Methodenartikel

Aanpassing van hybridisatie inname van chromatine-geassocieerde eiwitten voor Proteomics op zoogdiercellen

5.7K weergaven

DOI:

10.3791/57140

1 juni 2018

In dit artikel

Samenvatting

Dit is een methode om nieuwe DNA-interactie eiwitten op specifieke doelgroep loci, afhankelijk van de volgorde-specifieke inname van kruisverwijzende chromatine voor latere proteomic analyses identificeren. Geen voorkennis vereist over potentiële bindende proteïnen, noch cel wijzigingen zijn vereist. In eerste instantie ontwikkeld voor gist, is de technologie inmiddels aangepast voor zoogdiercellen.

Samenvatting

De vangst van de kruising van de chromatine-geassocieerde eiwitten voor proteomics (HyCCAPP) technologie werd oorspronkelijk ontwikkeld om nieuwe DNA-eiwit interactie in gist bloot te leggen. Het staat de analyse van een regio van doelstelling van belang zonder de noodzaak van voorafgaande kennis over waarschijnlijk eiwitten gebonden aan de target-regio. Hierdoor, in theorie, kan HyCCAPP worden gebruikt om te analyseren welke genomic regio van belang, en het biedt voldoende flexibiliteit om te werken in verschillende cel systemen. Deze methode is niet bedoeld om te studeren bandplaatsen van bekende transcriptiefactoren, een taak die beter geschikt voor Immunoprecipitation (ChIP) van de chromatine en ChIP-achtige methoden. De sterkte van HyCCAPP ligt in haar vermogen om te verkennen DNA regio's waarvoor er beperkte is of geen kennis over de eiwitten gebonden. Ook kan het een handige methode om te voorkomen dat vooroordelen (aanwezig in ChIP-achtige methoden) geïntroduceerd door op basis van eiwitten chromatine verrijking met antilichamen. HyCCAPP kunnen potentieel, een krachtig hulpmiddel om te ontdekken de echt nieuwe DNA-eiwit interactie. Tot op heden, is de technologie overwegend vereffend gistcellen of hoge kopie herhalen sequenties in zoogdiercellen. Om de krachtige tool die we voor ogen, moeten HyCCAPP benaderingen worden geoptimaliseerd voor het efficiënt vastleggen single-kopie loci in zoogdiercellen. Hier presenteren wij onze aanpassing van de initiële gist HyCCAPP vangen protocol bij menselijke cellijnen, en tonen dat single-kopie chromatine regio's kunnen worden efficiënt geïsoleerd met dit gewijzigde protocol.

Inleiding

Tijdens het afgelopen decennium heeft gezien een dramatische verbetering in sequencing technologieën, de studie van een breed scala van genomen in grote aantallen monsters, en met verbazingwekkende resolutie toe te staan. De encyclopedie van DNA elementen (CODEER) Consortium, een grootschalige multi institutionele inspanning onder leiding van de National Human Genome Research Institute van de National Institutes of Health, heeft verstrekt inzicht in hoe individuele transcriptiefactoren en andere regelgevende eiwitten binden aan en interactie met het genoom. De eerste poging gekenmerkt specifieke DNA-eiwit interacties, zoals beoordeeld door chromatine immunoprecipitati....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. capture Oligonucleotide Design

  1. Het ontwerp van een panel van oligonucleotides worden gebruikt tijdens de opname van de kruising van het doel regio/s.
    1. Streven naar ontwerp van 4 – 8 oligonucleotides per doelgroep regio, maar als een minimum, ontwerp van ten minste één oligonucleotide gericht op elk uiteinde van de doel-regio.
    2. Als de volgorde van de doelgroep lang is (> 500 basenparen), ontwerpen de oligonucleotides als mogelijk bij het verzekeren van effectieve verrijking van de chromatine in de volledige doel-regio verspreid.
      Opmerking: We hebben waargenomen optimale vangt met 4 – 8 oligonucleotides. Hoewel dit pr....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Als gevolg van de noodzaak van grote input hoeveelheden van de chromatine voor HyCCAPP om te slagen, de cellen worden gekweekt op een relatief hoog niveau van confluentie. Trypan blauw kleuring wordt gebruikt om te bevestigen dat de cel sterftecijfers gematigd zijn (< 10%). In één exemplaar experimenten, chromatine inhoud vóór hybridisatie vangen moet worden in het bereik van de femtomolar, die meestal vereist ten minste 109 cellen als grondstof. Voorafgaand aan de experimenten.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De hier beschreven methode van HyCCAPP heeft vele unieke functies waarmee u gemakkelijker een krachtige aanpak van DNA-interacties die anders elusive blijven zou ontdekken. De aard van het proces geeft HyCCAPP de flexibiliteit om te werken in verschillende organismen en regio's van het genoom. Het is een methode, die heeft echter verschillende beperkingen te worden beschouwd.

HyCCAPP is een methode die voorkomt van wijzigingen van de cel zodat het potentieel kan worden toegepast in elektrische.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Er zijn geen belangenconflicten openbaar te maken.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gesteund door de NIH Grants P50HG004952 en R01GM109099 naar MO.

....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
PrimerQuest toolIDT
OligoAnalyzer 3.1IDTAnalyseer captuur oligonucleotiden
PairFoldUBCAnalyseer interacties
RPMI 1640 mediaThermo Fisher11875093
Penicilline-streptomycineThermo Fisher15140122
L-Glutamine Thermo Fisher25030081
Fetaal bovien serumThermo Fisher26140079
Countess geautomatiseerde celtellerThermo Fisher
850 cm2 roller fles Greiner Bio-one680058
Roller systeemWheaton22-288-525
37 % formaldehyde Sigma-AldrichF8775
GlycineSigma-Aldrich
Igepal CA-630Sigma-AldrichI3021
Protease inhibitor cocktailSigma-AldrichP4380
HEPESThermo Fisher15630080
Branson digitale sonifier SFX 150Emerson
Qubit 3.0 fluorometerThermo Fisher
Qubit dsDNA BR assay kitThermo FisherQ32850
Bioanalyzer 2100Agilent
Agilent DNA 1000 kitAgilent5067-1504
MES natriumzoutSigma-AldrichM3885
NaCl 5MThermo FisherAM9760G
EDTASigma-Aldrich
DynaMag-2 magneetThermo Fisher12321D
DynaMag-15 magneetThermo Fisher12301D
Dynabeads M-280 atreptavidineThermo Fisher60210
Buisjes met lage bindingEppendorf22431081
Hybridisatie ovenSciGene
Buisjes shaker en rotatorThermo Fisher415110Q
DNase I (RNase-vrij)New England BioLabsM0303
SSC buffer 20× concentraatSigma-AldrichS6639

Referenties

  1. Consortium, E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2013).
  2. Galas, D. J., Schmitz, A. DNAse footprinting: a simple method for the detection of protein-DNA binding specificity. Nucleic Acids Res.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

HyCCAPP protocolSingle copy lociOligonucleotide ontwerpCel crosslinkingNuclei lysisSonicatieBead gebaseerde captureqPCR analyseDNA eiwitinteractiesVerrijking van genomische regio sNiet coderende varianten

Gerelateerde artikelen