Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Isolatie van dendritische cellen uit de menselijke vrouwelijke voortplantingssysteem voor Phenotypical en functionele Studies

6.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/57100

⸱

13 maart 2018

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Geisel School of Medicine at Dartmouth

In dit artikel

Samenvatting

Hier beschrijven we een methode om te isoleren en te zuiveren van dendritische cellen uit verschillende anatomische compartimenten in de menselijke vrouwelijke voortplantingssysteem voor de evaluatie van hun phenotypical en functionele kenmerken. Deze methode kan worden aangepast aan het isoleren van andere immune cellen of van dendritische cellen uit andere mucosal weefsels.

Samenvatting

De karakterisering van de menselijke dendritische cellen (DC's) woonachtig in de mucosal weefsels is uitdagend als gevolg van de moeilijkheden bij het verkrijgen van monsters, en de lage aantallen van DCs presenteren per weefsel. Nog, als de fenotype en de functie van DCs is gewijzigd door het weefsel milieu, er moet analyseren weefsel resident DC populaties, omdat bloed afkomstig DCs onvolledig weerspiegelen de complexiteit van DCs in weefsels. Hier presenteren we een protocol om te isoleren van de menselijke vrouwelijke voortplantingssysteem (FRT) met behulp van hysterectomie specimens waarmee zowel phenotypical en functionele analyses DCs. Het protocol bestaat uit weefsel spijsvertering voor het genereren van een eencellige gemengd celsuspensie, gevolgd door positieve magnetische kraal selectie. Ons weefsel spijsvertering protocol doet niet klieven oppervlakte markers, waardoor phenotypical en functionele analyse van DCs in de steady-state, zonder overnachting incubatie of cel activering. Dit protocol kan worden aangepast voor de isolatie van andersoortige immuun cel of isolatie van DCs uit andere weefsels.

Inleiding

De FRT heeft de dubbele functie van de bescherming tegen ziekteverwekkers terwijl het toestaan van implantatie en zwangerschap1. Om dit te bereiken, is de FRT gecompartimenteerd, met elke anatomische regio unieke histologische, immunologische en functionele kenmerken1weer te geven.

DCs bijwonen mucosal oppervlakken maken contact met microben in de longen, de darmen en de voortplantingsorganen en immuun toezicht voor potentiële ziekteverwekkers2bieden. DCs hebben de unieke mogelijkheid om prime naïef T-cellen en adaptieve immuunresponsen3te activeren. DCs in de FRT zijn ook gespecialiseerd om het dulden van vreemde antigenen, zoals die gevonden in sperma en de zich ontwikkelende foetus, dat succesvolle zwangerschap4. Daarom, afhankelijk van de locatie, de DC fenotype en functie zal zijn verschillend. Het is bekend dat DCs sterk worden beïnvloed door het milieu weefsel, zodat hun aantal, fenotype en functies zijn gewijzigd door het milieu van de weefsels waarin zij3 wonen. Daarom, om te begrijpen van de rol die FRT DCs bij besmettelijke ziekten, zwangerschap, en kanker in de FRT spelen, resident DCs moeten worden bestudeerd, sinds bloed afgeleide DC modellen onvoldoende zijn om de regelgevende complexiteit gevonden in FRT weefsels.

De karakterisatie van menselijke weefsel resident DCs is uitdagend vanwege de lage aantallen cellen aanwezig in de mucosal weefsels en het moeilijk verkrijgen van menselijk weefselmonsters. DCs zijn bestudeerd in de FRT via immunohistochemistry5,6, die informeert over de cellocatie in het weefsel, maar verzet zich tegen de functionele studies, en die is beperkt in het aantal identificeren cel markeringen die kunnen worden geanalyseerd tegelijk. Bovendien zijn eencellige isolatie protocollen voor flow cytometrische analyse ontwikkelde7,8,9. Sommige van deze protocollen te profiteren van de trekkende capaciteit van DCs te isoleren van de cellen die migreren. Deze methoden meestal 's nachts incubations en selectie van geactiveerde DCs vereisen, maar laat niet voor de studie van DCs in de steady state.

Hier, met behulp van hysterectomie specimens, we geoptimaliseerd een protocol om te isoleren DCs van verschillende anatomische sites in de FRT, het endometrium (EM), de endocervix (CX), en de ectocervix (ECX), waarmee zowel de phenotypical en de functionele analyses. Een niet-Proteolytische enzymatische spijsvertering-protocol gebruikt, kunnen wij onmiddellijk na weefsel spijsvertering aan cel isolatie en stroom cytometrische karakterisering zonder activering van de cel. Multicolor stroom cytometry gebruikt en functionele studies voor de lage aantallen cellen aan te passen, kunnen we identificeren en karakteriseren van zeldzame deelverzamelingen van DCs in de verschillende sites van de FRT.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Studies waarbij menselijke proefpersonen werden uitgevoerd volgens de beginselen die zijn uitgedrukt in de verklaring van Helsinki. Studies werden goedgekeurd door de Dartmouth College institutionele Review Board en de Commissie voor de bescherming van de menselijke onderwerpen (CPHS). Schriftelijke geïnformeerde toestemming werd verkregen HIV-negatieve vrouwen ondergaan operaties bij Dartmouth-Hitchcock Medical Center (Libanon, NH) voor de operatie. Opgeleide pathologen geselecteerd weefselmonsters van de EM CX en de ECX, vrij van pathologische laesies en ver van de sites van de pathologie. Bloedmonsters werden van vrijwilliger gezonde donoren aangeworven bij Dartmouth Hitchcock Medical Center. Bloeddonoren waren anonieme. Vers geïsoleerde EM, CX en ECX weefsels van de operatiekamer werden overgedragen aan pathologie voor isolatie en classificatie voorafgaande overbrengen naar ons laboratorium in afzonderlijke, steriele polypropyleen-buizen.

1. enzymatische vertering van weefsels

Opmerking: Gebruik van steriele materialen en werken in een biologische veiligheidskast.

  1. Een gemodificeerde Henks evenwichtig zout oplossing (HBSS) 1 x HBSS met fenol rood, 100 U/mL penicilline-streptomycine, 0,35 g/L NaHCO3en 20 mM HEPES voor te bereiden.
  2. De enzymatische cocktail bereiden (gewijzigd HBSS, 450 U/mL collagenase IV, 0,01% [wt/vol] deoxyribonuclease ik, en 2 mg/mL D-glucose). Laat de oplossing door een steriele 0,22 µm filter. Het enzym spijsvertering ideaal, voor te bereiden op de dag van gebruik, maar het kan worden bevroren bij-20 ° C voor opslag. Vermijd het herhaaldelijk bevriezen en ontdooien cycli.
  3. Spoel het weefsel met gemodificeerde HBSS en plaats in een petrischaal van 100 x 15 mm2 . Aanpassen van de grootte van de petrischaal op basis van de hoeveelheid weefsel beschikbaar en het volume van enzym cocktail gebruikt (zie stap 1.4.2 hieronder).
    Opmerking: Weefsels variëren in grootte, afhankelijk van het chirurgische monster verkregen van de pathologie, variërend van 1-10 g.
  4. Fysische procédés met wegwerp scalpel en pincet:
    1. Voeg ongeveer 3 mL van spijsvertering enzym cocktail aan het weefsel te voorkomen tijdens het knippen drogen.
    2. Gebruik pincet te stabiliseren van het weefsel en gehakt met een scalpel te verhogen van het oppervlak van het weefsel blootgesteld aan de cocktail spijsvertering-enzym. Snijd het weefsel in kleine stukjes (< 2 mm op een kant). Voeg voldoende spijsvertering enzym cocktail ter dekking van alle weefsel stukken (5 mL/g weefsel). Plaats het deksel op de petrischaal.
    3. Incubeer bij 37 ° C met 5% CO2 op een rotator bij ongeveer 80 omwentelingen per minuut gedurende 45 minuten ervoor zorgen dat de snelheid van de rotator grondig de spijsvertering enzym cocktail mixen zonder morsen of produceren van bubbels.
    4. Visualiseer de voorbereiding van de weefsel met een omgekeerde licht microscope met de 4 X en 10 X doelstellingen.
      Opmerking: Na vertering, kleine weefsel fragmenten en een gemengde celsuspensie, met inbegrip van zichtbaar epithelial klieren moeten aanwezig zijn (Zie figuur 1A).

2. fysieke scheiding van afzonderlijke cellen

  1. In een steriele omgeving, plaatst u een strak 250 µm gaas met houder in een petrischaal van 150 x 15 mm2 . Ervoor zorgen dat het net ongeveer 0,5 cm boven het oppervlak van de petrischaal is.
  2. De Maas met 2 mL gemodificeerde HBSS NAT en breng het verteerd weefsel op de Maas.
  3. Met behulp van het platte oppervlak van de zuiger van een 10 mL spuit, zachtjes maar stevig, het verteerd gehakt weefsel via de Maas grind.
    Let op: Slijpen te agressief zal schade toebrengen aan de Maas en verhogen van de sterfte van de cel. Deze stap zal scheiden de epitheliale cellen en stromale cellen (met inbegrip van immune cellen) van het bindweefsel en het slijm.
  4. Zodra de weefsel fragmenten hebben grondig zijn verspreid, de Maas en de houder verheffen 2-3 cm boven de petrischaal en de spoel met 3 mL gemodificeerde HBSS extra cellen herstellen.
  5. Het verzamelen van de celsuspensie. Breng de 20 µm gaas met houder in een petrischaal en nat met 2 mL gemodificeerde HBSS. Giet de celsuspensie door de Maas houden de Maas 2-3 cm boven de petrischaal en spoelen met 6 mL gemodificeerde HBSS.
    Opmerking: Deze stap zal scheiden de epitheliale bladen, die worden bewaard op de top, van afzonderlijke cellen die passeren aan de Maas. De doorstroming is een gemengde celsuspensie, waaronder immuuncellen en stromale fibroblasten.
  6. Verzamel de gemengde celsuspensie en centrifuge op 500 x g gedurende 10 minuten Aspirate de vloeistof en resuspendeer de pellet in 4 mL gemodificeerde HBSS voor dichtheid kleurovergang centrifugeren.
  7. Layer de gemengde celsuspensie meer dan 3 mL polysucrose oplossing en centrifugeer bij kamertemperatuur op 500 x g gedurende 30 min met geen rem. De witte band vanaf de bovenkant van de oplossing polysucrose verzamelen en wassen met PBS.
    Opmerking: Dit gedeelte is de verrijkt gemengd celsuspensie, die is rijk aan immuuncellen en bevat enkele stromale fibroblasten.

3. dode cel verwijderen

Opmerking: Als een groot percentage van dode cellen (> 20%) aanwezig in de verrijkte gemengde celsuspensie na dichtheid kleurovergang centrifugeren zijn, verwijdering van de dode cel met magnetische kralen wordt aanbevolen. Dode cellen moeten worden verwijderd omdat ze met het selectieproces positieve magnetische kraal interfereren kunnen.

  1. Met behulp van een hemocytometer op een lichte Microscoop met de 10 X doelstelling cellen tellen. Spin down alle cellen in de verrijkte gemengde celsuspensie (500 x g, 10 min, 4 ° C). Volledig gecombineerd en verwijder het supernatant. Voeg 100 µL van de parels van de verwijdering van de dode cel per 1 x 107 totaal aantal cellen (levende en dode), volgens de instructies van de fabrikant. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
  2. Een 30 µm filter plaatsen op de magnetische kolom, de celsuspensie van toepassing en de kraal-geëtiketteerden cellen te vallen door de magnetische kolom toestaan.
  3. Spoel de kolom met de verwijdering van de dode cel buffer als aanbevolen (3 mL). Verzamel de doorstroming met de levende cellen. Het bereik van cel herstel na verwijdering van de dode cel wordt weergegeven in figuur 1B.
    Opmerking: Deze cellen kunnen worden gebruikt voor het uitvoeren van stroom cytometry kleuring voor phenotypical studies (sectie 5) of voortzetten van DC isolatie (punt 4).

4. DC zuivering door positieve magnetische kraal selectie

  1. Na verwijdering van de dode cel (stap 3.2), draaien de cellen naar beneden, verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet cel in 80 µL magnetische selectie buffer per 1 x 107 cellen (PBS, 0,5% warmte-geïnactiveerd menselijk AB serum (HS), 2 mM EDTA).
  2. Voor positieve selectie van DC populaties, voegt u CD1a of CD14 magnetische kralen volgens de instructies van de fabrikant (20 µL magnetische kralen per 1 x 107 cellen). Incubeer gedurende 15 min bij 4° C.
  3. Wassen van de cellen met de magnetische selectie buffer, spin naar beneden en volledig verwijderen van de buffer. Resuspendeer de cellen in een minimum van 500 µL van magnetische selectie buffer.
  4. De kolom toevoegen aan de magneet en een 30 µm filter bovenaan de kolom te behouden elke resterende cel klontjes toe te voegen. Spoel de filter- en kolominstellingen met magnetische selectie buffer zoals aanbevolen.
  5. De celsuspensie toepassen in de kolom. Spoel 3 keer met magnetische selectie buffer.
  6. De kolom overbrengen in een buis 15 mL, voeg 5 mL van magnetische selectie buffer en de plunjer om los van de geselecteerde cellen in de kolom toepassen.
  7. Het vergroten van de zuiverheid, herhaalt u stappen 4.4-4.6 met de herstelde cellen met behulp van een nieuwe kolom. In Figuur 1 cis het bereik van cel herstel na magnetische kraal selectie gepresenteerd.

5. beoordeling van de zuiverheid van de cel: Stroom Cytometry en microscopie

  1. Antilichaam kleuring voor stroom cytometry:
    1. Resuspendeer tot 1 x 106 cellen in 100 µL van PBS met 20% warmte-geïnactiveerd HS te blokkeren Fc receptoren, en incubeer gedurende 10 min op ijs.
    2. Voeg de gewenste fluorescently label antilichamen en het reagens voor identificatie van dode cellen (voor een voorbeeld, zie punt 6.5). Fluorescentie minus één (FMO) controles te de poorten, gebruiken compensatie kralen voor te bereiden op één vlek besturingselementen compensatie instellen Voorbeelden van antilichamen die gebruikt zijn gegeven in tabel 1. Incubeer gedurende 20 minuten bij 4 ° C, beschermd tegen licht.
    3. Wassen van de cellen met 2 mL magnetische selectie buffer.
      Opmerking: De aanwezigheid van EDTA is belangrijk te voorkomen dat de vorming van cel samendoen voor flow cytometrische analyse. Draai naar beneden en verwijder het supernatant.
    4. De cellen door toevoeging van 100 µL van 2%-oplossing van de paraformaldehyde per buis bevestigen.
    5. Analyseer de monsters in een stroom cytometer10,11.
  2. Draaien de kolom (bijvoorbeeld, cytospin) en toepassing Giemsa-kleuring voor het analyseren van de morfologie:
    1. Resuspendeer de cellen in 200 µL van magnetische selectie buffer.
    2. Laden in een kolom van de spin en de spin voor 5 min. Laat de dia volledig drogen.
    3. Herstellen van de dia door onderdompeling in 100% methanol gedurende 2 minuten spoelen de dia met gedeïoniseerd water en laat ze in de lucht droog.
    4. Voer een standaard Wrights-Giemsa-kleuring. Dekking van de cellen met eosine en incubeer gedurende 10 min, spoel af met gedeïoniseerd water en laten drogen. Dekking van de cellen met Wrights-Geimsa vlek, Incubeer gedurende 1 min, spoel af met gedeïoniseerd water, en droge lucht.
    5. Bekijk de voorbereidingen met een omgekeerde Microscoop (figuur 2A, 40 X doelstelling).

6. allogene stimulatie test om te beoordelen van de functie van de cel DC

  1. Ontdooi de bevroren perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs)
    1. Warm de cel voedingsbodems met 10% HS tot 37 ° C.
    2. Ontdooi de PBMCs door het plaatsen van de cryotube in een waterbad 37 ° C, totdat een kleine hoeveelheid bevroren cel media in de cryotube blijft. In een steriele omgeving, breng de inhoud van de cryotube tot 10 mL van de voedingsbodems voorverwarmde cel met 10% HS in een tube van 15mL.
    3. Centrifugeer bij ~ 500 x g voor 7 min. verwijderen van de media, verspreiden de pellet, resuspendeer de PBMCs in 10 mL cel voedingsbodems met 10% HS en centrifuge de cellen.
    4. Herhaal de stap was een derde keer. Cellen tellen.
  2. Naïve T-cel-selectie:
    1. Gebruik een negatieve selectie magnetische antilichaam cel selectie kit te naïef T-cellen isoleren volgens protocol van de fabrikant.
    2. Controleer de zuiverheid met CD45RA en CCR7 antilichamen na isolatie.
      Opmerking: Typische zuiverheid is > 99% naïef T-cellen.
  3. Naïve T-cel proliferatie kleurstof vlekken:
    1. Bereiden 600 µL van 2 x oplossing van cel proliferatie kleurstof, de kleurstof te beschermen tegen blootstelling aan licht.
    2. Wassen van de naïeve T-cellen 2 x met PBS. Resuspendeer de cellen in 500 µL PBS.
    3. Terwijl zachtjes vortexing toevoegen de cellen in het kabinet, biosafety 500 µL van proliferatie kleurstof aan de naïeve T-cellen.
    4. Incubeer de cellen gedurende 10 minuten bij 37° C.
    5. Stop het labelen van de cel door toevoeging van 5 mL van cel voedingsbodems met 10% HS aan de cellen. Incubeer op ijs voor 5 min, beschermd tegen licht.
    6. Centrifugeer de cellen bij ~ 500 x g gedurende 7 minuten, de media gecombineerd en resuspendeer de cellen in de 4 ° C voor cel voedingsbodems met 10% HS. Herhaal nog tweemaal voor een totaal van 3 wasbeurten. Neem een hoeveelheid cellen zullen worden geteld voorafgaand aan de laatste centrifugeren.
      Opmerking: Doorgaans laatste naïef T-cel nummers zullen variëren tussen 5% en 15% van de initiële PBMC cel graaf.
    7. Resuspendeer de cellen met de cel-cultuur-media met 10% HS in de gewenste cel concentratie.
  4. DC-allogene naïef T-cel co cultuur:
    1. De geïsoleerde DCs en naïef T-cellen in een 96-Wells, ronde bodem plaat, plaat op een 1:15 verhouding van DCs naar T-cellen. Ervoor zorgen dat het optimale aantal voor DCs varieert tussen de 3.000 en 5.000 cellen per putje.
    2. Centrifugeer de plaat duikt met ~ 500 x g gedurende 3 minuten om ervoor te zorgen dat de cellen zich bevinden in het midden van de put. Cel-naar-cel contact is belangrijk voor de juiste signalering optreden.
    3. Incubeer bij 37 ° C gedurende 6 dagen. Toezicht op het cluster van cellen, die worden weergegeven in de putjes zoals proliferatie, met microscopie (figuur 3A gebeurt).
  5. Stroom cytometry vlekken om te beoordelen van verspreiding:
    1. Na 6 dagen, kunnen de cellen door stroom cytometry worden onderzocht. De co cultuur voor stroom cytometry vlek.
    2. Bereid een 2 x-oplossing van gele levensvatbaarheid kleurstof (maximale emissie 572 nm) in PBS.
      Opmerking: Het gebruik van PBS zonder serum is belangrijk, als serum eiwitten mengen met de kleurstof).
    3. De plaat met cellen bij centrifugeren ~ 500 x g gedurende 5 minuten.
    4. 100 µL van de bovendrijvende vloeistof verwijderen.
      Opmerking: op dit punt verzamelen en opslaan van het supernatant voor afzonderlijke analyse van oplosbare factoren.
    5. Wassen van de cellen twee keer met PBS: toevoegen van 150 µL per putje van PBS, centrifugeer bij ~ 500 x g gedurende 5 minuten, verwijder 150 µL van bovendrijvende substantie met een pipet. Zorg ervoor dat er 50 µL van supernatant in elk putje blijft.
    6. Aan elk putje 50 µL van 2 x levensvatbaarheid kleurstof toevoegen Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten, beschermd tegen licht.
    7. Tijdens de incubatie, bereiden een master mengsel van gewenste antilichaam markers. Bijvoorbeeld: CD3 APC/Cy7, CD4 PE, CD8 FITC, enz.
    8. Het antilichaam mengsel toevoegen aan elk putje. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten, beschermd tegen licht.
    9. Wassen van de cellen 2 x met PBS + 2% HS: toevoegen van 150 µL per putje van PBS + 2% HS. Centrifugeer bij ~ 500 x g voor 5 min. verwijderen 150 µL van bovendrijvende substantie met een pipet.
    10. Het vaststellen van de cellen door toevoeging van 100 µL per putje van 2% para-formaldehyde. Indien nodig: de cellen en de media overzetten polypropyleen stroom cytometry buizen. Buizen worden bij 4 ° C bewaard en beschermd tegen het licht, tot en met de stroom cytometrische analyse.
    11. Lees buizen in een flow-cytometer.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Volgende weefsel spijsvertering, de vrijlating van epitheliale bladen en klieren kan worden waargenomen, zoals weergegeven in figuur 1A; Dit is een positieve controle verschijnt dat de enzymatische vertering is voltooid. Het aantal totaal aantal levensvatbare cellen en DCs hersteld per gram weefsel worden ook weergegeven in figuur 1B en Figuur 1 c, respectievelijk. Immune cellen vertegenwoordigen tus...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Mucosale DCs zijn een zeldzame celpopulatie sterk beïnvloed door het milieu weefsel, dat verandert hun fenotype en functie zodra ze de weefsels3invoert. Terwijl bloed afkomstig DCs zijn een handig model, ze doen niet geheel representatief is de diversiteit van DC populaties gevonden in weefsels. Daarom, om te begrijpen van de unieke kenmerken van mucosal DCs, isolatie van primaire cellen van weefsels is noodzakelijk. Isolatie van DCs van verschillende anatomische sites in de FRT biedt de mogelijkh...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen

Dankbetuigingen

Ondersteund door de NIH studiebeurzen AI102838 en AI117739 (CRW). Wij danken Richard Rossoll voor technische bijstand. Flow cytometrische analyse werd uitgevoerd in DartLab, de gedeelde Resource Dartmouthsupported door (P30CA023108-37) en (P30GM103415-15).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)HycloneSH30015.03
Penicillin-streptomycinHycloneSV30010
HEPES (1M)Hyclone15630-080
Collagenase IVSigmaC5138
Deoxyribonuclease IWorthington BiochemicalLS002140
D-glucoseSigma Aldritch50-99-7
0.22 um Stericup 500 mL filterMilliporeSCGPU05RE
100mm x 15mm polystyreen petrischaalFisherbrandFB0875712
150mm x 15mm polystyreen petrischaalFisherbrandFB0875714
150mm x 25mm polystyreen schaalCorning430599Behandelde celkweker
Isotemp IncubatorFisher ScientificFICO3500TABB5.0% CO2
American Rotator VAmerican DADER4140
250 um nylon gaasSefar03-250/50
20 um nylon gaasSefar03-20/14
Beckman GS-6R CentrifugeBeckman358702
X-VIVO 15 met Gentamicin L-Gln, Fenol Rood, 1 LLonza04-418Q
Human AB SerumValley BiomedicalHP1022
Histopaque-1077Sigma Aldritch10771
Fosfaat Buffer Solution (PBS)National DiagnosticsCL-253pH 7.4
Dead Cell Removal KitMiltenyi Biotec130-090-101
Pre-separation filter (30um)Miltenyi Biotec130-041-407
LS columnMiltenyi Biotec130-042-410
Quadro MACS SeparatorMiltenyi Biotec130-090-976
MACS multi-standMiltenyi Biotec130-042-303
EDTAUSB15694
CD1a Microbeads, humanMiltenyi Biotec130-051-001
CD14 Microbeads, humanMiltenyi Biotec130-050-201
eFluor 670 celproliferatiekleurstofeBiosciences65-0840-85
96 wells ronde bodemplaatFalcon9/8/2866
Zombie geel levensvatbaarheidskleurstofBiolegend423104
CD3 APC/Cy7, anti-humanTonbo Biosciences25-0038-T100
CD4 PE, anti-humaneBiosciences12-0048-42
CD8a FITC, anti-humanTonbo Biosciences35-0086-T100
Gallios Flow CytometerBeckman Coulter Life SciencesB4361810 kleuren, VBR
MACSquant Analyzer 10Miltenyi Biotec130-096-3438 kleuren, VBR

Referenties

  1. Wira, C. R., Rodriguez-Garcia, M., Patel, M. V. The role of sex hormones in immune protection of the female reproductive tract. Nat Rev Immunol. 15 (4), 217-230 (2015).
  2. Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
  3. Schlitzer, A., McGovern, N., Ginhoux, F. Dendritic cells and monocyte-derived cells: Two complementary and integrated functional systems. Semin Cell Dev Biol. 41, 9-22 (2015).
  4. Tagliani, E., Erlebacher, A. Dendritic cell function at the maternal-fetal interface. Expert Rev Clin Immunol. 7 (5), 593-602 (2011).
  5. Kaldensjo, T., et al. Detection of intraepithelial and stromal Langerin and CCR5 positive cells in the human endometrium: potential targets for HIV infection. PLoS One. 6 (6), e21344(2011).
  6. Schulke, L., Manconi, F., Markham, R., Fraser, I. S. Endometrial dendritic cell populations during the normal menstrual cycle. Hum Reprod. 23 (7), 1574-1580 (2008).
  7. Ballweber, L., et al. Vaginal langerhans cells nonproductively transporting HIV-1 mediate infection of T cells. J Virol. 85 (24), 13443-13447 (2011).
  8. Hladik, F., et al. Initial events in establishing vaginal entry and infection by human immunodeficiency virus type-1. Immunity. 26 (2), 257-270 (2007).
  9. Duluc, D., et al. Functional diversity of human vaginal APC subsets in directing T-cell responses. Mucosal Immunol. 6 (3), 626-638 (2013).
  10. Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Parks, D. R. Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed. Nat Immunol. 7 (7), 681-685 (2006).
  11. Juno, J. A., Boily-Larouche, G., Lajoie, J., Fowke, K. R. Collection, isolation, and flow cytometric analysis of human endocervical samples. J Vis Exp. (89), (2014).
  12. Givan, A. L., et al. Flow cytometric analysis of leukocytes in the human female reproductive tract: comparison of fallopian tube, uterus, cervix, and vagina. Am J Reprod Immunol. 38 (5), 350-359 (1997).
  13. Rodriguez-Garcia, M., et al. Dendritic cells from the human female reproductive tract rapidly capture and respond to HIV. Mucosal Immunol. 10 (2), 531-544 (2017).
  14. Rodriguez-Garcia, M., Barr, F. D., Crist, S. G., Fahey, J. V., Wira, C. R. Phenotype and susceptibility to HIV infection of CD4+ Th17 cells in the human female reproductive tract. Mucosal Immunol. 7 (6), 1375-1385 (2014).
  15. Shen, Z., Rodriguez-Garcia, M., Ochsenbauer, C., Wira, C. R. Characterization of immune cells and infection by HIV in human ovarian tissues. Am J Reprod Immunol. , (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Isolatie van dendritische cellenweefseldigestieselectie met magnetische beadsflowcytometrie analyseCD1a CD14 markersdichtheidsgradi ntcentrifugatieverwijdering van dode cellenbereiding van celstuspensiefenotypische functionele studies
Isolatie van dendritische cellen uit de menselijke vrouwelijke voortplantingssysteem voor Phenotypical en functionele Studies
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.