Methodenartikel

Kwantitatieve analyse van neuronale dendritische Arborization complexiteit in Drosophila

DOI:

10.3791/57139

⸱

7 januari 2019

 ,  , 
1Genetics and Aging Research Unit, Department of Neurology, Massachusetts General Hospital, Mass General Institute of Neurodegenerative Disease, 2Department of Geriatric Neurology, Nanlou Clinical Division, PLA General Hospital

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol is gericht op kwantitatieve analyse van complexiteit van de neuronale dendritische arborization (NDAC) in Drosophila, die kan worden gebruikt voor studies van dendritische morfogenese.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dendrites de vertakte projecties van een neuron worden en dendritische morfologie weerspiegelt synaptic organisatie tijdens de ontwikkeling van het zenuwstelsel. Drosophila larvale neuronale dendritische arborization (da) is een ideaal model voor het bestuderen van de morfogenese van neurale dendrites en genfunctie in de ontwikkeling van het zenuwstelsel. Er zijn vier klassen van da neuronen. Klasse IV is het meest complex met een vertakkende patroon dat betrekking heeft op bijna het hele gebied van de larvale lichaam muur. Wij hebben eerder het effect van het monddood maken van de ortholog van de Drosophila van SOX5 op klasse IV neuronale dendritische arborization complexiteit (NDAC) met behulp van vier parameters gekenmerkt: de lengte van dendrites, de oppervlakte van de dendriet dekking, de totaal aantal van takken, en de vertakkende structuur. Dit protocol stelt de workflow van NDAC kwantitatieve analyse, bestaande uit de larvale dissectie, confocal microscopie en afbeelding analysemethodes ImageJ softwarematig. Verder inzicht in da neuronale ontwikkeling en de onderliggende mechanismen zal verbetering van het inzicht van neuronale functie en aanwijzingen over de fundamentele oorzaken van neurologische en neurologische aandoeningen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dendrites, die de vertakte projecties van een neuron, betrekking hebben op het veld dat van het neuron zintuiglijke en synaptische ingangen van andere neuronen1,2 omvat. Dendrites zijn een belangrijk onderdeel van synapse formation en spelen een cruciale rol in de integratie van synaptic ingangen, evenals de elektrochemische stimulatie in een neuron teeltmateriaal. Dendritische arborization (da) is een proces waarmee vormen de neuronen nieuwe dendritische bomen en takken maken nieuwe synapsen. De ontwikkeling en de morfologie van de da, zoals tak dichtheid en groepering patronen, resultaat van scriptingregel biologische processen en zijn sterk gecorreleerd aan neuronale functie. Het doel van dit protocol is bedoeld als een methode voor kwantitatieve analyse van neuronale dendritric arborization complexiteit in Drosophila.

De complexiteit van dendrites bepaalt de synaptische typen, connectiviteit en ingangen van partner neuronen. Vertakkende patronen en een bevolkingsdichtheid van dendrites betrokken zijn bij de verwerking van de signalen die naar de dendritische veld3,4 convergeren. Dendrites hebben de flexibiliteit om aanpassing in ontwikkeling. Bijvoorbeeld heeft synaptic signaling een effect op dendriet organisatie in de somatosensorische neuron tijdens de ontwikkelings fase en het volwassen zenuwstelsel5. De oprichting van neuronal connectiviteit is afhankelijk van de voedselproductie en de rijping van dendrites. Misvorming van dendrites wordt geassocieerd met verminderde neuronale functie. Studies hebben aangetoond dat de abnormaliteit van da neuron morfogenese aan de etiologie van meerdere neurodegeneratieve ziekten bijdragen kan, met inbegrip van de ziekte van Alzheimer (AD), de ziekte van Parkinson (PD), de ziekte van Huntington (HD), en Lou Gehrig's disease / Amyotrophic lateral sclerosis (ALS)6,7,8. Synaptic wijzigingen weergegeven in het beginstadium van AD, in overleg met de achteruitgang en de bijzondere waardevermindering van neuron functie7,8. Echter, de specifieke kenmerken van hoe dendriet pathologie bijdraagt aan pathogenese in deze neurodegeneratieve ziekten blijft ongrijpbaar.

De ontwikkeling van dendrites wordt gereguleerd door de genen die coderen voor een complex netwerk van regelgevende instanties, zoals de familie van de Wnt van eiwitten9,10, transcriptiefactoren en liganden op cel oppervlakte receptoren11,12 . Drosophila da neuronen bestaan uit vier klassen (klasse I, II, III, IV), van welke klasse IV da neuronen hebben de meest complexe vertakkende patronen en hebben gewerkt als een krachtige experimenteel systeem voor beter begrip morfogenese13, 14. Tijdens de vroege morfogenese, overexpressie en/of RNAi zwijgen van genen in klasse IV da neuronen leiden tot veranderingen in de vertakkende patronen en dendriet snoeien13. Het is belangrijk een praktische methode voor de kwantitatieve analyse van de neuronale dendritische arborization te ontwikkelen.

Wij hebben eerder aangetoond dat zwijgen van de Drosophila ortholog van SOX5, Sox102F, tot kortere dendrites van da neuronen en verminderde complexiteit in klasse IV da neuronen15 leidde. Hier presenteren we de procedure voor kwantitatieve analyse voor de complexiteit van de neuronale dendritische arborization (NDAC) in Drosophila. Dit protocol, aangepast uit de vorige beschreven methodologie, biedt een korte methode om de ontwikkeling van de sensorische neuronen da assay. Het illustreert de robuuste afbeelding labeling en de da neuron in de derde instar larvale lichaam muur16,17,18,19. Het is een waardevolle protocol voor onderzoekers die willen onderzoeken van de NDAC en ontwikkelingsstoornissen verschillen in vivo.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. experimentele voorbereiding

  1. Voorbereiding van de volgende reagentia: Dulbecco van fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS); Triton-X-100; 0,2% PBST (PBS + 0,2% Triton X-100); 32% paraformaldehyde (PFA), verdund tot 4% wordt afgesloten vóór gebruik; silicone-elastomeer base en genezen agent; antifade montage medium (bvverlengen goud); en vingernagel Pools.
  2. Voorbereiding van de volgende apparatuur: dissectie Microscoop, twee scherpe pincet en een paar van schaar voor microdissection, een aantal pinnen voor microdissection, een petrischaal voor het maken van de dissectie schotel, Microscoop dia's en coverslips, een confocal microscoop, en een computer met Fiji ImageJ software geïnstalleerd.

2. de larven collectie

  1. UAS-Sox102F-RNAi vliegen met UAS-GFP, ppk-GAL4 of W1118 wild type vliegen, respectievelijk metgezel. Cultuur vliegt in standaardomstandigheden bij 25 ° C.
  2. In ~ 5-6 dagen, verzamelen de derde instar-larven van UAS-Sox102F-RNAi / ppk-GAL4, UAS-GFP of UAS-GFP en ppk-GAL4 / + control zorgvuldig met een Tang voor dissectie.

3. dissectie van de larven

Opmerking: Alle procedures in deze sectie worden geëxploiteerd onder een microscoop met microdissection. De vergroting is aan de onderzoekers. Probeer aan te passen aan de optimale zicht-weergave. ~ 4-6 X vergroting wordt aanbevolen.

  1. Plaats een larve op een dissectie gerecht gemaakt van silicone-elastomeer basis en een weefselkweek petrischaal.
  2. PIN de larve mond haak zodat de dorsale zijde onder ogen te zien, en vervolgens pin de staart van de larve. Plaats de dorsale zijde in het midden zo veel mogelijk om de middellijn, die de open-up marker zullen bloot te stellen.
  3. 200 µL van PBS aan de larve te behouden lichaam vocht toevoegen.
  4. Maak een knippen met een schaar langs de dorsale middellijn tussen de twee tracheas, van caudal naar rostraal. Maken een kleine snede op elk van de vier hoeken van het lichaam van de larve.
  5. Plaats een PIN-code op elk van de vier hoeken van het lichaam zodat het lichaam plat ligt.
  6. De larve lichaam muur vast in 4% PFA gedurende 25 minuten bij kamertemperatuur.
  7. Wassen in PBST voor 5 min. Repeat tweemaal meer.
  8. Verwijder de pennen uit het weefsel. Breng het weefsel op een glasplaatje, dek af met antifade montage medium, en monteren met een cover slip. Lucht drogen voor 1 h en verzegel de randen met vingernagel Pools.

4. beeldvorming verwerking

Opmerking: De beelden werden genomen met behulp van een systeem van omgekeerde confocal microscoop. De gebruiker kan het fotograferen van het monster met behulp van een 20 X doelstelling (aanbevolen).

  1. Z-serie opnamen. Open het dialoogvenster 'Capture Z-serie' in de confocal microscoop software. Het bereik voor het vastleggen van de beelden van de serie Z te bepalen.
    1. Klik op de knop "Boven en beneden". De boven- en onderkant positie en input van de waarden te bepalen "onderaan:" en "Top:" vakken. De "stap" in het dialoogvenster 'Capture Z-serie' instellen als 0,5 µm. Klik vervolgens op de "Run nu" knop om te verwerven van de Z-serie beelden.
  2. De verkregen afbeeldingen opslaan als *.tiff of *.nd2 bestanden.
  3. De dia's opslaan in een donkere houder bij 4 ° C na imaging.

5. dendriet evaluatie

Opmerking: GFP eiwit was co-overexpressie in UAS-GFP en ppk-GAL4 vliegt in de neuronen van de da voor GFP fluorescentie imaging analyse. De lengte, de vertakking en de structuur van da neuronen in de derde instar-larven werden gekwantificeerd. Analyseparameters omvatten lengte van dendrites (µm), de oppervlakte (µm2), de totale aantal takken en vertakkende structuur (%). Figuur 1 toont de analyse gebruikte parameters in detail.

  1. Lengte van Dendrites
    Opmerking: De lengte van dendrites is de som van alle dendrites label in tracer plugin.
    1. Installeren en uitvoeren van Fiji ImageJ (https://fiji.sc/)20 software. Vervolgens splitsen beelden in afzonderlijke kanalen, als er meerdere kanalen van beelden.
      Opmerking: De afbeelding in dit protocol heeft slechts één kanaal van GFP.
    2. Uitvoeren "afbeelding | Stapels | Z project"om een Z-projectie; een nieuw venster verschijnt met de naam 'Z-projectie.' Klik op "max intensiteit" voor projectie type en organiseren nummers tussen segment start en stop segment afhankelijk van op individuele voorkeuren. Klik op 'OK'. Er verschijnt een Z-projectie-afbeelding met de presentatie van de projectie dendriet duidelijk.
    3. Sporen van de neurites.
      1. Selecteer "Plugins | Segmentatie | Eenvoudige Neurites Tracer"in het venster om te traceren van de dendrites. Zoek het neuron soma, en klik op een punt op een dendriet vanaf de cel lichaam, en een ander punt aan het uiteinde van deze dendriet.
        Opmerking: Het programma verbindt de twee punten met een blauwe lijn.
      2. Druk op "Y" in de plug-in venster als het pad duidelijk is; het pad dendriet is herleid tot de eindpunten van het geselecteerde pad in de zichtbare beelden. Klik op "volledige pad" op hetzelfde plugin venster; het segment is voltooid (Figuur 2).
        Opmerking: Sommige dendrites eindigde verder van de uitgangspunten, waarin het traject werd verdeeld in kleinere segmenten. De segmenten werden gecombineerd om een volledige pad voor de tracer.
    4. Nadat een pad is voltooid, ga terug naar een nieuw punt waar de takken zijn. Het nieuwe pad kan worden gebouwd op; het vak "Alle paden" venster zal tonen de waarden van de lengte van alle paden (Figuur 3). De tracering-bestand opslaan en doorgaan met de onvoltooide sporen zoals afgebeeld in Figuur 2.
    5. De dendriet lengtegegevens exporteren door te klikken, "bestand | Exporteren als *.cvs"in het 'Plugin'-venster. Vervolgens een samenvatting van alle lengtes van het pad, en de gegevens exporteren naar een data-analyse/spreadsheet-software. (Figuur 3).
  2. Oppervlakte van de da neuronen
    1. Selecteer de Freehand tekengereedschap in het venster 'Fiji ImageJ'. Het pad traceren, en sluit vervolgens de eindpunten. Het 'Analyseren'-menu, selecteer "Set metingen | Gebied." Klik op "maatregel" uit het menu 'Analyseren'. Het resultaat wordt weergegeven in een nieuwe doos met de waarde voor het gebied geselecteerd (Figuur 4). Kopieer het naar de software van de analyse van de gegevens.
  3. Totaal aantal van takken en vertakking structuur van de da neuronen
    1. Berekenen van het totale aantal takken door het openen van de "Analyse" en vervolgens "maken | Analyze Skeletonized paden"in het venster plugin van tracering (Figuur 5).
      Opmerking: De structuur van de arbor is de som van de niveaus van takken. Het pad is gedefinieerd tussen de cel lichaam en de dendriet tips en één pad kan bevatten meerdere branches, zoals de primaire arbors zijn de dendrites van de cel lichaam van neuron. De secundaire arbors zijn takken van de primaire en zo verder met het tertiair, quaternaire en quinary arbors. De structuur van dendriet vertakking wordt gescheiden afhankelijk van de niveaus van takken. Bijvoorbeeld, is de primaire % het aantal vestigingen verdeeld door totale aantal vertakking, enzovoort.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De dendrites van da neuronen waren gelabeld door co-overexpressing GFP (UAS-GFP; ppk-GAL4) in de da neurale soma en dendritische arbors voor GFP fluorescentie imaging analyse. De morfologie van da neuron dendrites was beeld door een omgekeerde confocal microscoop (Figuur 2).

De dendrites van da neuronen werden opgespoord met behulp van Fiji ImageJ software. Het bestand werd gebruikt voor het schatte...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dendrites die de epidermis innervate zijn de input gebieden van neuronen en hun morphologies bepalen hoe de informatie is ontvangen en verwerkt door individuele neuronen. Ontwikkeling dendriet morfologie weerspiegelt gene modulatie van dendriet organisatie. De Drosophila larvale da neuron van het perifere zenuwstelsel is een belangrijk model voor het bestuderen van dendriet ontwikkeling omdat: 1) de functionele gelijkenis met zoogdieren11,12; 2) vier kla...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We bedank William A. Eimer voor imaging technische bijstand. Dit werk werd gesteund door de Cure Alzheimer Fonds [R.E.T], het National Institute of Health [R01AG014713 en R01MH60009 voor de R.E.T; R03AR063271 en R15EB019704 naar A.L.], en de National Science Foundation [NSF1455613 naar A.L.].

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)Gibco Life Sciences10010-023
TritonX-100Fisher Scientific9002-93-1
Paraformaldehyde (PFA)Electron Microscopy Sciences15714-S
Sylgard 184 siliconen elastomeerbasis en uitharderDow Corning Corportation3097366-0516;3097358-1004
ProLong Gold Antifade MountantThermo Fisher ScientificP36931
FingernagellakCVS72180
StereomicroscoopNikonSMZ800
Confocale microscoopNikonEclipse Ti-E
PetrischaalFalcon353001
PincetDumont11255-20
SchaarRoboz Surgical Instrument CoRS-5611
InsectenpinnenRoboz Surgical Instrument CoRS-6082-25
Microscoopglazen en dekglaasjesFisher Scientific15-188-52

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wassle, H., Boycott, B. B. Functional architecture of the mammalian retina. Physiol Rev. 71 (2), 447-480 (1991).
  2. MacNeil, M. A., Masland, R. H. Extreme diversity among amacrine cells: implications for function. Neuron. 20 (5), 971-982 (1998).
  3. Losonczy, A., Makara, J. K., Magee, J. C. Compartmentalized dendritic plasticity and input feature storage in neurons. Nature. 452 (7186), 436-441 (2008).
  4. Spruston, N. Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration. Nat Rev Neurosci. 9 (3), 206-221 (2008).
  5. Jaworski, J., et al. Dynamic microtubules regulate dendritic spine morphology and synaptic plasticity. Neuron. 61 (1), 85-100 (2009).
  6. Kweon, J. H., Kim, S., Lee, S. B. The cellular basis of dendrite pathology in neurodegenerative diseases. BMB Rep. 50 (1), 5-11 (2016).
  7. Baloyannis, S. J. Dendritic pathology in Alzheimer's disease. J Neurol Sci. 283 (1-2), 153-157 (2009).
  8. Masliah, E., Terry, R. D., Alford, M., DeTeresa, R., Hansen, L. A. Cortical and subcortical patterns of synaptophysinlike immunoreactivity in Alzheimer's disease. Am J Pathol. 138 (1), 235-246 (1991).
  9. Wayman, G. A., et al. Activity-dependent dendritic arborization mediated by CaM-kinase I activation and enhanced CREB-dependent transcription of Wnt-2. Neuron. 50 (6), 897-909 (2006).
  10. Rosso, S. B., Sussman, D., Wynshaw-Boris, A., Salinas, P. C. Wnt signaling through Dishevelled, Rac and JNK regulates dendritic development. Nat Neurosci. 8 (1), 34-42 (2005).
  11. Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Different levels of the homeodomain protein cut regulate distinct dendrite branching patterns of Drosophila multidendritic neurons. Cell. 112 (6), 805-818 (2003).
  12. Sugimura, K., Satoh, D., Estes, P., Crews, S., Uemura, T. Development of morphological diversity of dendrites in Drosophila by the BTB-zinc finger protein abrupt. Neuron. 43 (6), 809-822 (2004).
  13. Jan, Y. N., Jan, L. Y. Branching out: mechanisms of dendritic arborization. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).
  14. Sears, J. C., Broihier, H. T. FoxO regulates microtubule dynamics and polarity to promote dendrite branching in Drosophila sensory neurons. Dev Biol. 418 (1), 40-54 (2016).
  15. Li, A., et al. Silencing of the Drosophila ortholog of SOX5 leads to abnormal neuronal development and behavioral impairment. Hum Mol Genet. 26 (8), 1472-1482 (2017).
  16. Misra, M., et al. A Genome-Wide Screen for Dendritically Localized RNAs Identifies Genes Required for Dendrite Morphogenesis. G3 (Bethesda). 6 (8), 2397-2405 (2016).
  17. Emoto, K., et al. Control of dendritic branching and tiling by the Tricornered-kinase/Furry signaling pathway in Drosophila sensory neurons. Cell. 119 (2), 245-256 (2004).
  18. Olesnicky, E. C., et al. Extensive use of RNA-binding proteins in Drosophila sensory neuron dendrite morphogenesis. G3 (Bethesda). 4 (2), 297-306 (2014).
  19. Parrish, J. Z., Xu, P., Kim, C. C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. The microRNA bantam functions in epithelial cells to regulate scaling growth of dendrite arbors in drosophila sensory neurons. Neuron. 63 (6), 788-802 (2009).
  20. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  21. Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136 (7), 1049-1061 (2009).
  22. Jinushi-Nakao, S., et al. Knot/Collier and cut control different aspects of dendrite cytoskeleton and synergize to define final arbor shape. Neuron. 56 (6), 963-978 (2007).
  23. Crozatier, M., Vincent, A. Control of multidendritic neuron differentiation in Drosophila: the role of Collier. Dev Biol. 315 (1), 232-242 (2008).
  24. Copf, T. Importance of gene dosage in controlling dendritic arbor formation during development. Eur J Neurosci. 42 (6), 2234-2249 (2015).
  25. Rosso, S. B., Inestrosa, N. C. WNT signaling in neuronal maturation and synaptogenesis. Front Cell Neurosci. 7, 103(2013).
  26. Engel, T., Hernandez, F., Avila, J., Lucas, J. J. Full reversal of Alzheimer's disease-like phenotype in a mouse model with conditional overexpression of glycogen synthase kinase-3. J Neurosci. 26 (19), 5083-5090 (2006).
  27. Longair, M. H., Baker, D. A., Armstrong, J. D. Simple Neurite Tracer: open source software for reconstruction, visualization and analysis of neuronal processes. Bioinformatics. 27 (17), 2453-2454 (2011).
  28. Pool, M., Thiemann, J., Bar-Or, A., Fournier, A. E. NeuriteTracer: a novel ImageJ plugin for automated quantification of neurite outgrowth. J Neurosci Methods. 168 (1), 134-139 (2008).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Neuronale morfologieDrosophila larvenconfocale microscopieImageJ analysemeting van dendrietlengteberekening van het oppervlakanalyse van de vertakkingsstructuurSOX5 gen silencingz serie beeldvorming

Gerelateerde artikelen