Method Article

Een Optogenetic methode te controleren en analyseren van gen expressiepatronen in cel-naar-cel interacties

DOI:

10.3791/57149

⸱

March 22nd, 2018

 , 
1Institute for Frontier Life and Medical Sciences, Kyoto University, 2Japan Science and Technology Agency, PRESTO, 3Institute for Integrated Cell-Material Sciences, Kyoto University, 4Graduate School of Medicine, Kyoto University, 5Graduate School of Biostudies, Kyoto University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol te analyseren van cel naar cel overdracht van oscillerende informatie door optogenetic control en live monitoring van genexpressie. Deze aanpak biedt een uniek platform om te testen een functionele betekenis van dynamische gen expressie programma's in meercellige systemen.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cellen moeten goed reageren op stoffelijk veranderende omgevingen, die worden beïnvloed door verschillende factoren uit de omliggende cellen. De inkeping signalering traject behoort tot deze essentiële moleculaire machines voor cel-naar-cel communicatie, die spelen een belangrijke rol in de normale ontwikkeling van embryo's speelt. Dit traject omvat een cel-naar-cel overdracht van oscillerende informatie met ultradian ritmes, maar ondanks de vooruitgang in moleculaire biologietechnieken, heeft het ophelderen van de impact van meercellige interacties op oscillerende gen is uitdagend dynamiek. Hier presenteren we een protocol waarmee optogenetic controle en live gen expressiepatronen in een nauwkeurige temporele manier. Deze methode met succes gebleken dat intracellulaire en intercellulaire periodieke ingangen van de inkeping signalering later intrinsieke oscillaties door frequentie afstemming en faseverschuiving bij de eencellige resolutie. Deze benadering is van toepassing op de analyse van de dynamische functies van verschillende signaalroutes, bieden een uniek platform om te testen een functionele betekenis van dynamische gen expressie programma's in meercellige systemen.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cel-naar-cel communicatie speelt een belangrijke rol in embryonale patronen in ontwikkelings processen. Bij gewervelde embryo's, de metameric structuren genaamd somieten langs de as van het anterior-posterior lichaam gevormd met een precieze temporele nauwkeurigheid onder de controle van een tijd-keeping klok, genaamd de segmentatie klok1. Tijdens dit proces, een groep presomitic mesoderm (PSM) cellen worden periodiek omgezet somieten op synchrone wijze. Dit proces omvat gesynchroniseerde oscillerende genexpressie en PSM cellen die in fase oscilleren vormen de dezelfde somieten. De periode van de oscillerende genexpressie is ongeveer 2 tot 3 h in muizen en ongeveer 30 min in zebrafish. Wanneer losgekoppeld, PSM cellen verliezen de synchrony2,3, maar wanneer ze opnieuw geaggregeerde, ze kunnen zelf organiseren en herstellen van de bevolking synchrony4, suggereert dat cel koppeling een sleutel voor de gesynchroniseerde is oscillaties.

Uitgebreide inspanningen bleek dat de signalering moleculen in de Delta-Notch pathway strak met de gesynchroniseerde oscillaties van de segmentatie klok genen verbonden bent. Farmacologische remmers of genetische mutaties van Inkeping signalering desynchronize de bevolking van de oscillatoren. Mutanten van Inkeping signalering van onderdelen, zoals DeltaC, DeltaD en Notch1a, weergeven in zebrafish, asynchrone oscillaties5,6. In chick of muis embryo's is niet alleen de inkeping ligand Delta-like1 (Dll1), maar ook de inkeping Modulator waanzinnige rand (Lfng) vereist voor gesynchroniseerde oscillaties7,8,9. Echter, het moeilijk geweest om te testen het functionele vermogen van dergelijke moleculen voor dynamische informatieoverdracht van cel naar cel, omdat tijdelijke resoluties van conventionele perturbation van gene verordening dynamiek waren niet voldoende om te onderzoeken de processen van tijdschalen van 2 – 3 h (ultradian ritmes).

Onlangs hebben wij een geïntegreerde methode voor controle en monitor gen expressiepatronen in zoogdiercellen10ontwikkeld. Deze technologie maakt inductie van gen expressie pulsen door periodieke lichte verlichting op ultradian tijdschalen. Dit protocol vertegenwoordigt de methoden lichtgevoelige cel-lijnen te observeren dynamische reacties van verslaggever cellen door live-cel luminescentie toezicht in de context van cel naar cel communicatie. Deze methode is van toepassing op de analyse van vele andere signaalroutes.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. generatie van stabiele cellijnen door het Tol2-systeem

  1. Plasmide vectoren (figuur 1A) transfect van optogenetic Tol2-based modules samen met de vector expressie transposase (Tol2) (pCAGGS-mT2TP) in C2C12 cellen. In alle stappen, cultuur cellen met DMEM medium aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS) en penicilline-streptomycine bij 37 ° C (tabel 1), in aanwezigheid van 5% CO2, anders aangeduid.
    1. Rekenen trypsinized cellen met een cel-teller en plaat 5 x 104 C2C12 cellen per putje in een 12-well bord één dag vóór de transfectie.
    2. Co transfect 0.375 μg van vectoren van de Tol2 gebaseerde optogenetic (pAI177 of pAI218), 0,125 μg van een drug selectie vector (pAI170) en 0.5 μg van pCAGGS-mT2TP-vector met behulp van lipofection reagens.
    3. Trypsinize van transfected cellen, en hen één dag na de transfectie plaat tot 100 mm cultuur gerechten.
    4. Exchange-kweekmedium voor transfected cellen aan kweekmedium aangevuld met 100 mg/mL hygromycin.
    5. De cellen van de cultuur voor 3 dagen om te un-transfected cellen te elimineren. Merk op dat middelgrote verandering niet nodig is.
  2. Trypsinize van transfected cellen, en te zuiveren van een bevolking van cellen uiten van fluorescente proteïnen voor selectie. Voor ontvanger cellen uitvoering van pAI177, de sorteer poort groen-PE kanaal ingesteld voor zuivering van mCherry-positieve-celpopulatie. Voor cellen lichtgevoelig afzender uitvoering van pAI218, de sorteer poort APC kanaal ingesteld voor zuivering van iRFP713-positieve-celpopulatie.
  3. (optioneel) Maak een klonale celpopulatie standaardmethoden, zoals beperkte verdunning of eencellige FACS sorteert.

2. evaluatie van foto-gevoeligheid van gemanipuleerde cellen op het bevolkingsniveau

Opmerking: Dit deel beschrijft een protocol om te controleren van dynamische inductie van Dll1 ligand eiwitten bij blauw-licht verlichting door biochemische tests, zoals qPCR en het westelijke bevlekken.

  1. Twee soorten starterscentra met of zonder lichtbronnen voor een licht-geïnduceerde voorwaarde of een donkere opgeeft, respectievelijk instellen. Set-up licht-intensiteit van een blauw-LED trans-illuminator, zoals afgebeeld in figuur 1B, met behulp van een lichtmeter. Programma tijdsinstellingen en duur van lichte verlichting door het laden van een controle-script naar een single-board-micro-controller waarmee programmeerbare planningen voor verlichting (Figuur 1 c).
  2. Rekenen trypsinized cellen met een cel-teller en plaat 1.0 x 105 lichtgevoelig afzender cellen uitvoering van pAI218 en pAI170 op 35-mm diameter kunststof cultuur gerechten (meer dan 12 gerechten voor lichte voorwaarde en 1 schotel voor donkere voorwaarde) en stel de gerechten in aparte voorbroeders voor donker/licht. Na het opzetten van gerechten, de deuren van de incubators tot het verzamelen van cel lysates gesloten te houden.
  3. Een en een half dagen na beplating, start licht verlichting (cellen zijn naar verwachting meer dan 80% confluente). Niet blootstellen cellen aan het licht om te voorkomen dat ongewenste foto-stimulatie.
    Opmerking: Schema's voor verlichting is afhankelijk van het doel van de experimenten. Merk op dat een duurzame verlichting voorwaarde (bv. 1-min duur en 10 min. intervallen met 40 µmol/m2/s licht-intensiteit) is voldoende voor een simpele controle van foto-inductie, en dat sterke licht verlichting schadelijk voor de cellen is. Dus zorg dat onschadelijk parameters voor verlichting zijn geselecteerd.
  4. Ongeveer 2 dagen na de beplating, bereiden cel-lysate met 30-min intervallen. Monster gerechten van starterscentra naar verplaatsen op-ijs en start voorbereiding van cel lysates voor verdere analyse.

3. dynamische zender-ontvanger Assay op het bevolkingsniveau: Real-time bewaking van cellulaire reacties op optische stimulatie door bet

  1. Trypsinize en de nummers van de afzender en de ontvanger cellen tellen met standaardmethoden. Voorbereiden van een totaal volume van 1 mL van het mengen van opschorting van 2.5 x 104 ontvanger en 1.25 x 10-5 afzender cellen (verhouding 1:5).
    Opmerking: 2:1, 1:1 of 1:2 zender-ontvanger-ratio's ook werken met een cel Totaal aantal 1.5 x 105. 10
  2. Plaat gemengde cellen in elk putje van 24-well zwarte platen met kweekmedium dat 1 mM luciferine.
  3. Analyseren van de cellen op afleesapparaat voor luciferase assay, en bevestigen dat de uitgangssignalen niet te hoog voor het registratiesysteem zijn.
    Opmerking: Als uitgangssignalen hoger dan 1 x 106 foton graven/s zijn, zij kunnen worden verzadigd. In dat geval, verminderen de concentratie van luciferine op optimale waarden zodat uitgangssignalen lager dan 1 x 106 foton graven/s zijn.
  4. De plaat op de opnamesysteem is ingesteld, en start een programma voor het opnemen (Figuur 1 d). Bijvoorbeeld, om lichte verlichting om 18 h na het instellen van de opname te starten
    Opmerking: Temporele filtering, zoals detrending signalen met bewegende gemiddeld en Savitzky-Golay filteren, zijn nuttig voor visualisatie van Golf-formulieren en piek detecties.

4. dynamische zender-ontvanger Assay op het niveau van eencellige: Real-time Imaging van eencellige reacties onder de controle van Optogenetic Perturbation

  1. Plaat 0,5 x 10-5 -ontvanger en 2.5 x 105 afzender cellen op 27-mm-diameter-glas-base 35 mm diameter gerechten. Erop toezien dat mengverhoudingen en een totale celaantal (een celdichtheid) correct worden aangepast.
  2. Een dag na de beplating, wisselen medium met 2 mL van het opnamemedium (fenol-rood gratis DMEM medium aangevuld met 5% FBS, penicilline-streptomycine en 1 mM luciferine), en de glas-base schotel aangezet met de Microscoop. Indien nodig, wassen puin van dode cellen met PBS (-).
    Opmerking: Het is beter te doen deze stap in een donkere conditie.
  3. Een omgekeerde Microscoop voorzien van een milieu kamer bij 37 ° C en 5% CO2instellen.
  4. Opzetten van een gekoelde CCD-camera. Zorg ervoor dat de temperatuur van de CCD-sensor is afgekoeld naar de waarde van de bestemming (meestal-90 ° C).
  5. Parameters instelt voor "Multidimensionale Timelapse" venster in automatische overname software voor het vastleggen van beelden met intervallen van 5 min en meer dan 288 keer (meer dan één overnachting opname).
    1. Open "Multidimensionale Timelapse" venster, selecteer een kanaal van luminescentie en een langzame 50 kHz uitlezing modus in het pull-down menu en stel het weggooien van 4 x 4 met 4-min blootstelling. Ervoor zorgen dat de uitlezing-modus is ingesteld op de langzame 50 kHz, die is van cruciaal belang voor het verminderen van de uitlezing lawaai te sporen zwak emitterende bioluminescente licht.
    2. Open "Multidimensionale Timelapse" venster, selecteer fluorescentie kanalen en een snelle 1 MHz uitlezing modus van het pull-down menu en stel 2 x 2 weggooien met 400 ms blootstelling. Ervoor zorgen dat de uitlezing-modus is ingesteld op de snelle 1 MHz te verminderen de tijd die nodig is voor fluorescentie imaging.
    3. Start time-lapse opname door te klikken op "Verwerven" knop.
  6. Uittreksel van eencellige sporen van luminescentie kanalen van time-lapse films door de software van de analyse van de afbeelding, als volgt. Controleer eerst luminescentie en fluorescentie stapel afbeeldingen de door afbeeldingsgegevens te importeren naar de software van de analyse van de afbeelding. Voor luminescentie afbeeldingen verwijderen hot pixels afgeleid van kosmische straling door het vergelijken van de intensiteiten van de pixels in stoffelijk aangrenzende beelden, ter vervanging van de pixelwaarden temporele berekend als het gemiddelde van de vorige en volgende frames (geïmplementeerd als "SpikeNoise Filter"), toepassing van deze verwerkte beelden op een ruimtelijk smoothing filter en achtergrond pixelwaarden van out-field uitzicht vanuit elk frame aftrekken. Vervolgens een "gebied van belang" bepalen (ROI) voor elke cel op een fluorescerende afbeelding op elk tijdstip, de ROI van toepassing op lichtgevende beelden en de verlichte intensiteit van elke ROI meten.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij de LightOn systeem11,12, waarmee foto-geïnduceerde genexpressie in cellen van zoogdieren, tot de studie van genetische oscillatoren met 2 - tot 3-h periodiciteit aangepast. Dit systeem bestaat uit twee delen: de foto-afleidbare transcriptionele activator hGAVPO en een UAS-promotor cassette naar station transcriptie van willekeurige genen van belang. Om te versnellen de Pulsatiele kinetiek van foto-geïnduceerde genexpressie, we...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We toonden een methode wilt besturen van gen expressie dynamiek met een frequentie van 2 tot en met 3 h. Deze tijdsschaal is veel korter dan die in andere conventionele systemen, met inbegrip van het Tet-On systeem en de oorspronkelijke LightOn-systeem. Sleutelparameters te bereiken de ultradian termijnen zijn half-leven van foto-geïnduceerde moleculaire producten, mRNAs en eiwitten. Deze kinetische parameters kunnen afhangen van celtypen en soorten. Voor het afstemmen van de kinetiek, is ter vervanging van Hes1 3' UTR s...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gesteund door JST, PRESTO (A.I.), Core Research voor evolutionaire wetenschap en technologie (JPMJCR12W2 (R.K.)), Grant-in-Aid voor wetenschappelijkonderzoek op innovatieve gebieden (Ministerie van onderwijs, cultuur, sport, wetenschap en technologie (MEXT), Japan 26119708 (A.I.) en 16 H 06480 (R.K.)), wetenschappelijk onderzoek (A) (Japan Society voor de bevordering van de wetenschap (JSPS) 24240049 (R.K.)), en jonge wetenschappers (A) (JSPS 15 H 05326 (A.I.)), en een Grant-in-Aid voor wetenschappelijk onderzoek op innovatieve gebieden "fluorescentie Live imaging"van de MEXT, Japan en Platform voor een dynamische aanpak leven systeem van de MEXT, Japan.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
FACSBecton, Dickinson and CompanyFACSAriaII SORP
CameraAndoriKon M-934
MicroscopeOlympusIX-81 ZDC
PMT deviceChuritsu eletric corp.CL24B-LIC/B
Blue LED illuminatorOptoCodeLEDB-SBOXH
DMEMNacalai08459-35
Penicillin-streptomycinNacalai26253-84
Fetal bovine serumSigma172012
KRYSTAL24 (black 24 well plate )Hi-tech303012
D-Luciferin Potassium SaltNacalai20028-24
Light meterLI-COR BiosciencesLI-250A
anti-HA-Peroxidase antibodyRocheclone 3F10
anti-Actin-Peroxidase antibodyWakoclone 2F3

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hubaud, A., Pourquie, O. Signalling dynamics in vertebrate segmentation. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15, 709-721 (2014).
  2. Maroto, M., Dale, J. K., Dequeant, M. L., Petit, A. C., Pourquié, O. Synchronised cycling gene oscillations in presomitic mesoderm cells require cell-cell contact. Int. J. Dev. Biol. 49, 309-315 (2005).
  3. Masamizu, Y., Ohtsuka, T., Takashima, Y., Nagahara, H., Takenaka, Y., Yoshikawa, K., Okamura, H., Kageyama, R. Real-time imaging of the somite segmentation clock: revelation of unstable oscillators in the individual presomitic mesoderm cell. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 1313-1318 (2006).
  4. Tsiairis, C., Aulehla, A. Self-Organization of Embryonic Genetic Oscillators into Spatiotemporal Wave Patterns. Cell. 164, 656-667 (2016).
  5. Jiang, Y. J., Aerne, B. L., Smithers, L., Haddon, C., Ish-Horowicz, D., Lewis, J. Notch signalling and the synchronization of the somite segmentation clock. Nature. 408, 475-479 (2000).
  6. Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. Single-cell-resolution imaging of the impact of Notch signaling and mitosis on segmentation clock dynamics. Dev. Cell. 23, 995-1005 (2012).
  7. Dale, J. K., Maroto, M., Dequeant, M. L., Malapert, P., McGrew, M., Pourquié, O. Periodic inhibition by Lunatic Fringe underlies the chick Segmentation Clock. Nature. 421, 275-278 (2003).
  8. Okubo, Y., Sugawara, T., Abe-Koduka, N., Kanno, J., Kimura, A., Saga, Y. Lfng regulates the synchronized oscillation of the mouse segmentation clock via trans-repression of Notch signalling. Nat. Commun. 3, 1141(2012).
  9. Shimojo, H., Isomura, A., Ohtsuka, T., Kori, H., Miyachi, H., Kageyama, R. Oscillatory control of Delta-like1 in cell interactions regulates dynamic gene expression and tissue morphogenesis. Genes Dev. 30, 102-116 (2016).
  10. Isomura, A., Ogushi, F., Kori, H., Kageyama, R. Optogenetic perturbation and bioluminescence imaging to analyze cell-to-cell transfer of oscillatory information. Genes Dev. 31, 524-535 (2017).
  11. Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nat. Meth. 9, 266-269 (2012).
  12. Imayoshi, I., Isomura, A., Harima, Y., Kawaguchi, K., Kori, H., Miyachi, H., Fujiwara, T. K., Ishidate, F., Kageyama, R. Oscillatory control of factors determining multipotency and fate in mouse neural progenitors. Science. 342, 1203-1208 (2013).
  13. Kawakami, K. Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates. Genome Biol. 8, Suppl 1. S7(2007).
  14. Yagita, K., Yamanaka, I., Emoto, N., Kawakami, K., Shimada, S. Real-time monitoring of circadian clock oscillations in primary cultures of mammalian cells using Tol2 transposon-mediated gene transfer strategy. BMC Biotechnology. 10, 3(2010).
  15. Filonov, G. S., Piatkevich, K. D., Ting, L. -M., Zhang, J., Kim, K., Verkhusha, V. V. Bright and stable near-infrared fluorescent protein for in vivo imaging. Nat. Biotechnol. 29, 757-761 (2011).
  16. Gregor, T., Fujimoto, K., Masaki, N., Sawai, S. The onset of collective behavior in social amoebae. Science. 328, 1021-1025 (2010).
  17. Kellogg, R. A., Tay, S. Noise facilitates transcriptional control under dynamic inputs. Cell. 160, 381-392 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Optogenetic ControlGene ExpressionCell to cell InteractionsNotch Signaling PathwayLive MonitoringBlue light IlluminationSingle cell ResolutionFluorescence ImagingLuciferase AssayTime lapse Recording

Related Articles