Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Profilering van vetzuur 13C Isotopologue geeft inzicht in de trofische Carbon overdracht en lipide metabolisme van ongewervelde consumenten

8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/57110

⸱

17 april 2018

 ,  ,  , 
1Ecology, Institute of Biology, Humboldt-Universität zu Berlin

In dit artikel

Samenvatting

Het vetzuur trofische marker aanpak, dat wil zeggen, de assimilatie van vetzuren als hele molecuul en transfer in consument weefsel met geen of een kleine wijziging, wordt gehinderd door lacunes in de kennis in de vetzuurstofwisseling van kleine bodem-ongewervelde dieren. Isotopologue profilering wordt geleverd als een waardevol instrument te ontwarren trofische interacties.

Samenvatting

Vetzuren (FAs) zijn nuttig biomarkers in voedselweb ecologie, omdat ze meestal als een volledige molecuul geassimileerd en naar weefsel van de consument met klein of geen wijziging verplaatst, waardoor de voeding routeren tussen verschillende trofische niveaus. De FA trofische marker aanpak wordt echter nog steeds belemmerd door de beperkte kennis in lipide metabolisme van de fauna van de bodem. Deze studie gebruikt volledig gelabelde palmitinezuur (13C16:0, 99% van het Atoom) als een tracer in vetzuur metabolisme trajecten van twee brede bodem Collembola, Protaphorura fimata en Heteromurus nitidus. Om te onderzoeken het lot en metabole wijzigingen van deze voorloper, wordt een methode van isotopologue profilering gepresenteerd, wordt uitgevoerd door de Spectrometrie van de massa, met behulp van enkele ion monitoring. Bovendien, de upstream laboratorium experiment voeding wordt beschreven, evenals de extractie en de methylering van dominante lipide breuken (neutrale lipiden, fosfolipiden) en de verwante formule en berekeningen. Isotopologue profileren niet alleen opbrengst de algehele 13C verrijking in vetzuren is afgeleid van het 13C-label voorloper maar produceert ook het patroon van isotopologues meer dan de massa van de bovenliggende ion (dat wil zeggen, het molecuulion FA M+) van elk label FA door één of meer massa eenheden (M+ 1M+ 2M+ 3, enz.). Deze kennis kan conclusies over de verhouding van het dieet routering voor een volledig verbruikt FA in vergelijking met DOVO biosynthese. De profilering van de isotopologue wordt voorgesteld als een nuttig instrument voor de beoordeling van de vetzuurstofwisseling in bodem dieren te ontwarren trofische interacties.

Inleiding

In een cryptische habitat zoals bodem, trofische relaties zijn moeilijk te pakken en verder worden beperkt door de geringe omvang van de fauna. Het laatste decennium heeft gezien van vooruitgang in de biochemische ecologie, met name in het gebruik van vetzuren als biomarkers voor het definiëren van de strategieën van de voeding van de fauna van de bodem onder veld voorwaarden1,2,3. Dit is gebaseerd op het feit dat de vetzuren uit bronnen kunnen worden opgenomen in het weefsel van de consument als hele moleculen, een proces genoemd dieet routering4. Overdracht van vetzuren is gemeld over drie trofische niveaus, dat wil zeggen, van schimmels aan nematoden Collembola5. Onlangs, de roofzuchtige fauna werd beschouwd als6,7 en de eerste recensies over vetzuren als trofische markeringen in bodem voedsel webs zijn gepubliceerde8,9.

Meer gedetailleerde informatie over trofische interacties wordt bereikt door stabiele isotoop vetzuur sonderen (FA-SIP). De bepaling van 13C /12C verhoudingen in vetzuren in de voeding en consumenten kan toeschrijven binaire koppelingen en schatten de bijbehorende koolstof-stroom, en heeft gewerkt in terrestrische, zoetwater en mariene voedsel webs10,11 ,12,13. Het uitgangspunt is dat dieet gerouteerde vetzuren geen enzymatische processen gelden; daarom hun 13C signaal, dat wil zeggen, de 13C /12C verhouding van het vetzuur, de consument is vergelijkbaar met die in de voeding1. Een geleidelijke uitputting van de handtekening van de 13C in de voedselketen is echter gemeld in aquatische systemen, waardoor het belemmeren van brede toepassing van FA-SIP in trofische studies14,15,16. Kennis in het lipide-metabolisme in de meeste ongewervelden in terrestrische levensmiddelen webs is bovendien nog beperkt.

Een goed begrip van de lipide metabolisme trajecten in consumenten is essentieel voor het gebruik van trofische marker vetzuren als middel voor de bepaling van de stroom van de kwantitatieve koolstof in voedselweb ecologie. Met dit in gedachten, 13C-isotopologue profilering, welke in principe kan worden toegepast voor onderzoek naar het metabolisme van de koolstof van een biologisch systeem17, is een veelbelovende methode. Na de invoering van een 13C-gelabelde koolstof substraat, de verdeling van de 13C in het metabolische netwerk is sinds de gegenereerde stofwisselingsproducten in de show van de consument een specifieke isotopologue distributie traceerbaar. Dit kan worden geëvalueerd door kwantitatieve nucleaire metabole resonantie spectroscopie18,19 of massaspectrometrie20,21, met de laatste favoriet in biologische monsters met lage biomassa als gevolg van de hogere gevoeligheid.

Hoewel isotopologue profilering is met succes toegepast op aminozuren en verstrekt inzicht in het metabolisme van koolstof in vivo bacteriële pathogenen17,22,23, de implementatie ervan in vetzuren zuren is achtergebleven. De eerste gedetailleerde analyse over het lot van een stabiele isotoop geëtiketteerd voorloper vetzuur, haar dieet routering of afbraak via β-oxidatie, in de bodem-ongewervelde consumenten, werd onlangs uitgevoerd door Menzel et al. 24. hier, de methodologische basis voor opneming experimenten met 13C gemerkte vetzuren gevolgd door isotopologue analyse van belangrijke nakomelingen in frequente bodem-ongewervelde dieren, de Collembola, worden verstrekt. Deze microarthropods zijn een goed Modelgroep als zij belangrijke onderdelen van de bodem voedselweb en zijn goed onderzocht voor hun trofische marker vetzuren8,25 vormen.

Een goed begrip van de lipide metabolisme trajecten in consumenten is essentieel voor het gebruik van trofische marker vetzuren als middel voor de bepaling van de stroom van de kwantitatieve koolstof in voedselweb ecologie. Dit protocol geeft de ontwerp en instellen voor een laboratorium voederen van experiment, en de biochemische procedures voor extractie en methylatie van dominante lipiden breuken (neutrale lipiden, fosfolipiden) van de Collembola. Het toont hoe de samenstelling van de isotopologue van vetzuren wordt geanalyseerd door de Spectrometrie van de massa en beschrijft de verwante formule en berekeningen. Deze procedure resulteert in: (i) de ratio's van isotopologues meer dan de massa van de bovenliggende ion (dat wil zeggen, het molecuulion vetzuur M+) door een of meer massa-eenheden (M+ 1M+ 2M+ 3, enz.) en (ii) de totale 13 C verrijking in vetzuren is afgeleid van het 13C-gelabelde voorloper. Hoewel gebruikt voor Collembola, kan deze aanpak in het algemeen worden toegepast op enige andere interactie van predator en prooi op de vooronderstelling dat deze culturable in voldoende hoeveelheid onder gecontroleerde omstandigheden om een succesvolle label opname en de daaropvolgende verificatie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Het beschreven protocol valt niet onder de bevoegdheid van Animal ethiek. Echter, wanneer mensen de beschreven protocollen bij hogere dieren passen, zorgen dat de institutionele dier-ethische commissie goedgekeurd het protocol voor dierlijk behandeling.

1. teelt van dieren

Opmerking: Al uitgelegd experimentele stappen zijn gebaseerd op gevestigde protocollen26,27,28. Biotests in het laboratorium moet een continue aanvoer van gemakkelijk culturable organismen. Hier, de Collembola soorten Protaphorura fimata (Gisin, 1952) en Hetermurus nitidus (Templeton, 1835) gebruikt. Beide soorten zijn eenvoudig te onderhouden als productieve laboratorium culturen gevoed met bakkersgist.

  1. In kunststof microkosmos met strakke montage deksels (diameter 7 cm, hoogte 4,5 cm), voeg een mengsel van actieve kool, gips, en gedestilleerd water om een zeer vochtige fokken substraat (figuur 1A).
    1. Bij de voorbereiding microkosmos mix genoeg substraat, bijvoorbeeld voor 10 microkosmos in een batch. Mix-9 delen van gips van Parijs (225 g) en 1 deel van droge actieve kool (25 g) samen in een pot van gips, voeg zorgvuldig ongeveer 10 delen gedistilleerd water (250 mL) en laat zitten voor 5 minuten zonder roeren bij kamertemperatuur.
    2. Roer met een lepel lab bij matige snelheid in richting van de klok om luchtbellen te voorkomen totdat een dikke soeperig consistentie is bereikt. Giet onmiddellijk in de microkosmos tot een hoogte van ongeveer 1 cm.
    3. Het gips glad door zacht te onttrekken op de Bank en zwenken. Merk op dat de gaten (willekeurige producten van luchtbellen) en furrows (actief toegevoegd met een steriele spatel) vruchtbare Collembola om er eieren te leggen kunnen stimuleren. Deze studie vermeden gaten en furrows in het voordeel van het hebben van dezelfde reproduceerbare voorwaarden. Figuur 1B kampt echter voor demonstratiedoeleinden enkele gaten.
    4. Laten drogen voor ongeveer 1-2 dagen bij kamertemperatuur; incubatie bij 60 ° C kan die tijd verminderen tot 1-2 h.
    5. Bevochtig microkosmos vóór gebruik door leidingwater met een pipet toe te voegen totdat het substraat licht vochtige is. Microkosmos vochtig houden door regelmatig toe te voegen gedestilleerd water zoals Collembola hebben een zachte schubbenlaag en is gevoelig voor uitdroging.
  2. Collembola eenvoudig overzetten naar de honk van de pleister met behulp van een eenvoudige zuig buis, dat wil zeggen, een lange silicon buis ongeveer 25 cm lang met een pipet tip voorzien met een kleine maaswijdte voorkomt zuiging van dieren in de buis. U kunt ook overbrengen dieren doordat ze te houden op de borstels voor een kleine borstel.
  3. Transfer (zie stap 1.2) 30 vers uitgekomen Collembola in nieuwe microkosmos en bieden gekorrelde droge bakkersgist als voedsel (over een mes-tip) (figuur 1B); ten minste twee keer per week te verlengen. Plan drie zelfstandige repliceert per bemonstering dag; in deze studiedagen 0 - 7 en 14. Incubeer bij 15 ° C in het donker. Het handhaven van dat een constante temperatuur is essentieel, zoals vetzuren worden gewijzigd door dierlijke metabolisme voldoen aan de eisen voor membraan vloeibaarheid.
  4. Feed Collembola met bakkersgist voor vier weken vóór het begin van de blootstelling experimenten om een homogene 13C /12C signaal en patroon in vetzuren. Een zuig-buis of een borstel te verwijderen alle eieren (Figuur 1 c), fecale pellets, en exuviae regelmatig als dieren kunnen voeden op hen daardoor veranderen hun lipide-profiel.

figure-protocol-1
Figuur 1: teelt van Collembola. (A) microkosmos gevuld met fokken substraat, een gedroogde mengsel van gips, actieve kool en gedestilleerd water. (B) en (C) representatief exemplaar van een cultuur van de Protaphorura fimata ; Let op de kleine klompjes van droge bakkersgist gebruikt als de bron van voedsel en ook als gaten in de fok substraat (zwarte pijl) (B) evenals twee eieren (witte pijl) (C). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

2. de etikettering van voeding, oogst en Sample Handling

  1. Etikettering
    1. Vier weken na de oprichting van de Collembola culturen, plaatst u elke 30 personen in nieuwe microkosmos en Incubeer bij 15 ° C in het donker.
    2. Het label pols voeren door voederen bakkersgist met een volledig 13C-gelabeld palmitinezuur (13C16:0, 99% van het Atoom) door het mengen van 13C-gelabeld palmitinezuur met bakkersgist met een spatel op een verhouding 0.5:1, bijvoorbeeld, 5 g 13 C16:0 en 10 g droge gist baker's. Plaats over een mes-tip over elke microkosmos.
    3. Na 6 uur, deze label voedsel met volledig labelloze bakkersgist vervangen door.
  2. Verdere teelt
    1. In de loop van het experiment verlengen de gist dieet om de drie dagen en voeg bedragen hoger zijn dan wat Collembola binnen deze termijn zal verbruiken. Bovenal gebruiken een zuignap buis of borstel te verwijderen van Collembolan eieren, fecale pellets en exuviae regelmatig opgeven, zodat de exclusieve voeding van de dieren op het verstrekte voedsel.
  3. Oogst
    1. Monster microkosmos destructief dagelijks tot dag 7. Dan op dag 14, verzamelen drie onafhankelijke wordt gerepliceerd op elk tijdstip van monsterneming; verschillende bemonsteringstijdstippen zijn mogelijk.
    2. 10 mL glazen buizen voorzien van Teflon bekleed schroefdoppen, één voor elk monster voor te bereiden. Vooraf reinigen van deze buizen in een glaswerk wasmachine en spoel tweemaal met gedeïoniseerd water daarna. Tot slot, voor het verwijderen van alle sporen van hydrofobe verontreinigende stoffen wassen tweemaal door toevoeging van 2 mL chloroform (HPLC-kwaliteit), vortex ongeveer en zich te ontdoen van het oplosmiddel.
    3. Voor controlemonsters (dag 0), 3 30 niet zichtbare Collembola uit de pre culturen als dag 0 monsters te nemen.
    4. Voor blootgestelde monsters (dag 1 en verder), nemen voor de dagelijkse monsters in elk geval 3 30 Collembola uit de culturen gearchiveerd belichte gevoed met de mix van 13C-gelabeld palmitinezuur en bakkersgist.
    5. Een ultra-microbalans Collembola vers gewicht te registreren. Het overbrengen van dieren met behulp van een exhauster of borstel op passende schaal-pannen. Zorgen voor eenvoudige bediening van Collembola tijdens het gewicht in de schaal-pannen, schok-cool dieren vóór (-80 ° C gedurende 2 uur). U kunt ook kan een CO2 stroom gedurende 10 minuten veilig stun dieren.
  4. Direct na weging gestoken dieren uit de schaal-pannen zorgvuldig 10 mL glazen test-buizen. Vul de buizen met 1 mL methanol (HPLC-kwaliteit) en opslag bij-20 ° C tot analyse.
    Opmerking: Vanaf deze stap, vermijden monster behandeling met kunststof apparatuur zoals organische oplosmiddelen zijn betrokken; in plaats daarvan gebruiken dispensers en pipetten die geschikt voor oplosmiddelen alsmede glas schepen zijn.

3. lipide extractie uit dierlijk weefsel en Methanolysis

  1. Bereiden drie glazen test-buizen (uitgerust met Teflon bekleed schroefdoppen) per batch met slechts 1 mL methanol als lege waarden. Nog belangrijker is, toevoegen of het overdragen van elk oplosmiddel in dit protocol alleen gebruikt door glas pipetten of chloroform/methanol gespoeld oplosmiddel-resistente dispensers.
  2. Aan het begin van het lipide-extractieproces, verminderen de methanol toegepast voor de opslag (of blanking) door verdamping; een compacte benchtop rotatie vacuüm Concentrator (RVC) voorzien van een vacuüm pomp en een koude val wordt aanbevolen. Breng de open buizen in de RVC en verdampen tot droog bij 50 ° C en vacuüm druk van 200 hPa voor 20 min.
  3. Voeg 5 mL van de enkelfasige extractievloeistof (chloroform/methanol/0.05 M fosfaat buffer 1:2:0.8, pH 7.4) aan elk monster (inclusief spaties) en uittreksel Collembolan lipiden bij kamertemperatuur door 's nachts schudden (~ 200 rpm).
  4. Het oplosmiddel overbrengen naar nieuwe buizen en opnieuw uitpakken monsters door schudden gedurende 3 uur met een extra 2,5 mL extractievloeistof. Na dat, het combineren van uittreksels uit beide stappen; het gebruik van glas die Pasteur pipettes wordt aanbevolen. Voeg 0.8 mL chloroform en 0,8 mL gedestilleerd water en dan mengen samen en centrifugeer bij 2.000 g bij 20 ° C gedurende 5 minuten. Tot slot, toe te staan voor 5 min. voor de scheiding van waterige en chloroform monsters fasen.
  5. P.a. vetzuur patroon, de totale cellulaire lipiden van Collembola in neutrale lipide, glycolipid en fosfolipide breuken te verdelen.
    1. Voor elk monster, bereiden een zure kolom van silica (commerciële kolom met 0,5 g kiezelzuur, mesh formaat van 100-200 µm, Zie Tabel van materialen) door toevoeging van 1 mL chloroform (conditionering). Als u wilt dit proces versnellen, mount de kolommen op een vacuüm blok zo vaak gebruikt in de chromatografie voor vaste fase extractie. Gebruik geen nylon naalden; gebruik RVS boven de buizen.
    2. Na de chloroform die voor de conditionering gebruikt heeft doorgegeven door de kolom overdracht de volledige lagere chloroformfase van elk monster aan een afzonderlijke kolom. Om deze procedure te vereenvoudigen, kan de bovenste waterfase vooraf worden verwijderd. Gebruik Pasteur pipetten van glas, echter zorgen dat de kolommen niet doen uitdrogen.
    3. Achtereenvolgens Elueer lipide breuken met 5 mL chloroform (inclusief neutrale lipide vetzuren, NLFAs), 10 mL aceton (Glycolipiden - niet geanalyseerd in dit project) en 5 mL van methanol (inclusief fosfolipide vetzuren, PLFAs). Verzamelen van elke fractie in individuele glas schepen.
    4. Aan het einde van de extractie, door de chloroform (NLFAs) en de methanol (PLFAs) via verdamping in een RVC te verminderen. De open buizen overbrengen in de RVC en verdampen tot droog, ~ 90 min bij 60 ° C en een vacuüm voor 24 hPa.
  6. Start verzeping van lipiden (NLFA en PLFA breuken) volgens het protocol Welch (1991) €29 met toevoeging van 1 mL van de oplossing van natriumhydroxide-methanol (45 g zuivere natriumhydroxide, 150 mL methanol en 150 mL gedestilleerd water) en Incubeer bij 100 ° C gedurende 30 minuten in een waterbad. Koel het monster in het ijskoude water gedurende 2 minuten, dan de monsters weer op de bank zetten en blijven werken bij kamertemperatuur.
  7. De interne standaard toevoegen aan elk monster met inbegrip van de spaties. Kies een vetzuur niet gebruikelijk in de experimentele organismen; ook kunt een verzadigd vetzuur verlies te minimaliseren door splijten en selecteer een molecule met tussenliggende ketenlengte. Voor vele doeleinden, de oneven nonadecanoic zuur (19:0) werkt goed. Dus, Voeg 30 µL van een oplossing van 0,74 mM in isooctane. De exacte hoeveelheid is zeer belangrijk - moet de nauwkeurigheid van uw Pipetteer met een microbalans tevoren hebt gecontroleerd.
  8. Voeg 2 mL zoutzuur-methanol (mix 325 mL 6.0 N zoutzuur met 275 mL methanol), Incubeer bij 80 ° C gedurende 10 minuten in een waterbad en cool snel op ijs gedurende 2 minuten. Deze stap is tijd- en temperatuurdisplays gevoelig; 80 ± 1 ° C en 10 ± 1 min. Check met hoeveel monsters kunnen gaan in het waterbad in één keer gebruiken om te houden van de 80 ° C.
    Opmerking: Deze procedure resulteert in vetzuren methyl esters (FAMEs), dat wil zeggen, vetzuur analyten gestabiliseerd voor verdamping in gaschromatografie.
  9. Tot slot Voeg 1,25 mL hexaan/methyl-tertiair-butylether (1:1) en rock gedurende 10 min, dan Centrifugeer bij 2.000 g gedurende 5 min. zachtjes Verwijder de onderste fase en houd de bovenste fase uit FAMEs bestaat; glas die Pasteur pipettes gebruiken. Voeg 3 mL van waterige natriumhydroxide-oplossing (10.8 g NaOH ontbonden in 900 mL gedestilleerd water) voor een wassen stap.
    1. Rock en centrifuge opnieuw.
  10. Neem de volledige bovenste lipide-bevattende fase met behulp van een glazen pipet van Pasteur en overdracht aan een gaschromatografie monster flesje voorzien van een Teflon tussenschot. Vermijd met inbegrip van zelfs kleine bedragen van de waterige fase, omdat dit leiden problemen met de GC-meting tot zal. Flacon kapselen en bewaren bij-20 ° C tot analyse.

4. kwantificering van vetzuren door GC-FID

  1. Gaschromatografie gebruiken voor het identificeren en kwantificeren van de FAMEs in de NFLA en PLFA fracties van lipiden Collembola (dier). Een gaschromatograaf (GC) uitgerust met een vlamionisatiedetector (FID) is een gevestigde en bewezen apparatuur-30.
  2. Vergelijk voor identificatie van FAMEs, retentietijd van pieken in de steekproef die in een standaard roem. Dit zijn de kwalitatieve of kwantitatieve standaard mengsel van sleutel FAMEs die een verscheidenheid van voedingsmiddelen en organismen.
  3. Dienst FAME standaard mengsels bestaande uit vertegenwoordiger FAs voor de onderzochte organisme groep en experimentele dieet. In Collembola zijn deze vetzuren kenmerkend voor eukaryoten, bijvoorbeeld, lange-keten meervoudig onverzadigde vetzuren zoals arachidonzuur (20:4ω6). Als dienst van gist als dieet zijn dit schimmel markeringen zoals linolzuur (18:2ω6). Een goede keuze is de zogenaamde FAME mix, bestaande uit 37 verschillende vetzuren frequent in dier, schimmel en plantaardig materiaal, en de bacteriële acid methylester (BAME) mengen (Zie Tabel van materialen).
  4. Instellen als u wilt uitvoeren de monsters op de GC-FID, een reeks met de respectieve software van het instrument. Raadpleeg de handleiding van de fabrikant voor instructies. De reeks begint met de externe standaard mengsels (bijvoorbeeld roem & BAME mix), gevolgd door de monsters. Merk op dat er een retentie timeshift, dat wil zeggen, een lichte vertraging in de tijd van de elutie van de vetzuren uit de GC-kolom met elk punt, terwijl het runnen van monsters! Ofwel omvatten een standaard elke 10th uitvoert in de volgorde van de steekproef of retentietijd vergrendeling voor palmitinezuur (16:0).
  5. GC instellingen afhankelijk van het instrument passen. Het volgende programma wordt voorgesteld voor een capillaire kolom van hoge prestaties (HP) (25 m x 0,2 mm i.d., film dikte 0,33 µm. Set geïnjecteerde volume aan 1 µL in splitless modus en het gebruik van waterstof als draaggas. Dienst een temperatuur programma begin bij 50 ° C (gedurende 1 min) en verhogen door 25 ° C min-1 tot 175 ° C, gevolgd door 3 ° C min-1 tot 230 ° C (gehouden voor 5,7 min).
  6. Bereken de nmol vetzuur per gram verse (droge) gewicht van organismen met behulp van het antwoord verkregen door FID voor elke FAME de bekende bedragen voor de respectieve vetzuur met de volgende formule toe te passen:
    figure-protocol-2
    EenFAME: piekoppervlakte van de respectieve FAME in de steekproef
    MW,FM: molecuulgewicht van de respectieve FAME in µg/µmol
    CIS: concentratie van de interne standaard in µg
    EenIS: piekoppervlakte van de interne standaard
    mCol: verse (droge) gewicht van respectieve Collembola monster in g
    1000: conversiefactor van µmol aan nmol
    cBW: concentratie van de respectieve FAAM in het gemiddelde van de corresponderende lege waarden in nmol

5. 13C analyse per Isotopologue profilering

  1. Gebruik een GC-systeem gekoppeld aan een Mass Selective Detector (MS) is voorzien van een elektron ionisatie (EI) bron voor isotopologue vastberadenheid.
    1. Gebruik een polar capillaire kolom (bijvoorbeeld DB 23, CP-Sil 88) zoals hierdoor verder de scheiding van onverzadigde vetzuren zelfs met dezelfde nummers van dubbele bindingen. De keuze van de GC-kolom is essentieel voor de resultaten, zoals het bepaalt de goede vertegenwoordiging van het molecuul-ion in de vetzuren.
    2. Voor een kolom DB 23 (60 m x 0,25 mm i.d., film dikte 0,15 µm), start de oventemperatuur bij 130 ° C en verhogen met 6,5 ° C/min. tot 170 ° C. Volg met een toename van 3 ° C/min naar 203 ° C en houd voor 1.9 min. volgen met een stijging van 40 ° C/min. tot 230 ° C ingedrukt voor 8.3 min. Set overdracht lijn temperatuur tot 280 ° C. Nogmaals, aanpassen GC-methode naar het instrument.
    3. Kwantitatieve normen bestaande uit bekende hoeveelheden van FAMEs voor alle vetzuren gebruiken voor 13C opneming worden onderzocht. Zet deze normen aan het begin en einde van de reeks van elk monster lopen. Neem de retentietijden van de vetzuren van belang van deze normen.
    4. Meten van monsters van de experimenten die altijd beginnen met de labelloze monsters, en de gelabelde sondes daarna. Een splitsingsverhouding daartoe de monsterconcentraties, b.v. 1:12.5.If beschikbaar voor het instrument gelden, toepassen van een afgeboekt met helium na elk monster lopen naar duidelijk uit de kolom van de resterende analyten.
    5. Toepassing retentietijd vergrendeling aan de GC-MS methode zodat de overname van de SIM geen van de verschuiving last en er reproduceerbaar analyt retentietijden is.
  2. 13C opneming in het molecuulion van vetzuren door de GC/EI-MS met behulp van de geselecteerde ion monitoring (SIM) modus van het instrument te bepalen. Bediening in de SIM-modus kunt detecteren van specifieke analyten met verhoogde gevoeligheid ten opzichte van de volledige scanmodus.
    1. Uitvoeren van een eerste scan eerst om te zien wat aanwezig is en voer vervolgens de SIM op passende ionen. Gegevens op moleculaire massa's van belang te verwerven door het selecteren van m/z scan windows (SIM-groepen) omvat de tijd van de chromatografische piek van het respectieve vetzuur. Normaal gesproken op monitor twee tot vier ionen per analyt en tijd venster.
    2. Teneinde de gevoeligheid, de massale scanfrequentie aanpassen en wonen tijden (de tijd kijken naar elke massa). De beste kwaliteit gegevens worden verkregen op de laagst mogelijke snelheid, en een over het algemeen regel in SIM is 8 tot 12 scans boven de piek van de analyt. Een proxy voor instrumentele instellingen is een gemiddelde Nadruktijd per massa van 9 ms, een cyclustijd van 6 s en een scan tijd van 175 ms cyle-1.
    3. Het detecteren van het molecuulion (M+) van de respectieve vetzuur en haar isotopologues (M+ 1, M+ 2 enzovoort). Zie voor voorbeelden, vertegenwoordiger resultaten.
    4. Record de overvloed van elk fragment ion (isotopologue). Merk op dat de overvloed van de molecule ion en haar isotopologues relatief laag is en de kwaliteit van kwantificering is sterk afhankelijk van de prestaties van het systeem van MS. Voer een deuntje vóór het begin van een reeks van grote steekproef (experiment) en reinigen van de ion-bron, indien nodig.
      Opmerking: In de eerste plaats deze gegevens levert de totale 13C verrijking van elke vetzuren door de verbruikte voorloper (hier 16:0).
    5. Gebruik het aandeel van de samenstelling van de isotoop van gelabelde vetzuren uit hun ongemarkeerd tegenhangers te wijzen de trofische koolstof flux. Gebruik de atoom %-formule in stap 6.1 voor de berekening van het percentage van de gelabelde koolstof (Atoom procent, Atoom %) in de respectieve vetzuur. Vergelijk het percentage voor 13C in vetzuren van Collembola tussen gelabelde (dag 1 en hoger) en labelloze dieren (dag 0) als relatieve indicatie voor de stroom van de 13C uit voeding naar de consument.
    6. Toewijzen van de positie van 13C opneming in de keten vetzuren. Op basis van de verdeling van de isotopologues ontwarren de dieet routering van de hele duidelijke tracer vetzuur (hier 16:0) uit de keten rek door lipide metabolisme. Terwijl de assimilatie van de hele markering molecule verhoogt de overvloed van isotopologues aan de bovenliggende ion (M+), bijvoorbeeld, M+ 15, M+16, met ketting rek door het gebruik van 13C geëtiketteerd C2 fragmenten (13C acetyl-CoA) de isotopologues dicht bij het molecuulion krijgen vaker.

6. berekening van 13C verrijking

  1. Volgens de verdeling van de isotopologues, het totale percentage van de gelabelde koolstof (in % van het Atoom) te berekenen in de respectieve vetzuur met behulp van de volgende relatie: atoom % (verhouding 13C isotopologue opgenomen) = x (frequentie respectieve isotopologue)
    Dit wordt berekend na Kuppardt et al. 31 als:figure-protocol-3
    waarbij N staat voor het aantal koolstof-atomen in de vetzuur, J is het aantal 13C isotopen, eenM + J is de overvloed van de respectieve isotopologue, en eenT de totale overvloed van alle isotopologues.
  2. Voor de berekening, de piek gebied waarden optellen van het molecuulion (M+) van de respectieve FA en alle isotopologues (M+ 1, M+ 2, enzovoort), door SIM-MS-analyse wordt gedetecteerd en ingesteld op 100% relatieve overvloed. Berekening van dat het gedeelte van elke gedetecteerde isotopologue is gemakkelijk door het volgen van de regel van drie.
  3. Aftrekken niet-gelabelde dag 0 waarde van het besturingselement (natuurlijke 13C achtergrond) van de experimentele waarden om definitieve gegevens alleen teruggevoerd tot de uitgevoerde externe 13C-labeling te verkrijgen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Verse gewicht en lipide inhoud van Collembola
In de loop van de beschreven experiment veranderde de inhoud van NLFAs en PLFAs niet aanzienlijk na verloop van tijd, overwegende dat het verse gewicht van specimens licht maar niet aanzienlijk24 gestegen. Beide parameters geven een goed niveau van fysieke fitheid van de specimens van de Collembola. Wees ervan bewust te onderzoeken Collembola van verse gewicht en lipide inhoud gedurende het gehele ex...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Isotopologue profielen

Een gedetailleerde analyse van de kwantitatieve aspecten in 13C distributie in FAs moet randtechnologie toewijzen van koolstof partitioneren in voedsel webs. Het huidige werk werkzaam isotopologue profielen om te beoordelen van de 13C /12C verhoudingen in gemeenschappelijke FA biomarkers voor tropic interacties. Deze methode is een gevestigde aminozuur p.a. door vloeistofchromatografie (LC-MS) en onderzoeken van het metab...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Dankbetuigingen

De financiële steun van R. Menzel en L. Ruess door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (RU RU780/11-1) wordt dankbaar erkend. R. Nehring werd gefinancierd door RU 780/10-1. Tot slot zijn wij zeer dankbaar aan Dr Hazel Ruvimbo Maboreke voor proeflezen van onze manuscript.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
neoLab-Round jarsneoLab2-150669 x 40 mm, 10 pacs/pack
Charcoal activatedCarl RothX865.1p.a., powder, CAS No. 7440-44-0
Alabaster DentalRÖHRICH-GIPSE---http://www.roehrich-gipse.de/dentalgipse.php
ChloroformCarl Roth7331.1HPLC ≥ 99,9 %
MethanolCarl RothP717.1HPLC ≥ 99,9 %
HexanCarl Roth7339.1HPLC ≥ 98 %
tert-Butyl methyl ether (MTBE)Carl RothT175.1HPLC ≥ 99,5 %
AcetonCarl Roth7328.2HPLC ≥ 99,9 %
NaOHCarl Roth6771.1p.a. ≥99 %, in pellets
di-NatriumhydrogenphosphatCarl RothP030.1p.a. ≥99 %, water free
Na-dihydrogenphosphat DihydratCarl RothT879.1p.a. ≥99 %
Hypochloric acid (6 N)VWR International26,115,000AVS TITRINORM vol. solution
Bond Elut (Columns)Agilent Tech.14102037HF Bond Elut-SI, 500 mg, 3 mL, 50/PK
Präparatengläser DuranGlasgerätebau Ochs135215Ø 16 x 100 mm, plus screw cap with handy knurl and integrated PTFE/silicone gasket
Supelco 37 Component FAME MixSigma-Aldrich47885-U Supelco10 mg/mL in methylene chloride, analytical standard
FlowMeshCarl Roth2796.1Polypropylene mesh, approximately 0.3 mm thick, with 1 mm strand spacing
Bacterial Acid Methyl Ester (BAME) MixSigma-Aldrich47080-U Supelco10 mg/mL in methyl caproate, analytical standard
Methyl nonadecanoateSigma-Aldrich74208analytical standard ≥ 98.0 %
Hexadecanoic acid-1-13C (Palmitic)Larodan Fine Chemicals78-1600GC ≥ 98.0 % (13C: 99.0 %)
RVC 2-25 CDplusMartin Christ Gefrier-trocknungsanlagenCompact benchtop midi concentrator
Alpha 2-4 LDplusMartin Christ Gefrier-trocknungsanlagenDrying manifold
MZ 2C NTVacuubrand GMBHVacuum pump
Roto-Shake GenieScientific IndustriesCombined rocking and rotating device
XP64 Micro ComparatorMettler ToledoSuper high precision balance
GC-System 7890AAgilent Tech.Gas chromatograph
7000 GC/MS Triple QuadAgilent Tech.Triple Quad mass spectrometer
7683B Series InjectorAgilent Tech.Sample injector
Heraeus Multifuge 3SR+Thermo ScientificCentrifuge with 10 ml tube rotor

Referenties

  1. Ruess, L., et al. Application of lipid analysis to understand trophic interactions in soil. Ecology. 86 (8), 2075-2082 (2005).
  2. Ruess, L., et al. Lipid composition of Collembola and their food resources in deciduous forest stands - Implications for feeding strategies. Soil Biology and Biochemistry. 39 (8), 1990-2000 (1990).
  3. Chamberlain, P. M., Bull, I. D., Black, H. I. J., Ineson, P., Evershed, R. P. Fatty acid composition and change in Collembola fed differing diets: identification of trophic biomarkers. Soil Biology and Biochemistry. 37 (9), 1608-1624 (2005).
  4. Stott, A. W., Davies, E., Evershed, R. P., Tuross, N. Monitoring the routing of dietary and biosynthesised lipids through compound-specific stable isotope (delta C-13) measurements at natural abundance. Naturwissenschaften. 84 (2), 82-86 (1997).
  5. Ruess, L., Haggblom, M. M., Langel, R., Scheu, S. Nitrogen isotope ratios and fatty acid composition as indicators of animal diets in belowground systems. Oecologia. 139 (3), 336-346 (2004).
  6. Pollierer, M. M., Scheu, S., Haubert, D. Taking it to the next level: Trophic transfer of marker fatty acids from basal resource to predators. Soil Biology and Biochemistry. 42 (6), 919-925 (2010).
  7. Ferlian, O., Scheu, S., Pollierer, M. M. Trophic interactions in centipedes (Chilopoda, Myriapoda) as indicated by fatty acid patterns: Variations with life stage, forest age and season. Soil Biology and Biochemistry. 52, 33-42 (2012).
  8. Ruess, L., Chamberlain, P. M. The fat that matters: Soil food web analysis using fatty acids and their carbon stable isotope signature. Soil Biology and Biochemistry. 42 (11), 1898-1910 (2010).
  9. Traugott, M., Kamenova, S., Ruess, L., Seeber, J., Plantegenest, M. Empirically characterising trophic networks: What emerging DNA-based methods, stable isotope and fatty acid analyses can offer. Adv Ecol Res. 49, 177-224 (2013).
  10. Hammer, B. T., Fogel, M. L., Hoering, T. C. Stable carbon isotope ratios of fatty acids in seagrass and redhead ducks. Chemical Geology. 152 (1-2), 29-41 (1998).
  11. Budge, S. M., Iverson, S. J., Koopman, H. N. Studying trophic ecology in marine ecosystems using fatty acids: A primer on analysis and interpretation. Marine Mammal Science. 22 (4), 759-801 (2006).
  12. Haubert, D., et al. Trophic structure and major trophic links in conventional versus organic farming systems as indicated by carbon stable isotope ratios of fatty acids. Oikos. 118 (10), 1579-1589 (2009).
  13. Ngosong, C., Raupp, J., Richnow, H. H., Ruess, L. Tracking Collembola feeding strategies by the natural 13C signal of fatty acids in an arable soil with different fertilizer regimes. Pedobiologia. 54 (4), 225-233 (2011).
  14. Bec, A., et al. Assessing the reliability of fatty acid-specific stable isotope analysis for trophic studies. Methods in Ecology and Evolution. 2 (6), 651-659 (2011).
  15. Gladyshev, M. I., Makhutova, O. N., Kravchuk, E. S., Anishchenko, O. V., Sushchik, N. N. Stable isotope fractionation of fatty acids of Daphnia fed laboratory cultures of microalgae. Limnologica. 56 (Supplement C. 56 (Supplement C), 23-29 (2016).
  16. Gladyshev, M. I., Sushchik, N. N., Kalachova, G. S., Makhutova, O. N. Stable isotope composition of fatty acids in organisms of different trophic levels in the Yenisei river. PLoS One. 7 (3), e34059(2012).
  17. Eisenreich, W., Dandekar, T., Heesemann, J., Goebel, W. Carbon metabolism of intracellular bacterial pathogens and possible links to virulence. Nature Reviews Microbiology. 8 (6), 401-412 (2010).
  18. Eylert, E., Bacher, A., Eisenreich, W. NMR-based isotopologue profiling of microbial carotenoids. Methods Mol Biol. 892, 315-333 (2012).
  19. Garton, N. J., O'Hare, H. M. Tuberculosis: feeding the enemy. Chemical Biology. 20 (8), 971-972 (2013).
  20. Rosenblatt, J., Chinkes, D., Wolfe, M., Wolfe, R. R. Stable isotope tracer analysis by GC-MS, including quantification of isotopomer effects. Am J Physiol. 263 (3), E584-E596 (1992).
  21. Fernandez, C. A., Des Rosiers, C., Previs, S. F., David, F., Brunengraber, H. Correction of 13C mass isotopomer distributions for natural stable isotope abundance. J Mass Spectrom. 31 (3), 255-262 (1996).
  22. Heuner, K., Eisenreich, W. The intracellular metabolism of legionella by isotopologue profiling. Methods Mol Biol. 954, 163-181 (2013).
  23. Willenborg, J., et al. Characterization of the pivotal carbon metabolism of Streptococcus suis serotype 2 under ex vivo and chemically defined in vitro conditions by isotopologue profiling. J Biol Chem. 290 (9), 5840-5854 (2015).
  24. Menzel, R., Ngosong, C., Ruess, L. Isotopologue profiling enables insights into dietary routing and metabolism of trophic biomarker fatty acids. Chemoecology. 27 (3), 101-114 (2017).
  25. Buse, T., Ruess, L., Filser, J. New trophic biomarkers for Collembola reared on algal diets. Pedobiologia. 56 (3), 153-159 (2013).
  26. Hutson, B. R. Effects of variations of the plaster-charcoal culture method on a Collembolan, Folsomia candida. Pedobiologia. 18, 138-144 (1978).
  27. Fountain, M. T., Hopkin, S. P. Folsomia candida (Collembola): a "standard" soil arthropod. Annu Rev Entomol. 50, 201-222 (2005).
  28. ISO, I. O. fS. Soil Quality-Inhibition of reproduction of Collembola (Folsomia candida) by soil pollutants. , ISO 11267:1999 (1999).
  29. Welch, D. F. Applications of cellular fatty acid analysis. Clin Microbiol Rev. 4 (4), 422-438 (1991).
  30. Dodds, E. D., McCoy, M. R., Rea, L. D., Kennish, J. M. Gas chromatographic quantification of fatty acid methyl esters: flame ionization detection vs. electron impact mass spectrometry. Lipids. 40 (4), 419-428 (2005).
  31. Kuppardt, S., Chatzinotas, A., Kastner, M. Development of a fatty acid and RNA stable isotope probing-based method for tracking protist grazing on bacteria in wastewater. Appl Environ Microbiol. 76 (24), 8222-8230 (2010).
  32. Zhang, X., He, H., Amelung, W. A GC/MS method for the assessment of 15N and 13C incorporation into soil amino acid enantiomers. Soil Biology and Biochemistry. 39 (11), 2785-2796 (2007).
  33. Vetter, W., Thurnhofer, S. Analysis of fatty acids by mass spectrometry in the selected ion monitoring mode. Lipid Technol. 19 (8), 184-186 (2007).
  34. Thurnhofer, S., Vetter, W. A gas chromatography/electron ionization-mass spectrometry-selected ion monitoring method for determining the fatty acid pattern in food after formation of fatty acid methyl esters. J Agric Food Chem. 53 (23), 8896-8903 (2005).
  35. Haubert, D., Haggblom, M. M., Scheu, S., Ruess, L. Effects of fungal food quality and starvation on the fatty acid composition of Protaphorura fimata (Collembola). Comparative Biochemistry and Physiology B-Biochemistry & Molecular Biology. 138 (1), 41-52 (2004).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Isotopologeprofilering van vetzurenkoolstof-13-traceranalyselipidemetabolisme-padenbodeminvertebrate consumentenextractie van neutrale lipidenfosfolipidevetzurengeselecteerde ionmonitoringgaschromatografieanalysedetectie van isotopologenpatronen
Profilering van vetzuur 13C Isotopologue geeft inzicht in de trofische Carbon overdracht en lipide metabolisme van ongewervelde consumenten
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.