Ontleden multi signalering eiwitcomplexen door Bimolecular complementatie affiniteit zuivering (BiCAP)

Samenvatting

Dit manuscript beschrijft het protocol voor Bimolecular complementatie affiniteit zuivering (BiCAP). Deze nieuwe methode vergemakkelijkt de specifieke isolatie en downstream proteomic karakterisering van elk twee interacterende eiwitten, terwijl met uitzondering van VN-complexvorm individuele eiwitten evenals complexen gevormd met concurrerende bindende partners.

Samenvatting

De vergadering van eiwitcomplexen is een centraal mechanisme dat ten grondslag ligt aan de regulering van vele cel signalering trajecten. Een belangrijk aandachtspunt van het biomedisch onderzoek is hoe deze dynamische eiwitcomplexen handelen om signalen van meerdere bronnen om een specifieke biologische reactie te integreren, en hoe dit wordt gedereguleerd in veel instellingen van ziekte ontcijferen. Ondanks het belang van dit belangrijke biochemische mechanisme is er een gebrek aan experimentele technieken die de specifieke en gevoelige deconvolutie van deze multi moleculaire signalering complexen kan vergemakkelijken.

Hier is deze tekortkoming aangepakt door de combinatie van een kwantitatieve analyse van eiwit, complementeren met een conformatie-specifieke nanobody, die wij hebben genoemd Bimolecular complementatie affiniteit zuivering (BiCAP). Deze nieuwe techniek faciliteert de specifieke isolatie en downstream proteomic karakterisering van elk paar van interacterende eiwitten, met uitsluiting van het un-complexvorm individuele eiwitten en complexen gevormd met concurrerende bindende partners.

De BiCAP techniek is aanpasbaar aan een breed scala van downstream experimentele tests en de hoge mate van specificiteit die worden geboden door deze techniek laat meer genuanceerde onderzoek naar de mechanica van eiwit complex vergadering dan momenteel mogelijk is met behulp van standaard affiniteit zuivering technieken.

Inleiding

Eiwit complex vergadering is een belangrijke proces bij het handhaven van de spatio specificiteit van vele seingeving trajecten^1,2. Terwijl de kritische aard van deze regelgevende rol wordt algemeen erkend, is er een gebrek aan experimentele technieken beschikbaar om onderzoekt deze complexen. Meeste interactomics studies richten op interacties met afzonderlijke proteïnen, of de sequentiële verrijking van individuele complexe componenten. Hier presenteren we een techniek voor de isolatie van een specifieke proteïne-dimeer terwijl met uitzondering van de individuele wordt van het onderdeel eiwitten evenals complexen gevormd met concurrerende partners³bindend. We hebben deze techniek genaamd Bimolecular complementatie affiniteit zuivering (BiCAP), als het is een combinatie van een eerder bestaande eiwit fragment complementatie assay, Bimolecular fluorescentie complementatie (BiFC), met het nieuwe gebruik van een de recombinante nanobody conformatie-specifieke richting GFP en derivaten daarvan (Zie tabel of Materials).

Een typisch eiwit-fragment complementatie assay is afhankelijk van de expressie van "aas" en "prooi" eiwitten gesmolten als u wilt splitsen fragmenten van verslaggevers zoals luciferase⁴, β-galactosidase⁵of groen fluorescente proteïne (GFP)⁶ ( Figuur 1A). Door de interactie van de aas en prooi eiwitten, worden de split verslaggever domeinen aangemoedigd om refold in een functionele structuur, waardoor de interactie van het aas en prooi eiwitten worden gevisualiseerd of gekwantificeerd. BiCAP werd aangepast van een versie van deze techniek die gebruik van fragmenten van het GFP-variant Venus. Fluorescent proteïne complementatie testen zijn een populaire methode voor het visualiseren van eiwit-eiwitinteractie in een levende cel, maar tot nu toe beperkt gebleven tot en met dit één functie⁷. BiCAP vertegenwoordigt een belangrijke stap vooruit in dit opzicht, aangezien deze techniek niet alleen voor visualisatie, maar ook de isolatie en ondervraging van de resulterende eiwit-eiwit interactie staat.

Figuur 1: de structurele opdrachtgever achter de techniek BiCAP. (A) een schema waarin de opdrachtgever achter bimolecular fluorescentie complementatie weergegeven: de 'aas' en 'prooi' eiwitten gelabeld met de N-terminale V1 of V2 C-terminal fragmenten van de full-length Venus proteïne. (B) structurele analyse van de interactie interface (cyaan) tussen de GFP nanobody (groen) en gerecombineerde Venus, waarop de plaats van de (grijze) V1 en V2 (oranje) fragmenten (VOB toetreding 3OGO). Dit cijfer is heruitgegeven fromCroucher et al.³ herdrukt met toestemming van AAAS. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

De BiCAP techniek maakt gebruik van twee niet-belichting fluorescerende fragmenten van Venus (met de naam V1 en V2) die associëren met een lage graad van verwantschap, tenzij een interactie tussen de partners van hun fusie plaatsvindt. In dit geval refold de twee gesplitste domeinen naar de functionele structuur van de β-vat van de fluorophore (figuur 1B)⁶. De belangrijkste vernieuwing van BiCAP komt uit de invoering van de recombinante GFP-nanobody, die een driedimensionale epitoop herkend op de β-vat van GFP (en varianten zoals Venus) die alleen aanwezig op het fluorophore correct gerecombineerde en gevouwen ( is Figuur 1B)⁸. De nanobody van GFP bindt is cruciaal, niet tot een van de afzonderlijke fragmenten van Venus. Dit vergemakkelijkt de isolatie van de eiwit-Dimeren pas nadat de twee eiwitten een complex van hun eigen houtje, wat leidt tot meer representatieve resultaten dan die verworven van methoden waarmee het gebruik van chemisch geïnduceerde, gedwongen interacties⁹hebben gevormd.

BiCAP is een krachtige techniek die zich specifiek op meerdere eiwitcomplexen, die potentieel kunnen worden gecombineerd met een aantal downstream toepassingen richt ter verbetering van de granulariteit van ons begrip van de rol van deze complexen in signaaltransductie . Het omvat ook de belangrijke functie van het toestaan van visualisatie van eiwit interacties in situ. Tot op heden als een effectieve methode van het analyseren van de interactome van receptor tyrosine kinase (RTK) Dimeren³BiCAP is aangetoond, maar het aanpassingsvermogen van deze methode betekent dat het kan worden aangenomen in bijna elke context van de interactie eiwit.

Protocol

1. het klonen van de plasmide

Opmerking: Voor het genereren van plasmide vectoren met de V1 of V2 tags gesmolten aan de N-terminus- of C-terminus van het gen van belang, BiFC bestemming vectoren zijn nedergelegd met Addgene [N-terminale label: pDEST-V1-ORF (#73635), pDEST-V2-ORF (#73636). C-terminal label: pDEST-ORF-V1 (#73637), pDEST-ORF-V2 (#73638)]. Het gen/s van belang moeten worden in specifieke recombinatie klonen compatibel vermelding vectoren (dat wil zeggen, pDONR223 of pENTR221), zonder stop codonen, om verder te gaan met het klonen. Veel compatibel klonen zijn al beschikbaar binnen verschillende plasmide collecties, met inbegrip van de zoogdieren genoom-collectie (https://genecollections.nci.nih.gov/MGC/).

1. Voer een recombinatie reactie als u wilt invoegen het gen van belang tussen de sites van attR van de passende BiFC bestemming vector:
   1. In een 0,2 mL-buis, 150 ng post vector, 150 ng BiFC bestemming vector en 8 µL TE buffer (pH 8.0) toevoegen.
   2. 2 µL recombinase enzym mix toevoegen (Zie Tabel van materialen). Meng goed en kort centrifugeren.
   3. Incubeer de reactie gedurende 1 uur bij kamertemperatuur of bij 16 ° C's nachts.
   4. Zet de reactie stop door toevoeging van 1 µL proteïnase-K oplossing en incuberen bij 37 ° C gedurende 10 minuten.
2. Transformeren warmte-schok-bevoegde cellen (Zie Tabel van materialen) met het reactieproduct van LR:
   Opmerking: Elke elementaire stam denkbaar inzetbaar op dit punt, zolang het bevat niet de Ccdb-antitoxine, die zou voorkomen dat de specifieke selectie van plasmiden met de invoegen.
   1. Ontdooi bevoegde cellen op ijs en breng 50 µL van cellen in een 14 mL Rondbodemkolf polypropyleen buis.
   2. Voeg 1 µL van reactieproduct aan de cellen en voorzichtig mengen. Incubeer gedurende 20 min op ijs.
   3. Verwarm schok in 42 ° C waterbad voor 45 s. onmiddellijk terug te keren naar het ijs gedurende 2 minuten.
   4. Voeg vervolgens 1 mL van LB-media en incubeer met schudden bij 37 ° C gedurende 1 uur.
   5. Plaat van de transformatie op een bord van 10 cm agar met ampicilline (100 µg/mL) en Incubeer bij 37 ° C's nachts.
3. Zuivering van BiFC plasmide.
   1. Als u wilt zuiveren plasmide van een individuele kolonie, 100 mL van LB-media aan een grote erlenmeyer toevoegt en ampicilline (100 µg/mL). Om het scherm van meerdere kolonies, voeg 5 mL van LB-media 14 mL Rondbodemkolf polypropyleen buizen en toevoegen van ampicilline (100 µg/mL).
   2. Met behulp van een steriele inoculatie lus, kies een één kolonie van de agarplaat. Plaats de inoculatie lus in de LB-media en meng kort.
   3. Bedek de bovenkant van de erlenmeyer met aluminiumfolie en na een nacht bebroeden bij 37 ° C met schudden.
   4. Produceren van transfectie rang plasmide DNA met behulp van een standaard maxiprep of midiprep plasmide DNA zuivering kit (Zie Tabel van materialen)¹⁰. Beoordeling van kwaliteit van DNA door absorptie spectra.
      Opmerking: DNA moet een verhouding van A260/A280 > 1.8 en een verhouding van A260/A230 > 2.0. Op dit punt, is het aanbevolen om meerdere afzonderlijke kolonies te controleren voor efficiënte expressie van het donormateriaal en de label van het scherm.

2. cel cultuur en transfectie

Opmerking: Voor transfectie van de vectoren van BiFC het is belangrijk om een hoog rendement en relatief homogene transfectie. De vectoren zal wellicht compatibel met elke standaard transfectiereagens, en de voorwaarden van de transfectie moeten dienovereenkomstig worden geoptimaliseerd. Voor het uitvoeren van massaspectrometrie, cultuur we meestal cellen binnen 10 cm schotels, hoewel dit kan ook worden proportioneel verkleind tot kleinere gerechten of platen voor experimenten die minder materiaal vereisen.

1. Zaad 1.0 × 10⁶ HEK293T cellen in een 10 cm schotel met 10 mL van DMEM media, aangevuld met 10% FBS en penicilline/streptomycine (1:100).
2. Verdun 2,5 µg voor elke BiFC vector in 500 µL van transfectie buffer (Zie Tabel van materialen) in een tube van 1,5 mL microcentrifuge.
3. Voeg 10 µL van transfectiereagens (Zie Tabel van materialen).
4. Vortex mengsel voor 10 s, dan kort centrifuge. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
5. Voeg het mengsel van de transfectie DNA aan de plaat, ontkleuring. Incubeer de cellen gedurende een voldoende tijd voor de BiFC fusion eiwitten om te communiceren en voor Venus vouwen en fluorophore rijping, over het algemeen ~ 8-24 uur.
   Opmerking: De excitatie van de piek voor Venus is 515 nm en haar piek-emissie is 528 nm, hoewel dit is gemakkelijk bekeken met behulp van een standaard fluorescente microscoop opgericht om te visualiseren GFP fluorescentie.

3. de monstervoorbereiding

1. Oogsten lysates
   1. Vóór lysate collectie, bereiden Lysis van de cel Buffer [50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, de niet-ionogene wasmiddel 1% (v/v) (Zie Tabel van materialen)]. Bewaren bij 4 ° C.
   2. Onmiddellijk vóór de oogst, een aanvulling op 10 mL Lysis van de cel Buffer met proteaseinhibitor en fosfatase-remmer (Zie Tabel van materialen). Houd aangevuld Lysis van de cel Buffer op ijs.
   3. Wassen cellen tweemaal in ijskoude PBS. De PBS gecombineerd en voeg 1 mL ijskoud aangevuld cellysis-buffermengsel. Zet de schotel op het ijs, ervoor te zorgen dat de buffer is verspreid over de gehele oppervlakte.
   4. Incubeer op ijs gedurende ongeveer 5 min. en gebruikt u vervolgens een cel schraper (Zie Tabel van materialen) schrapen van de cellen en overbrengen naar een vooraf gekoeld 1,5 mL microcentrifuge buis.
   5. Verwijderen van cellulaire puin door centrifugeren de verzamelde lysate op 18.000 × g gedurende 5 minuten bij 4 ° C en overdracht gewist supernatant in verse microcentrifuge buizen.
      Opmerking: op dit punt de lysate kunnen onmiddellijk gebruikt of opgeslagen bij-80 ° C. Het is ook aanbevolen om een hoeveelheid ruwe lysate houden, zodat de efficiëntie van transfectie en de zuivering van de affiniteit kan worden gevalideerd.
2. Affiniteit zuivering
   Opmerking: De BiCAP isolatie stap wordt uitgevoerd met behulp van de nanobody van GFP geconjugeerd met agarose kralen (Zie Tabel van materialen).
   1. Bereid de agarose kralen door het wassen van een passende omvang (20 µL per monster) + 10 µL teveel in 1 mL PBS. De kralen op 300 x g centrifugeren en verwijder de bovendrijvende substantie.
   2. Voeg 20 µL aan elke lysate monster.
   3. Incubeer de monsters gedurende 2 uur bij 4 ° C met end-to-end rotatie.
      Opmerking: op dit punt de monsters kunnen worden voorbereid voor de SDS-pagina en westelijke bevlekken, of analyse door massaspectrometrie.
3. Voorbereiding van BiCAP eluant voor het westelijke bevlekken.
   1. Centrifugeer de kralen op 300 x g en wassen drie keer in Lysis van de cel Buffer.
   2. Resuspendeer de gewassen kralen in 50 µL van adequaat verdunde monster buffer (Zie Tabel van materialen) en warmte van de monsters bij 95 ° C gedurende 2-3 min.
      Opmerking: Monsters voorbereid op deze wijze kunnen worden opgeslagen bij-20 ° C voor enkele maanden.
   3. Het uitvoeren van SDS-pagina en westelijke bevlekken¹¹ voor zowel de label V1 en V2 labels (Zie tabel van materialen), als goed als elke andere proteïnen van belang.
4. Voorbereiding van BiCAP eluant voor massaspectrometrie.
   Opmerking: Voor analyse door label-vrije kwantitatieve massaspectrometrie (LFQ) wordt aanbevolen om de voorbereiding van de monsters in ten minste quadruplicate om ervoor te zorgen robuuste statistisch onderscheidingsvermogen.
   1. Centrifugeer de kralen op 300 x g en wassen zesmaal in Lysis van de cel Buffer zonder wasmiddel. Dit is noodzakelijk om zowel de overtollige eiwitten, en ook het wasmiddel dat met de analyse van de Spectrometrie van de massa interfereren zal. Ga naar de volgende stap onmiddellijk, of bewaar de kralen bij-80 ° C.
   2. Trypsinize kralen in 60 µL Buffer 1 [2 M ureum, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 5 µg/mL trypsine]. Toestaan dat de kralen te verteren voor 30 min bij 27 ° C in een thermomixer schudden bij 800 RPM.
   3. Kort centrifugeren kralen, dan verzamelen supernatant en overdracht microcentrifuge buizen (Zie Tabel van materialen).
   4. Wassen van de kralen in 25 µL Buffer 2 [2 M ureum, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM dithiothreitol], teneinde de afhankelijke eiwitten.
   5. Zwembad de kralen en de bovendrijvende substantie in een microcentrifuge buis. Toestaan dat de vertering 's nachts optreden bij kamertemperatuur.
   6. Alkylate van de monsters door 20 µL van iodoacetamide (5 mg/mL in ultrazuiver water) toe te voegen aan elk monster en broeden in het donker gedurende 30 minuten.
   7. Remmen spijsvertering door de behandeling van elk monster met 1 µL trifluorazijnzuur (TFA). Deze stap zal ook de monsters ter voorbereiding van fase kantelen breng.
   8. Construct C18 fase tips door stapelen 6 lagen van 1 mm vaste fase extractie C18 (octadecylmethacrylaat) membraan schijven (Zie Tabel van materialen) in een 200 µL micropipet tip. Het voorbereiden van een enkele tip voor elk monster.
   9. NAT van de etappe tips met methanol, en equilibreer met 50 µL 0,1% (v/v) trifluorazijnzuur (TFA), 80% (v/v) acetonitril.
   10. De tips met 50 µL 0,1% (v/v) TFA wassen.
   11. Laad de aangezuurde peptiden op de fase tips en Elueer vervolgens met behulp van 0,1% (v/v), TFA, 80% (v/v) acetonitril in twee stappen.
   12. De monsters met behulp van een vacuüm concentrator verdampen.
   13. Indien nodig, opgeslagen gedroogde peptiden bij-80 ° C.

4. massaspectrometrie.

1. Resuspendeer monsters in 15 µL van 5% mierenzuur, 2% acetonitril (in ultrazuiver water).
2. Zorgvuldig laden 6 µL op een LC-plaat en de plaats in een nanoLC HPLC-systeem (Zie Tabel van materialen).
3. Pak een 20 cm, 75 µM binnendiameter kolom met 1.9 µm C18 stationaire fase deeltjes (Zie Tabel van materialen). Laden 5 µL peptide op elke kolom.
4. Elueer met behulp van een lineair verloop van acetonitril op 250 nL/min meer dan 140 min peptiden en in een lineaire Trap Quadropole (LTQ) hybride-massaspectrometer gekoppeld aan het nanoLC HPLC-systeem door nanoelectrospray introduceren.
5. Tandem MS gegevens voor de top 10 meest voorkomende ionen per scan verzamelen over het verloop van een 140 minuten tijd. De volgorde van de gegevensverzameling en -uitwisseling met BSA uitvoeren tussen elk monster om te minimaliseren van de temporele bias willekeurig.

5. analyse

1. Ruwe MS gegevens met behulp van de standaardinstelling binnen MaxQuant softwareversie 1.2.7.4 verwerken en analyseren van MaxQuant uitvoer met gewijzigde versie van de workflow van de statistische analyse Perseus in de R software omgeving³.
   Opmerking: De workflow van de statistische analyse vanaf dit punt is samengevat in Figuur 2. Kort, LFQ intensiteiten van eiwitten geïdentificeerd met behulp van MaxQuant worden getransformeerd en gefilterd gevolgd door normalisatie en beschuldiging. Interacterende eiwitten van dimeer paren worden geïdentificeerd ten opzichte van een Venus-controle, om het uitsluiten van niet-specifieke achtergrond bindmiddelen, met de Student t-test en Benjamini-Hochberg correctie voor meerdere vergelijkingen. Kwaliteit van de gegevens wordt bevestigd door de vergelijkingen van de afzonderlijke histogrammen, meervoudige regressie en hiërarchische clustering.

Figuur 2: overzicht van de statistische analyse workflow. Stroomdiagram van een statistische analyse pijpleiding gebruikt voor het analyseren van de LFQ-intensiteiten van eiwitten geïdentificeerd van spectrometrie van de massa van de ruwe gegevens die worden verwerkt met behulp van MaxQuant. Groene vakken: filteren, blauwe dozen: transformatie/normaliseren/schalen, bruine boxen: gegevens kwaliteit controle, gele vakken: semi-kwantitatieve uitsluiting/vergelijkende analyse, grijze vakken: statistische analyse. Dit cijfer is heruitgegeven fromCroucher et al.³ herdrukt met toestemming van AAAS. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Resultaten

Na het gebruik van recombinatie klonen voor het genereren van V1 en V2 tagged genen van belang met de BiFC pDEST plasmiden, co transfectie van plasmiden met twee, met een paar interacterende eiwitten zal resulteren in het genereren van een signaal Venus fluorescerende na ongeveer 8-24 uur. Bij gebrek aan een positief signaal is het mogelijk dat de interactie eiwit niet kan worden voorkomen als gevolg van de keuze van cellijn, een lage transfectie efficiëntie of die de oriëntatie van de Bi...

Discussie

BiCAP is een krachtige methode voor het isoleren van de specifieke proteïne Dimeren terwijl met uitzondering van de afzonderlijke bestanddelen en hun concurrerende bindende partners³. BiCAP is gebaseerd op de aanpassing van een fluorescentie eiwit complementatie assay genaamd BiFC⁶. Bestaande methoden, met inbegrip van BiFC en nabijheid afbinding testen, uitgebreid om te visualiseren en te kwantificeren eiwitinteractie in levende cellen⁷zijn gebruikt...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
LR Clonase II Plus enzyme	Thermo Fisher Scientific	12538120	Recombinase enzym vereist voor Gateway-klonen (Stap 1) in pDEST BiFC bestemmingsvectoren
Proteinase K, recombinant, PCR-kwaliteit	Thermo Fisher Scientific	EO0491
14 mL ronde bodem polypropyleen buis	Corning	352059
Ampicilline	Roche Diagnostics Australia	10835242001	Voorraad oplossing bereid op 100 μg/mL in gedistilleerd water.
Miniprep kit	Promega Corporation	A1330
Maxiprep kit	Life Technologies Australia	K2100-07
DMEM	Gibco	11995-073
FBS	Life Technologies Australia	10099-141
Penicilline/Streptomycine	Life Technologies Australia	15070-063
jetPRIME transfectie buffer	Polyplus	114-15
jetPRIME transfectie reagens	Polyplus	114-15
PhosSTOP (fosfatase remmer)	Sigma-Aldrich	4906837001
cOmplete, Mini, EDTA-vrije Protease remmer cocktail	Roche	11873580001
Cell Scraper	Sarstedt	83.1832
GFP-Trap_A	Chromotek Gmbh	gta-100	GFP nanobody gekoppeld aan agarose kralen
N-terminaal GFP monoklonaal antilichaam	Covance	MMS-118P	Zal de V1 tag detecteren binnen de BiFC vectoren
C-terminaal GFP monoklonaal antilichaam	Roche	11814460001	Zal de V2 tag detecteren binnen de BiFC vectoren
Stapel buffer	Invitrogen	NP0008	Aangevuld met 1 mL β-mercaptoethanol.
Sequencing grade gemodificeerd trypsine	Promega Corporation	V5117h
LoBind microcentrifuge buisjes	Point of Care Diagnostics	0030 108 116
Iodoacetamide	Sigma-Aldrich	I1149-5G	Bereidt op 5 mg/mL in ultrapuur water
Trifluorazijnzuur - Sequanal Grade	Thermo Fisher	10628494
3M Empore vaste fase extractie C18 schijven (octadecyl) - 4,7 cm	Thermo Fisher	14-386-2	Om stage tips te bereiden, snij 1 mm schijven met een geschikte maat gatpons. Alternatief, kunnen ook voorbereide stage tips worden gekocht, zie hieronder.
C18 Stage Tips, 10 µL bed	Thermo Fisher	87782
Forminezuur OPTIMA voor LC/MS graad 50mL	Thermo Fisher	FSBA117-50
1,9 μm C18 ReproSil deeltjes	Dr. Maisch GmbH	r119.aq.	Stationaire fase deeltjes
Acetonitril OPTIMA LC/MS graad	Thermo Fisher	FSBA955-4
Easy-nLC HPLC	Thermo Fisher
LTQ Orbitrap Velos Pro	Thermo Fisher
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Nionogene detergent (100%)
DH5α cellen	Thermo Fisher		Heat-shock-competente cellen