Een eenvoudig en flexibel Bouillon microdilution methode voor het screenen van antischimmel verbindingen en extracten.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Bouillon Microdilution In Vitro Screening: een gemakkelijke en snelle methode om te ontdekken van nieuwe antischimmel Compounds
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Schimmelinfecties zijn een belangrijke medische voorwaarde geworden in de laatste decennia, maar het aantal beschikbare antischimmel geneesmiddelen is beperkt. In dit scenario is het zoeken naar nieuwe antischimmel geneesmiddelen nodig. Het protocol gemeld hier gegevens een methode om scherm peptiden voor hun schimmeldodende eigenschappen. Het is gebaseerd op de Bouillon microdilution gevoeligheid test van de Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3 richtsnoeren met wijzigingen aan het onderzoek van antimicrobiële peptiden als potentiële nieuwe antischimmelmiddelen. Dit protocol beschrijft een functionele test om te evalueren van de activiteiten van antischimmel verbindingen en kan eenvoudig worden aangepast om aan te passen van een bepaalde categorie van moleculen onder onderzoek. Aangezien de testen worden uitgevoerd in 96-wells-platen met behulp van kleine volumes, kan een grootschalig onderzoek worden uitgevoerd in een korte hoeveelheid tijd, vooral als uitgevoerd in een omgeving van automatisering. Deze procedure laat zien hoe een gestandaardiseerde en verstelbare klinische protocol het nastreven van de Bank-werk van nieuwe moleculen ter verbetering van de therapie van schimmelziekten kan helpen.
Inleiding
Schimmelinfecties zijn geworden een belangrijke medische zorg in de afgelopen decennia aanzienlijk is gestegen voornamelijk te wijten aan een stijging van het aantal immuungecompromitteerde personen zoals die in de behandeling van kanker en degenen die met HIV/AIDS leven of getransplanteerde organen1,2. Echter bijdragen een zeer beperkt scala van beschikbare antischimmel geneesmiddelen en het toenemende aantal verslagen over schimmel weerstand tegen hen aan de grote problemen met betrekking tot de therapeutiek van systemische mycoses3.
Een potentiële bron van....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. oplossingen en Media
- Bereiden van 2 X Roswell Park Memorial Instituut (RPMI) 1640 medium, met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), Sabouraud dextrose Bouillon en Sabouraud dextrose agar volgens tabel 1.
2. schimmel entmateriaal groei voorwaarden
- Bewaar alle schimmel stammen als bevroren voorraden in 35% glycerol bij-80 ° C, totdat het nodig is.
- Voer de volgende stappen uit voor elk experiment.
- Voor Candida albicans stammen:
- Ontdooi een voorraad flesje en breng 200 µL tot 10 mL Sabouraud dextrose Bouillon in een steriele 50 mL polypropyleen buis met een GLB e....
- Voor Candida albicans stammen:
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De MIC wordt gedefinieerd als het laagste antimicrobiële samengestelde concentratie dat volledig de groei van de zichtbare zwammen aan het eind van de incubatietijd remt. Aangezien de doelstelling van dit protocol een snelle methode om scherm potentiële antischimmelmiddelen is, elk goed met duidelijke media vergelijkbaar met de lege putten wordt beschouwd als een positief resultaat, overwegende dat een goed met troebelheid analoog aan de negatieve/groei-controleputjes als negatief beschou.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Microdilution tests kunnen analyseren van de potentiële antischimmel activiteit van een doel samengesteld met behulp van kleine hoeveelheden van de stof, en tegelijkertijd testen in een aantal uiteenlopende concentraties. Dienovereenkomstig, dit protocol wordt aanbevolen als een eerste stap in de screening voor potentiële nieuwe antischimmel compounds. Het hier gepresenteerde protocol is gebaseerd op de M27-A3-protocol, in eerste instantie ontworpen om te helpen bij de keuze van antifungale therapie in klinieken, en kan .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Wij danken de CAPES-Brazilië, CNPq-Brazilië, FAP/DF voor financiële steun. Wij zijn dankbaar aan Dr Hugo Costa Paes voor de herziening van het manuscript.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Media en Reagentia | |||
| RPMI 1640 medium met l-glutamine, zonder natriumbicarbonaat | Thermo Fisher | 31800-022 | |
| 3-(N-morfolino) propaansulfonzuur (MOPS) (wat we gebruiken heeft een natrium, vul de naam alsjeblieft aan) | Sigma-Aldrich | Gebruik om 2X RPMI medium te bufferen | |
| Natriumchloride (NaCl) | Dinâmica | 1528-1 | 137 mM voor fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) |
| Kaliumchloride (KCl) | J.T.Baker | 3040-01 | 2,7 mM voor fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) |
| Natriumfosfaat dibasisch (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | V000129 | 10 mM voor fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) |
| Kaliumdiwaterstoffosfaat (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | 60230 | 2 mM voor fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) |
| BD Difco Sabouraud dextrose bouillon | BD | 238230 | |
| BD Difco Sabouraud Dextrose Agar | BD | 210950 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | V000123 | 35% voor (stockoplossing? Cryopreservatie?) |
| Steriele water | Voor het verdunnen van geneesmiddelen in seriële verdunning | ||
| Antifungale geneesmiddelen | |||
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | |
| Fluconazol | Sigma-Aldrich | F8929 | |
| Caspofungine | Sigma-Aldrich | PHR1160 | |
| Kunststoffen | |||
| 50 mL kegelbuis | Sarstedt | 62.547.254 | |
| Petrischaal | J.Prolab | 0304-5 | |
| 96 well plaat | Corning | 3595 | |
| Steriele oplossingsreservoir | KASVI | K30-208 | Gebruik om de oplossingen te pipetten met de meerkanaalspipet |
| Apparatuur en andere materialen | |||
| Optische microscoop | Nikon | E200MV | |
| Centrifugaat | Thermo Fisher | MegaFuge 16R | |
| Incubator | Ethik Technology | 403-3D | Instellen op 37° C |
| Schudder | New Brunswick Scientific | Excella E25 | Instellen op 37° C, 200 RPM |
| Celtellingskamer, Neubauer | BOECO Duitsland | BOE 13 | |
| Meerkanaalspipet | HTL | 5123 |
Referenties
- Armstrong-James, D., Meintjes, G., Brown, G. D. A neglected epidemic: fungal infections in HIV/AIDS. Trends Microbiol. 22 (3), 120-127 (2014).
- Romani, L. Immunity to fungal infections. Nat Rev Immunol. 11 (4), 275-288 (2011).
- Pfaller, M. A.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
