Bouillon Microdilution In Vitro Screening: een gemakkelijke en snelle methode om te ontdekken van nieuwe antischimmel Compounds

Samenvatting

Een eenvoudig en flexibel Bouillon microdilution methode voor het screenen van antischimmel verbindingen en extracten.

Samenvatting

Schimmelinfecties zijn een belangrijke medische voorwaarde geworden in de laatste decennia, maar het aantal beschikbare antischimmel geneesmiddelen is beperkt. In dit scenario is het zoeken naar nieuwe antischimmel geneesmiddelen nodig. Het protocol gemeld hier gegevens een methode om scherm peptiden voor hun schimmeldodende eigenschappen. Het is gebaseerd op de Bouillon microdilution gevoeligheid test van de Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3 richtsnoeren met wijzigingen aan het onderzoek van antimicrobiële peptiden als potentiële nieuwe antischimmelmiddelen. Dit protocol beschrijft een functionele test om te evalueren van de activiteiten van antischimmel verbindingen en kan eenvoudig worden aangepast om aan te passen van een bepaalde categorie van moleculen onder onderzoek. Aangezien de testen worden uitgevoerd in 96-wells-platen met behulp van kleine volumes, kan een grootschalig onderzoek worden uitgevoerd in een korte hoeveelheid tijd, vooral als uitgevoerd in een omgeving van automatisering. Deze procedure laat zien hoe een gestandaardiseerde en verstelbare klinische protocol het nastreven van de Bank-werk van nieuwe moleculen ter verbetering van de therapie van schimmelziekten kan helpen.

Inleiding

Schimmelinfecties zijn geworden een belangrijke medische zorg in de afgelopen decennia aanzienlijk is gestegen voornamelijk te wijten aan een stijging van het aantal immuungecompromitteerde personen zoals die in de behandeling van kanker en degenen die met HIV/AIDS leven of getransplanteerde organen^1,2. Echter bijdragen een zeer beperkt scala van beschikbare antischimmel geneesmiddelen en het toenemende aantal verslagen over schimmel weerstand tegen hen aan de grote problemen met betrekking tot de therapeutiek van systemische mycoses³.

Een potentiële bron van nieuwe antischimmel compounds zijn antimicrobiële peptiden (ampère), kleine kationische peptiden geproduceerd door vele organismen als onderdeel van hun aangeboren immune reactie op infectie⁴. De screeningsmethode voor het testen van deze verbindingen tegen schimmel ziekteverwekkers is echter niet gestandaardiseerd. Verschillende procedures zijn gebruikt om de antischimmel activiteiten beoordelen van versterkers, soms voor de dezelfde model micro-organisme^5,6,7. Deze verschillen en het gebrek aan detail in sommige protocollen bemoeilijken vergelijkingen tussen verbindingen en belemmert reproduceerbaarheid.

Unidirectioneel om te standaardiseren het testen van nieuwe drugkandidaten is richtsnoeren gebruikt om te definiëren antischimmel gevoeligheid in klinische instellingen, zoals de klinische en laboratorium Standards Institute (CLSI) M27-A3 richtsnoeren te volgen. Deze antischimmel gevoeligheid tests zijn echter te beperkend, en niet rekening overweging variatie in metabolisme over soorten, als zij slechts voor een paar selecteren agenten waren gevestigd. Bijvoorbeeld, doen ze niet rekening houden met de metabolische behoeften van niet-fermenteren-gisten.

Dit protocol staat de beoordeling van de activiteit van potentiële antischimmel verbindingen, en hier is geïmplementeerd voor het zoeken naar antischimmel peptiden. Het is gebaseerd op de Bouillon microdilution gevoeligheid test van de CLSI M27-A3-richtlijnen met betrekking tot wijzigingen die de screening van nieuwe verbindingen^8,9te optimaliseren. Deze wijzigingen toestaan voor het gebruik van kleine hoeveelheden van stof, variaties in temperatuur of eerste entmateriaal en verschillende media voor optimale pre-test groei, terwijl de resultaten met het gebruik van referentie antischimmelmiddelen als besturingselementen te standaardiseren. Deze methode, met het gebruik van multi goed cultuur platen, maakt het mogelijk om snel en betrouwbaar scherm een groot aantal verbindingen.

Als gevolg van de inherente flexibiliteit, kan dit protocol worden gebruikt met verschillende chemische klassen van samenstellingen en tegen andere micro-organismen, met enkele aanpassingen.

Protocol

1. oplossingen en Media

1. Bereiden van 2 X Roswell Park Memorial Instituut (RPMI) 1640 medium, met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), Sabouraud dextrose Bouillon en Sabouraud dextrose agar volgens tabel 1.

2. schimmel entmateriaal groei voorwaarden

1. Bewaar alle schimmel stammen als bevroren voorraden in 35% glycerol bij-80 ° C, totdat het nodig is.
2. Voer de volgende stappen uit voor elk experiment.
   1. Voor Candida albicans stammen:
      1. Ontdooi een voorraad flesje en breng 200 µL tot 10 mL Sabouraud dextrose Bouillon in een steriele 50 mL polypropyleen buis met een GLB en cultuur 's nachts bij 30 ° C met agitatie (200 rpm). Vergeet niet om de helling van de buis en het GLB iets openlaten voor een betere ventilatie van de cultuur.
   2. Voor Cryptococcus neoformans stammen:
      1. Schraap het bevroren oppervlak van een voorraad flacon. Plaat van de cellen op Sabouraud dextrose agar platen en incubeer gedurende 48 h bij 30 ° C. Na zichtbare groei van geïsoleerde kolonies, de platen in de ijskast (4 ° C) verzegeld met paraffine film voor maximaal 15 dagen te houden.
      2. Een middelgrote geïsoleerde kolonie van de plaat met een steriel tandenstoker of steriele inoculating lus verzamelen en Sabouraud dextrose Bouillon in een conische buis van steriele 50 mL 10 mL beënten. Incubeer gedurende ongeveer 24 h bij 30 ° C onder agitatie (200 rpm).
      3. De 24 uur incubatie niet overschrijden. Vergeet niet om de helling van de buis en het GLB iets openlaten voor een betere ventilatie. Het is altijd goed op de standaardisering van de fase van de groei van de cellen vóór elke proef, want dit is een belangrijke factor die van antimicrobiële resistentie.
         Opmerking: Beide schimmels bij 30 ° C voor snelle vermeerdering in onze experimenten zijn geteeld, maar de temperatuur kan worden aangepast aan de doelstellingen van de studie, bijvoorbeeld klinische behandeling (37 ° C). Bovenal moet dit eerste incubatietijd worden vooraf vastgesteld voor elke schimmel isolaat en onderhouden in alle tests om de reproduceerbaarheid.
3. Na de groei van zwammen, verzamelen de cellen door centrifugeren van de conische buisjes bij 1.200 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant en voeg toe 10 mL PBS.
4. Resuspendeer de cellen en centrifuge weer bij 1.200 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
5. Herhaal de PBS wassen en centrifugeren tweemaal meer. Na de derde wash, resuspendeer de cellen in 5 mL (op basis van de grootte van de pellet) 2 X RPMI-1640 voedingsbodem.
6. Bereiden 1 mL van een verdunning van het 1:100 of 1:1,000 in een microcentrifuge buis (afhankelijk van de troebelheid van de celsuspensie).
7. Aliquot 10 µL met deze tweevoudige verdunning, plaatst u deze in een hemocytometer kamer en tellen het totale aantal cellen in de hoek van de vier kwadranten onder de Microscoop. Bereken de concentratie door de formule: (totaal cel nummer/4) x verdunning factor x 10⁴ (kamer verdunning constant).
   1. Overwegen een 100% levensvatbaarheid als levensvatbaarheid graven en groei omstandigheden hebben systematisch zijn gecorreleerd voor het isolaat bestudeerd.
      Opmerking: De normalisatie en kwaliteitscontrole van de graven van de levensvatbaarheid kunnen worden gedaan door rug-plating in overeenstemming met de Europese Commissie minimaal inhiberende concentratie (MIC) antischimmel, antimicrobiële gevoeligheid testen (EUCAST) methode voor gisten¹⁰ .
   2. Als de groei/levensvatbaarheid correlatie is niet vastgesteld voor het isolaat bestudeerde, meten de schimmel levensvatbaarheid door het tellen van levende cellen in een hemocytometer met behulp van kleurstoffen die selectief kleur dode cellen, zoals phloxine B¹¹, trypan-blauw ¹², of Janus groen¹³. De schimmel cellen gebruiken voor dit protocol alleen als de levensvatbaarheid van de bevolking op dit punt 90 is % of hoger.
      Opmerking: Dead/alive kleurstoffen kunnen niet goed werken met de schimmel van keuze. Gelieve te testen ze vóór gebruik. De trypan blauwe kleurstof werkt bijvoorbeeld niet goed met C. neoformans.
8. Daarna bereiden de schorsingen van de cel in 2 X RPMI-1640 medium (2 X aangepast entmateriaal in RPMI-1640 medium). Overwegen een volume van 5 mL voor elke plaat voor 96-wells-platen.
   1. Voor alle C. albicans stammen, bereiden een voorraad celsuspensie van 4 x 10-³ cellen/mL. Deze concentratie is 2 X van de concentratie van de laatste cel in elk putje (2 x 10³ cellen/mL).
   2. Voorbereiden voor C. neoformans stammen, een voorraadculturen van cellen 2 x 10⁴ cellen/mL. Deze concentratie is twee keer de laatste cel concentratie in elk putje (1 x 10⁴ cellen/mL).
   3. Voor andere schimmels, test met een bekende antimycoticum welke concentratie ideaal voor de specifieke studie met betrekking tot de incubatietijd zijn zal. Rekening tijd van het metabolisme en duplicatie van de schimmel.

3. peptides (onbekende Agent)

1. Slaan de gelyofiliseerd peptiden bij-20 ° C, en hen in gedeïoniseerd water vóór elk experiment op te lossen. De maximale opslagtijd eenmaal opgelost in water zal afhangen van de aard van elke peptide.
2. Bereid hoeveelheden van twee keer de hoogste eindconcentratie getest in de analyse (2 X). In het ideale geval bereiden een klein aantal aliquots met genoeg peptide voor één keer wordt gebruikt om te voorkomen dat cycli bevriezen-ontdooien.
   Opmerking: De keuze van de concentratie moet worden gebaseerd op literatuur en de eigenschappen van de peptide. Het is aanbevolen om de seriële verdunningen beginnen met ongeveer 100 µM van de peptide, en vervolgens vergroten of verkleinen deze concentratiebereik afhankelijk van de verkregen resultaten.

4. verwijzing antischimmelmiddelen (positieve controles)

1. Voor degenen verdund in water: bereid een 2 X-oplossing van de hoogste concentratie van de analyse (zie sectie 5: antischimmel Assay voor de verdunning stappen).
   1. Bereid voor C. albicans stammen, een oplossing van 128 µg/mL fluconazol of 128 µg/mL caspofungine. De concentratie van de plaat voor beide zullen 64 µg/mL.
   2. Bereid voor C. neoformans stammen, een oplossing van 32 µg/mL amfotericine B (in water oplosbare oplossing). De plaat concentratie zullen 16 µg/mL.
      Opmerking: Normaal amfotericine B wordt verdund in dimethylsulfoxide (DMSO), aangezien dit anti-schimmel slecht oplosbaar in water is. Er zijn echter in water oplosbare amfotericine B preparaten commercieel beschikbaar.
2. Voor antischimmelmiddelen verdund in een organisch oplosmiddel: een 100 X stockoplossing in DMSO bereiden en Verdun het tot 10 X in water voor gebruik.
   Opmerking: Dus in de put, de uiteindelijke concentratie van DMSO zal niet meer dan 1%. Een put waar de schimmel in de media met 1% DMSO zoals controle nodig is, gezien het feit dat sommige schimmels geen goed deze concentratie van het oplosmiddel tolereren zal groeien. Vergeet niet dat DMSO lichtgevoelige is, dus de afdekplaat met folie of plaatst u deze in een donkere kamer voor de duur van de incubatietijd.

5. antischimmel Assay

Opmerking: In vitro antischimmel tests zijn uitgevoerd op basis van de Bouillon microdilution gevoeligheid test uit Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3 richtsnoeren met enkele wijzigingen.

1. Maak een tweeledig seriële verdunning van elke peptide en schimmeldodende in 96-Wells polystyreen microplates tot een eindvolume van 50 µL controle.
   1. Met behulp van een precisiepipet Voeg 100 µL van het antimycoticum/peptide in de 2 X-concentratie van de hoogste gewenste eindconcentratie in kolommen in rij 1-3, A.
   2. Voeg met behulp van een meerkanaalspipet 50 µL van steriel water in de andere putten, in rijen B aan H.
   3. Verwijderen van 50 µL van de putjes met de hoogste concentratie (rij A), overdracht naar het volgende goed van de volgende concentratie (rij B) en meng.
   4. Herhaal de bovenstaande stappen totdat de put met de laagste concentratie en gooi 50 µL van dit goed (rij H). Laat kolommen 11 en 12 (rijen A, B, C) met uitsluitend water voor blanco-controle of controle van de negatieve/groei.
   5. 50 µL van de 2 X aangepast entmateriaal in RPMI-1640 medium toevoegen aan elk putje (kolommen 1-3 plus kolom 11 (negatief/groei control)); de uiteindelijke concentratie voor C. albicans zal worden 2 x 10³ cellen/mL, en de uiteindelijke concentratie voor C. neoformans stammen 10⁴ cellen/mL zullen.
   6. Bereiden van lege besturingselementen (50 µL water + 50 µL 2 X RPMI-1640 medium zonder cellen) en negatieve/groei controle (50 µL water + 50 µL aangepast entmateriaal 2 X RPMI-1640 medium zonder schimmeldodende) en lading in de goed plaat zoals beschreven hierboven.
2. Herhaal de procedure voor elke verbinding worden getest en de gekozen antischimmel controle (kolommen 4-10).
   Opmerking: De seriële verdunningen mogelijk verticaal als het experiment hieronder, of horizontaal in de plaat (dat wil zeggen, als het aantal verdunningen van het gegeven samengestelde/extract dat moet getest worden acht of meer).
   1. Als u verwijst naar de verbindingen, drugs, of onderdelen daarvan zijn lichtgevoelige, uitvoeren van de bepaling in lagere licht, dekking van de platen met folie of plaats in een donkere kamer tijdens incubations.
3. Houd rekening met de volgende optionele aanbevelingen.
   1. Verzegel de plaat met een duidelijke afdekplaat waarmee gasuitwisseling, als dit helpt verdamping verminderen.
   2. Plaats de plaat in een vochtige kamer; het zal ook helpen verminderen van verdamping.
4. Incubeer de platen bij 37 ° C gedurende 24 uur of 48 uur voor alle C. albicans stammen, en gedurende 48 uur met 200 rpm schudden voor C. neoformans. De lagere eindvolume (100 µL) zorgt ervoor dat geen spillover optreedt.
   Opmerking: Werd geen significant verschil waargenomen tussen MIC lezingen op 24 uur en 48 uur voor C. albicans stammen. Lezingen op 48 uur zijn echter gemakkelijker om te visualiseren.
5. Observeer alle putjes, met de hulp van een omgekeerde optische Microscoop, voordat de incubatietijd en na om te controleren of veranderingen in de morfologie zo goed te controleren op tekenen van besmetting.
   Opmerking: Lezingen kunnen worden gedaan visueel en gefotografeerd aan het einde van het experiment. Vóór elke lezing, meng licht de plaat. Het leest kunnen ook worden uitgevoerd door het meten van de OD op 600 nm, als cel samengeklonterd of filamentation niet worden nageleefd.
6. De experimenten uitvoeren ten minste driemaal op aparte data.

Resultaten

De MIC wordt gedefinieerd als het laagste antimicrobiële samengestelde concentratie dat volledig de groei van de zichtbare zwammen aan het eind van de incubatietijd remt. Aangezien de doelstelling van dit protocol een snelle methode om scherm potentiële antischimmelmiddelen is, elk goed met duidelijke media vergelijkbaar met de lege putten wordt beschouwd als een positief resultaat, overwegende dat een goed met troebelheid analoog aan de negatieve/groei-controleputjes als negatief beschou...

Discussie

Microdilution tests kunnen analyseren van de potentiële antischimmel activiteit van een doel samengesteld met behulp van kleine hoeveelheden van de stof, en tegelijkertijd testen in een aantal uiteenlopende concentraties. Dienovereenkomstig, dit protocol wordt aanbevolen als een eerste stap in de screening voor potentiële nieuwe antischimmel compounds. Het hier gepresenteerde protocol is gebaseerd op de M27-A3-protocol, in eerste instantie ontworpen om te helpen bij de keuze van antifungale therapie in klinieken, en kan ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Media en Reagentia
RPMI 1640 medium met l-glutamine, zonder natriumbicarbonaat	Thermo Fisher	31800-022
3-(N-morfolino) propaansulfonzuur (MOPS) (wat we gebruiken heeft een natrium, vul de naam alsjeblieft aan)	Sigma-Aldrich		Gebruik om 2X RPMI medium te bufferen
Natriumchloride (NaCl)	Dinâmica	1528-1	137 mM voor fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS)
Kaliumchloride (KCl)	J.T.Baker	3040-01	2,7 mM voor fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS)
Natriumfosfaat dibasisch (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	V000129	10 mM voor fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS)
Kaliumdiwaterstoffosfaat (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	60230	2 mM voor fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS)
BD Difco Sabouraud dextrose bouillon	BD	238230
BD Difco Sabouraud Dextrose Agar	BD	210950
Glycerol	Sigma-Aldrich	V000123	35% voor (stockoplossing? Cryopreservatie?)
Steriele water			Voor het verdunnen van geneesmiddelen in seriële verdunning
Antifungale geneesmiddelen
Amphotericin B	Sigma-Aldrich	A2942
Fluconazol	Sigma-Aldrich	F8929
Caspofungine	Sigma-Aldrich	PHR1160
Kunststoffen
50 mL kegelbuis	Sarstedt	62.547.254
Petrischaal	J.Prolab	0304-5
96 well plaat	Corning	3595
Steriele oplossingsreservoir	KASVI	K30-208	Gebruik om de oplossingen te pipetten met de meerkanaalspipet
Apparatuur en andere materialen
Optische microscoop	Nikon	E200MV
Centrifugaat	Thermo Fisher	MegaFuge 16R
Incubator	Ethik Technology	403-3D	Instellen op 37° C
Schudder	New Brunswick Scientific	Excella E25	Instellen op 37° C, 200 RPM
Celtellingskamer, Neubauer	BOECO Duitsland	BOE 13
Meerkanaalspipet	HTL	5123