderingen in de glazuur gen expressie en glazuur matrix samenstelling als gevolg van toxische stoffen in het milieu stelt de reconstructie van de geschiedenis van blootstelling aan toxische stoffen, en vergemakkelijkt voor publiek toezicht op milieuveiligheid gezondheid.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dieren die worden gebruikt in de huidige studie werden onderhouden overeenkomstig de richtsnoeren voor de verzorging en het gebruik van proefdieren van het Franse Ministerie van landbouw (A-75-06-12).

1. dierlijke blootstelling aan toxische stoffen

  1. Voordat u dit protocol uitvoert, noodzakelijke institutionele goedkeuring verkrijgen en zorg ervoor dat alle dierenverzorgers richtsnoeren voldoen.
  2. Het ontwerp van het onderzoeksprotocol waardoor de Grondwet van verschillende experimentele groepen om te testen van het effect van de molecule(s) onderzocht op ameloblast secretie en de fase van de rijping ameloblast toepassen. Hier, waren vier groepen van mannelijke Wistar ratten opgericht, afhankelijk van hun blootstelling aan fluoride (NaF) in combinatie of niet met BPA (figuur 1A)2. Alle dieren waren waargenomen en ontleed op dag 65 (figuur 1B).

2. dissectie van Hemi-kaken van volwassen ratten

  1. Euthanaseren ratten door CO2 verstikking, eventueel gevolgd door onthoofding aan het aparte hoofd van de rest van het lichaam. Ratten op CO2 voor 5 min in een speciaal vak16bloot.
  2. Verwijder alle de huid van de onderste lippen met behulp van een scalpel #11 om gemakkelijke toegang tot de onderste snijtanden.
  3. Met de dezelfde scalpel, maken van een sneetje tussen de twee onderste snijtanden met een lichte druk en de onderkaak zal worden gesplitst in twee helften.
  4. Knip het temporele mandibulaire gewricht met een scalpel wilt loskoppelen van de kaak, en houden de hemi-onderkaak met een fijne pincet.
  5. Snij de omliggende weke met een scalpel en verwijder alle spieren, pezen en ligamenten met behulp van een schraper totdat het bot helemaal schoon is.

3. isolatie van de snijtand17,18

  1. Zorgvuldig afscheren het bot door het plaatsen van het mes parallel aan de grote lengteas van de snijtand. Begin bij de benige bergkam in de buurt van de toppen van de snijtand (proximale eind) tot het einde van de schapen in de buurt van de cervicale lus. De insnijding motie opbrengst van de proximale, distale richting.
  2. Maken een eerste snede distally de cervicale lus met de scalpel te verwijderen van de gonion van de hemi-onderkaak en geeft toestemming opstijgen de snijtand gemakkelijk zonder beschadiging van de cervicale lus of de secretoire fase van ameloblasts (rode lijn in de Figuur 2).
  3. Breng een tweede snede onder de tweede molaire en voeg de scalpel tussen het bot en het mediale oppervlak van de snijtand. Wanneer alle de basale bone wordt opgeheven, naar buiten draaien van de schapen en het opstijgen zorgvuldig om te voorkomen dat glazuur orgel weefsel aangetast met fijne pincet.

4. micro-dissectie van glazuur orgel onder verrekijker Lens

  1. 200 µL van zoute fosfaatbuffer (PBS 1 X) op de snijtand met behulp van een precisiepipet neerzetten. Neem de snijtand met een fijne pincet met het labial oppervlak naar boven. Maak een scalpel markeren tussen de kleurloze en oranje delen van het weefsel. Dit merk komt overeen met de onderliggende witte vlek die waarneembare daarna (Figuur 2).
  2. Schraap, met een graafmachine of een gelijkwaardig instrument, het celoppervlak van de scalpel mark aan de apicale einde corresponderende secretie fase (kleurloos) ameloblasts, en naar de scalpel mark naar het uiteinde van de snijtand voor de ameloblasts maturatie fase (oranje).
  3. Verwijder het weefsel van de 2-mm overeenkomt met de overgangsfase, als eerder beschreven19. Open de snijtand geen tijdens glazuur orgel dissectie om verontreiniging te voorkomen door het mesenchym.
  4. Snijd de cervicale lus gelegen direct aan het apicaal deel van de snijtand beschreven (Figuur 2) zoals eerder20.
  5. Verzamel het in 10% formaline of lysis oplossing voor verder onderzoek (Zie Tabel van materialen).

5. verzameling van gescheiden glazuur orgel weefsels voor verdere onderzoeken

  1. 200 µL PBS 1 X buffer op de snijtand neerzet.
  2. Met een scalpel #11 mes, zorgvuldig loskoppelen de tandheelkundige epitheliale cellen geleidelijk in de buffer, afzonderlijk voor elk stadium met de hulp van het merk van de scalpel eerder gemaakt.
  3. Voor cel RNA en eiwit extracties, plaatsen het weefsel in een lysis-oplossing waarmee de winning van zowel eiwitten als RNAs (Zie Tabel van materialen)
    Opmerking: Bereiden hoogwaardige RNAs door te draaien de weefsel-graafmachine in de buis, en vervolgens het slijpen van de cellen tot een homogeen mengsel te verkrijgen. Het mengsel is klaar voor RNA en eiwit extracties uit te voeren volgens de fabrikant de procedure die eerder beschreven2,8,17was. Meestal, ongeveer 5-10 µg totaal RNAs en 150 µg totale eiwitten werden verkregen voor elk preparaat.
  4. Voor histologisch analyses zet immunohistochemistry (IHC), en in situ hybridisatie (ISH), de cellaag in 10% formaline voor 2 h, dan bewaren bij 4 ° C in PBS 1 X. Het weefsel kan vervolgens OCT voor bevroren secties worden ingebed in de wax/paraffine of weefsel.
  5. Neem de snijtand met fijne pincet voor EMP extracties. Na een korte blootstelling aan lucht (lichte uitdroging) zullen een witte vlek zichtbaar rond het middelste deel van het labial oppervlak van de schapen, die de inleiding van het glazuur mineralisatie vertegenwoordigt. Deze witte vlek overeenkomt met de overgang- / vroege rijping-fase van de ameloblasts, dus gebruik het als een indicator voor extractie van EMPs21.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Veel geëmailleerde gebreken, zoals tandheelkundige fluorose12,13, kan het gevolg zijn van milieu-omstandigheden als gevolg van buitensporige fluoride absorptie of hypomineralization vergelijkbaar MIH als gevolg van blootstelling aan sommige EDCs1, geëmailleerde 7,22. Deze ontwikkelingsstoornissen glazuur gebreken mag experimenteel worden ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Gewijzigde ameloblast activiteit en/of verstoord ameloblast proliferatie, differentiatie en rijping processen leiden tot onomkeerbare glazuur gebreken en beurtelings, de karakterisering van de defecten van het glazuur kan helpen ontwikkelen van begrip van de gewijzigde Ameloblast activiteit tijdens amelogenesis. Zo zijn de studies over geïsoleerde glazuur orgel determinant ophelderen van de pathologische gebeurtenissen die leiden tot de geëmailleerde gebreken, ongeacht hun oorsprong, milieu- of genetische.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen conflicten van belang om te vermelden.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gefinancierd door de Universiteit Parijs-Diderot, het Frans National Institute of Health en medische onderzoek (INSERM) en het Franse Instituut voor Odontological onderzoek (IFRO).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Bisfenol ASigma Aldrich, Saint Louis MO239658
formaldehyde 10%Sigma-Aldrich, Saint Louis, MOHT5012
Tri-ReagentEuromedex, FrankrijkTR118
RLT bufferQiagen, Les Ulis, Frankrijk74126RNeasy Protect Mini Kit
Androgen receptor antibodySanta Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)sc-816rabbit polyclonal antibody
PBS 10xEUOMEDEXET330.A
Natriumfluoride (NaF)Sigma-Aldrich, Saint Louis, MOS-1504
paraplast regularLeica microsystems, Nanterre cedex, Frankrijk39601006werd aangeduid als/parafin in de tekst
OCT-weefselVWR, Fontenay-sous-Bois, Frankrijk411243
Extra Fine Bonn-schaar - recht/8,5 cmPHYMEP, Parijs, Frankrijk14084-08
Handvat voor scalpelbladen - 12,5 cmPHYMEP, Parijs, Frankrijk10035-12
Gebogen scalpelbladPHYMEP, Parijs, Frankrijk10035-20
Dissectiemes - fijn/rechte puntPHYMEP, Parijs, Frankrijk10055-12
Circulaire mesPHYMEP, Parijs, Frankrijk10059-15
scalpel bladen n°11 Swann-MortonVWR, Fontenay-sous-Bois, Frankrijk233-0024
binoculaire lensLeica biosystems, Nanterre cedex, FrankrijkMZFLIII

Referenties

  1. Jedeon, K., et al. Enamel defects reflect perinatal exposure to bisphenol A. Am J Pathol. 183, 108-118 (2013).
  2. Jedeon, K., et al. Chronic Exposure to Bisphenol a Exacerbates Dental Fluorosis in Growing Rats. J Bone Miner Res. 31, 1955-1966 (2016).
  3. Alaluusua, S., et al. Developmental dental aberrations after the dioxin accident in Seveso. Environ Health Perspect. 112, 1313-1318 (2004).
  4. Chapple, I. L., et al. Interaction of lifestyle, behaviour or systemic diseases with dental caries and periodontal diseases: consensus report of group 2 of the joint EFP/ORCA workshop on the boundaries between caries and periodontal diseases. J Clin Periodontol. 44, S39-S51 (2017).
  5. Nanci, A. Enamel: Composition, Formation, and Structure. Ten Cate's Oral Histology Development, Structure, and Function. , 8th ed, Elsevier mosby. 122-164 (2012).
  6. Leite, G. A., Sawan, R. M., Teofilo, J. M., Porto, I. M., Sousa, F. B., Gerlach, R. F. Exposure to lead exacerbates dental fluorosis. Arch Oral Biol. 56, 695-702 (2011).
  7. Jedeon, K., et al. Enamel hypomineralization due to endocrine disruptors. Connect Tiss Res. 55, 1-5 (2014).
  8. Jedeon, K., et al. Androgen receptor involvement in rat amelogenesis: an additional way for endocrine disrupting chemicals to affect enamel synthesis. Endocrinology. 157, 4287-4296 (2016).
  9. Weerheijm, K. L., Jalevik, B., Alaluusua, S. Molar-incisor hypomineralisation. Caries Res. 35, 390-391 (2001).
  10. Jälevik, B. Prevalence and Diagnosis of Molar-Incisor- Hypomineralisation (MIH): A systematic review. Eur Arch Paediatr Dent. 11, 59-64 (2010).
  11. Alaluusua, S. Aetiology of Molar-Incisor Hypomineralisation: A systematic review. Eur Arch Paediatr Dent. 11, 53-58 (2010).
  12. Jedeon, K., Berdal, A., Babajko, S. The tooth, target organ of Bisphenol A, could be used as a biomarker of exposure to this agent. Bisphenol A: Sources, Risks of Environmental Exposure and Human Health Effects. Gibert, Y. , Nova Science Publishers. 205-225 (2015).
  13. Fejerskov, O., Larsen, M. J., Richards, A., Baelum, V. Dental tissue effects of fluoride. Adv Dent Res. 8, 15-31 (1994).
  14. Robinson, C., Connell, S., Kirkham, J., Brookes, S. J., Shore, R. C., Smith, A. M. The effect of fluoride on the developing tooth. Caries Res. 38, 268-276 (2004).
  15. Sahlberg, C., Pavlic, A., Ess, A., Lukinmaa, P. L., Salmela, E., Alaluusua, S. Combined effect of amoxicillin and sodium fluoride on the structure of developing mouse enamel in vitro. Arch Oral Biol. 58, 1155-1164 (2013).
  16. Pritchett-Corning, K. R. Euthanasia of neonatal rats with carbon dioxide. J Am Assoc Lab Anim Sci. 48, 23-27 (2009).
  17. Hiller, C. R., Robinson, C., Weatherell, J. A. Variations in the composition of developing rat incisor enamel. Calcif Tissue Res. 18, 1-12 (1975).
  18. Robinson, C., Kirkham, J., Nutman, C. A. Relationship between enamel formation and eruption rate in rat mandibular incisors. Cell Tissue Res. 254, 655-658 (1988).
  19. Smith, C. E., Nanci, A. A method for sampling the stages of amelogenesis on mandibular rat incisors using the molars as a reference for dissection. Anat Rec. 225, 257-266 (1989).
  20. Chavez, M. G., et al. Isolation and culture of dental epithelial stem cells from the adult mouse incisor. J Vis Exp. (87), (2014).
  21. Brookes, S. J., Kingswell, N. J., Barron, M. J., Dixon, M. J., Kirkham, J. Is the 32-kDa fragment the functional enamelin unit in all species? Eur J Oral Sci. 119, 345-350 (2011).
  22. Babajko, S., Jedeon, K., Houari, S., Loiodice, S., Berdal, A. Disruption of Steroid Axis, a New Paradigm for Molar Incisor Hypomineralization (MIH). Front Physiol. 8, 343(2017).
  23. Houari, S., et al. Asporin and the mineralization process in fluoride-treated rats. J Bone Min Res. 29, 1446-1455 (2014).
  24. Denbesten, P., Li, W. Chronic fluoride toxicity: dental fluorosis. Monographs in oral science. 22, 81-96 (2011).
  25. Kirkham, J., Robinson, C., Phull, J. K., Shore, R. C., Moxham, B. J., Berkovitz, B. K. The effect of rate of eruption on periodontal ligament glycosylaminoglycan content and enamel formation in the rat incisor. Cell Tissue Res. 274, 413-419 (1993).
  26. Lacruz, R. S., et al. Identification of novel candidate genes involved in mineralization of dental enamel by genome-wide transcript profiling. J Cell Physiol. 227, 2264-2275 (2012).
  27. Wen, X., Paine, M. L. Iron deposition and ferritin heavy chain (Fth) localization in rodent teeth. BMC research notes. 6, 1(2013).
  28. Houari, S., Loiodice, S., Jedeon, K., Berdal, A., Babajko, S. Expression of Steroid Receptors in Ameloblasts during Amelogenesis in Rat Incisors. Front Physiol. 7, 503(2016).
  29. Kawano, S., et al. Establishment of dental epithelial cell line (HAT-7) and the cell differentiation dependent on Notch signaling pathway. Connect Tissue Res. 43, 409-412 (2002).
  30. Zhou, Y. L., Snead, M. L. Identification of CCAAT/enhancer-binding protein alpha as a transactivator of the mouse amelogenin gene. J Biol Chem. 275, 12273-12280 (2000).
  31. Nakata, A., et al. Establishment and characterization of a spontaneously immortalized mouse ameloblast-lineage cell line. Biochem Biophys Res Commun. 308, 834-839 (2003).
  32. Harada, H., et al. Establishment of ameloblastoma cell line, AM-1. Journal of oral pathology & medicine: official publication of the International Association of Oral Pathologists and the American Academy of Oral Pathology. 27, 207-212 (1998).
  33. Jussila, M., Thesleff, I. Signaling networks regulating tooth organogenesis and regeneration, and the specification of dental mesenchymal and epithelial cell lineages. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, a008425(2012).
  34. Tucker, A., Sharpe, P. The cutting-edge of mammalian development; how the embryo makes teeth. Nat Rev Genet. 5, 499-508 (2004).
  35. Vos, T., et al. Years lived with disability (YLDs) for 1160 sequelae of 289 diseases and injuries 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380, 2163-2196 (2012).
  36. Marcenes, W., et al. Global burden of oral conditions in 1990-2010: a systematic analysis. J Dent Res. 92, 592-597 (2013).
  37. National Institute of Dental and Craniofacial Research. Dental Caries (Tooth Decay) in Adults (Age 20 to 64). , Available from: https://www.nidcr.nih.gov/DataStatistics/FindDataByTopic/DentalCaries/DentalCariesAdults20to64.htm (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Microdissectie van het glazuiorgaanisolatie van ratreitandenscheiding van ameloblaststadiasecretiestadium ameloblastenmaturatiestadium ameloblastenimmunohistochemische assaysRNA-extractieprotocolWestern blot-analyseblootstelling aan fluoride-BPAtrichroom-Masson-kleuring
Micro-dissectie van glazuur orgel van snijtand van ratten blootgesteld aan toxische stoffen in het milieu
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.