Methodenartikel
Dit is een methode om nieuwe DNA-interactie eiwitten op specifieke doelgroep loci, afhankelijk van de volgorde-specifieke inname van kruisverwijzende chromatine voor latere proteomic analyses identificeren. Geen voorkennis vereist over potentiële bindende proteïnen, noch cel wijzigingen zijn vereist. In eerste instantie ontwikkeld voor gist, is de technologie inmiddels aangepast voor zoogdiercellen.
De vangst van de kruising van de chromatine-geassocieerde eiwitten voor proteomics (HyCCAPP) technologie werd oorspronkelijk ontwikkeld om nieuwe DNA-eiwit interactie in gist bloot te leggen. Het staat de analyse van een regio van doelstelling van belang zonder de noodzaak van voorafgaande kennis over waarschijnlijk eiwitten gebonden aan de target-regio. Hierdoor, in theorie, kan HyCCAPP worden gebruikt om te analyseren welke genomic regio van belang, en het biedt voldoende flexibiliteit om te werken in verschillende cel systemen. Deze methode is niet bedoeld om te studeren bandplaatsen van bekende transcriptiefactoren, een taak die beter geschikt voor Immunoprecipitation (ChIP) van de chromatine en ChIP-achtige methoden. De sterkte van HyCCAPP ligt in haar vermogen om te verkennen DNA regio's waarvoor er beperkte is of geen kennis over de eiwitten gebonden. Ook kan het een handige methode om te voorkomen dat vooroordelen (aanwezig in ChIP-achtige methoden) geïntroduceerd door op basis van eiwitten chromatine verrijking met antilichamen. HyCCAPP kunnen potentieel, een krachtig hulpmiddel om te ontdekken de echt nieuwe DNA-eiwit interactie. Tot op heden, is de technologie overwegend vereffend gistcellen of hoge kopie herhalen sequenties in zoogdiercellen. Om de krachtige tool die we voor ogen, moeten HyCCAPP benaderingen worden geoptimaliseerd voor het efficiënt vastleggen single-kopie loci in zoogdiercellen. Hier presenteren wij onze aanpassing van de initiële gist HyCCAPP vangen protocol bij menselijke cellijnen, en tonen dat single-kopie chromatine regio's kunnen worden efficiënt geïsoleerd met dit gewijzigde protocol.
Tijdens het afgelopen decennium heeft gezien een dramatische verbetering in sequencing technologieën, de studie van een breed scala van genomen in grote aantallen monsters, en met verbazingwekkende resolutie toe te staan. De encyclopedie van DNA elementen (CODEER) Consortium, een grootschalige multi institutionele inspanning onder leiding van de National Human Genome Research Institute van de National Institutes of Health, heeft verstrekt inzicht in hoe individuele transcriptiefactoren en andere regelgevende eiwitten binden aan en interactie met het genoom. De eerste poging gekenmerkt specifieke DNA-eiwit interacties, zoals beoordeeld door chromatine immunoprecipitati....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
1. capture Oligonucleotide Design
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Als gevolg van de noodzaak van grote input hoeveelheden van de chromatine voor HyCCAPP om te slagen, de cellen worden gekweekt op een relatief hoog niveau van confluentie. Trypan blauw kleuring wordt gebruikt om te bevestigen dat de cel sterftecijfers gematigd zijn (< 10%). In één exemplaar experimenten, chromatine inhoud vóór hybridisatie vangen moet worden in het bereik van de femtomolar, die meestal vereist ten minste 109 cellen als grondstof. Voorafgaand aan de experimenten.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De hier beschreven methode van HyCCAPP heeft vele unieke functies waarmee u gemakkelijker een krachtige aanpak van DNA-interacties die anders elusive blijven zou ontdekken. De aard van het proces geeft HyCCAPP de flexibiliteit om te werken in verschillende organismen en regio's van het genoom. Het is een methode, die heeft echter verschillende beperkingen te worden beschouwd.
HyCCAPP is een methode die voorkomt van wijzigingen van de cel zodat het potentieel kan worden toegepast in elektrische.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Er zijn geen belangenconflicten openbaar te maken.
Dit werk werd gesteund door de NIH Grants P50HG004952 en R01GM109099 naar MO.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| PrimerQuest tool | IDT | ||
| OligoAnalyzer 3.1 | IDT | Analyseer captuur oligonucleotiden | |
| PairFold | UBC | Analyseer interacties | |
| RPMI 1640 media | Thermo Fisher | 11875093 | |
| Penicilline-streptomycine | Thermo Fisher | 15140122 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher | 25030081 | |
| Fetaal bovien serum | Thermo Fisher | 26140079 | |
| Countess geautomatiseerde celteller | Thermo Fisher | ||
| 850 cm2 roller fles | Greiner Bio-one | 680058 | |
| Roller systeem | Wheaton | 22-288-525 | |
| 37 % formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | ||
| Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | I3021 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P4380 | |
| HEPES | Thermo Fisher | 15630080 | |
| Branson digitale sonifier SFX 150 | Emerson | ||
| Qubit 3.0 fluorometer | Thermo Fisher | ||
| Qubit dsDNA BR assay kit | Thermo Fisher | Q32850 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | ||
| Agilent DNA 1000 kit | Agilent | 5067-1504 | |
| MES natriumzout | Sigma-Aldrich | M3885 | |
| NaCl 5M | Thermo Fisher | AM9760G | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ||
| DynaMag-2 magneet | Thermo Fisher | 12321D | |
| DynaMag-15 magneet | Thermo Fisher | 12301D | |
| Dynabeads M-280 atreptavidine | Thermo Fisher | 60210 | |
| Buisjes met lage binding | Eppendorf | 22431081 | |
| Hybridisatie oven | SciGene | ||
| Buisjes shaker en rotator | Thermo Fisher | 415110Q | |
| DNase I (RNase-vrij) | New England BioLabs | M0303 | |
| SSC buffer 20× concentraat | Sigma-Aldrich | S6639 |
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken
Toestemming aanvragen