Methode voor het efficiënt uiteinde en zuivering van de Chemoreceptor-Ligand bindend domein

Summary

Een procedure wordt gepresenteerd voor het uiteinde van de dCACHE periplasmische ligand bindend domein van Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3 van integratie-organen en de zuivering aan opbrengst milligram hoeveelheden eiwit.

Abstract

Identificatie van de natuurlijke liganden van chemoreceptors en structurele studies gericht op opheldering van de moleculaire basis van de specificiteit van het ligand kan sterk worden vereenvoudigd door de productie van milligram bedragen van pure, gevouwen ligand bindende domeinen. Misbruik van geïnfecteerd express periplasmische ligand bindende domeinen van bacteriële chemoreceptors in Escherichia coli (E. coli) vaak resulteren in hun gericht op integratie-organen. Hier wordt een methode gepresenteerd voor de terugwinning van het eiwit van opneming organen, haar uiteinde en zuivering, met behulp van de periplasmatische dCACHE ligand bindend domein van Campylobacter jejuni (C. jejuni) chemoreceptor Tlp3 als voorbeeld. De aanpak omvat uitdrukking van de proteïne van belang met een cleavable zijn₆-tag, isolatie en ureum-gemedieerde oplossen van integratie-organen, eiwit uiteinde door ureum uitputting en zuivering door middel van de chromatografie van de affiniteit, gevolgd door tag verwijderen en grootte-uitsluiting chromatografie. De circulair dichroïsme spectroscopie wordt gebruikt voor het bevestigen van de gevouwen staat voor het pure eiwit. Het is aangetoond dat dit protocol in het algemeen nuttig voor productie van milligram bedragen van dCACHE periplasmische ligand bindende domeinen van andere bacteriële chemoreceptors in de vorm van een oplosbare en crystallisable is.

Introduction

Chemotaxis en motiliteit is aangetoond dat een belangrijke rol spelen in de pathogenese van Campylobacter jejuni door bacteriële kolonisatie en invasie van de host^1,2,3te bevorderen. Chemotaxis kan bacteriën toewerken naar een optimale omgeving voor de groei, als geleid door chemische signalen. Dit proces omvat erkenning van intracellulaire en milieu chemische signalen door een aantal eiwitten genoemd chemoreceptors of transducer-achtige eiwitten (Tlps). De meeste chemoreceptors zijn membraan-embedded eiwitten met een extracytoplasmic ligand bindend domein (LBD), een....

Protocol

1. weergave van zijn₆-Tlp3-LBD bij E. coli

1. Inoculeer 150 mL steriele Luria Bertani (LB) bouillon met 50 µg mL^-1 ampicilline met BL21-Codon-Plus (DE3) - RIPL cellen getransformeerd met de pET151/D-TOPO vector voor de uitdrukking van zijn₆- Tlp3-LBD (aminozuurresidu's 42-291), en het bij 37 ° C in een shaker (orbit diameter, 25 mm) met 200 t/min na een nacht bebroeden.
2. Bereiden van zes 2 L conische kolven met 800 mL steriele de pond-Bouillon en 50 µg mL^-1 ampicilline. Inoculeer elke kolf met 20 mL van de overnachting cultuur stap 1.1 verkregen. Incubeer hen bij 37 ° C met continue schudden bij 200 ....

Results

Recombinante uitdrukking van zijn₆-Tlp3-LBD bij E. coli resulteerde in eiwit depositie in integratie-organen. De opbrengst van de expressie van 1 L van bacteriecultuur berekend in stap 2.13 was ongeveer 100 mg zijn₆-Tlp3-LBD gestort in integratie-organen. De eiwit isolatie procedure, die hier worden beschreven en geïllustreerd in Figuur 1, bestaat uit het oplossen van opneming en eiwit uiteinde en zuivering, door middel van de c.......

Discussion

Een eenvoudige procedure voor expressie en het uiteinde van de organen van de opneming van de periplasmatische LBD van de bacteriële chemoreceptor Tlp3 wordt gepresenteerd. Voorbereiding van het pure eiwit gaat om overmatige expressie van het huisdier-plasmide-gecodeerde gen in E. coli, zuivering en oplossen van integratie-organen, uiteinde van de gedenatureerde proteïne en haar zuivering door de opeenvolgende affiniteit en grootte-uitsluiting chromatografie stappen. De ureum-vergemakkelijkt denaturatie- en verd.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris base	AMRESCO	497
Sodium chloride (NaCl)	MERK MILLIPORE	1064041000
Ampicillin	G-BIOSCIENCES	A051-B
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)	MERCK	52332
Triton x-100	AMRESCO	694
Isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG)	ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD	AST0487
Urea	AMRESCO	VWRC0568
Dithiothreitol	ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD	C-1029
L-arginine monohydrochloride	SIGMA-ALDRICH	A5131
Reduced L-glutathione	SIGMA-ALDRICH	G4251
Oxidized L-glutathione	SIGMA-ALDRICH	G4376
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)	SIGMA-ALDRICH	7558-79-4
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)	SIGMA-ALDRICH	10049-21-5
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dehydrate (EDTA)	AMRESCO	VWRC20302.260
Imidazole	SIGMA-ALDRICH	I2399
Glycerol	ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD	BIOGB0232
Nickel chloride (NiCl2)	SIGMA-ALDRICH	339350
Glycine	AMRESCO	VWRC0167
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	SIGMA-ALDRICH	L4509
Unstained Protein Ladder, Broad Range (10-250 kDa)	NEW ENGLAND BIOLABS	P7703
Amicon Ultracel centrifugal concentrator (Millipore)	MERCK	UFC901096
50 mL Falcon tube	FALCON	BDAA352070
Dialysis tubing	LIVINGSTONE INTERNATIONAL PTY	Dialysis
Snakeskin dialysis tubing	THERMO SCIENTIFIC™	68100
Prepacked HiTrap Chelating HP column	GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES	17-0408-01
EmulsiFlex-C5 high-pressure homogeniser	AVESTIN	EmulsiFlex™ - C5
Peristaltic Pump P-1	GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES	18-1110-91
Superdex 200 HiLoad 26/60 size-exclusion column	GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES	28989336
JASCO J-815 spectropolarimeter	JASCO	J-815