De rol van fysieke krachten in vroege Chick embryonale morfogenese sonderen

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol voor de invoering van een reeks nieuwe ex-ovo experimenten en fysieke modellering benaderingen voor het bestuderen van de mechanica van de morfogenese tijdens de vroege embryonale hersenen torsie van het kuiken.

Samenvatting

Embryonale ontwikkeling wordt traditioneel bestudeerd vanuit het perspectief van biomoleculaire genetica, maar het fundamentele belang van mechanica in genuitdrukking wordt steeds steeds herkend. In het bijzonder de embryonale chick hart en de hersenen buis, die drastische morfologische veranderingen ondergaan als ze ontwikkelen, behoren tot de belangrijkste kandidaten te bestuderen van de rol van fysieke krachten in de voedselproductie. Progressieve ventrale buigen en naar rechts torsie van de hersenen van de tubulaire embryonale chick gebeuren in het vroegste stadium van orgel-niveau links-rechts asymmetrie van de chick embryonale ontwikkeling. Het vitelline membraan (VM) bedwingt de dorsale zijde van het embryo en is betrokken bij het verstrekken van de kracht die nodig is voor het opwekken van de torsie van de ontwikkelende hersenen. Hier presenteren we een combinatie van nieuwe ex-ovo experimenten en fysieke modellering ter identificatie van de mechanica van hersenen torsie. Stadium Hamburger-Hamilton 11 embryo's zijn geoogst en gekweekte ex ovo (in de media). De VM wordt daarna verwijderd met behulp van een getrokken capillaire buis. Door het niveau van de vloeistof en het embryo te onderwerpen aan een vloeistof-air-interface, kan de vloeistof oppervlaktespanning van de media worden gebruikt ter vervanging van de mechanische rol van de VM. Microchirurgie experimenten werden ook uitgevoerd om te veranderen van de positie van het hart te vinden van de daaruit voortvloeiende verandering in de chiraliteit van hersenen torsie. Resultaten van dit protocol illustreren de fundamentele rol van mechanica in genuitdrukking rijden.

Inleiding

Moderne ontwikkelingsbiologie onderzoek spitst zich grotendeels toe op het begrip ontwikkeling vanuit het perspectief van de moleculaire genetica^{1,2,3,4,5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13}. het is bekend dat lichamelijke verschijnselen een centrale rol in de voedselproductie spelen, of de generatie van de biologische^{14,15,16,17 vormen}; specifieke mechanische mechanismen van ontwikkeling blijven echter grotendeels ongedwongen. Ventrale flexure en naar rechts torsie van de primitieve hersenen buis na Hamburger-Hamilton fase 11 (HH 11)¹⁸ zijn de twee belangrijkste processen die bijdragen aan embryonale vorm wijzigen^19,20. Met name blijft de fysieke mechanisme ten grondslag liggen aan de torsional ontwikkeling in de embryonale hersenen onvolledig begrepen.

De embryonale torsie in chick embryo is een van de vroegste morfogenetische gebeurtenissen van links-rechts (L-R) asymmetrie in ontwikkeling. Wanneer het proces van L-R asymmetrie is verstoord, zal geboorteafwijkingen zoals situs inversus, isomerieof heterotaxia ²¹optreden.
Hier presenteren we een protocol dat ex-ovo experimenten^22,23 met fysieke modellering combineert te karakteriseren van mechanische krachten tijdens de vroege embryonale hersenontwikkeling. Het doel van de methode voorgesteld is het identificeren van de mechanische krachten die verantwoordelijk is voor de hersenen torsie en de factoren die invloed hebben op de mate van torsie tijdens de vroege ontwikkeling¹². Gebaseerd op de experimentele observatie dat de vitelline membraan (VM) de dorsale zijde van het embryo bedwingt, veronderstelde we dat de VM de kracht die nodig is biedt voor het opwekken van de torsie van de ontwikkelende hersenen. Daarom in deze methode verwijderd wij het deel van de VM dat betrekking heeft op het gebied van de hersenen om erachter te komen de effecten op hersenen torsie. Bovendien, de methode voor het toepassen van vloeibare oppervlaktespanning werd gebruikt om te bevestigen de mechanische rol van de VM en een raming van de kracht die nodig is voor de hersenen torsie, die had niet eerder is gedaan. Het meten van de krachten tijdens de embryonale morfogenese is een uitdagende taak. Met name in een baanbrekende studie ontwikkelde Campàs en collega's²⁴ een nieuwe methode om te kwantificeren van de cellulaire benadrukt met ingespoten microdruppels. Deze methode was echter beperkt tot het meten van de krachten op het cellulaire niveau, dus niet van toepassing op de sonde krachten op weefsel - of organisme-niveau. Het protocol gepresenteerd in dit document werd ontwikkeld om gedeeltelijk vullen deze kloof.

Protocol

1. bereiding van de voedingsbodems van weefsel

1. Een 0.5 L fles van Dulbecco van bewerkt Eagle's Medium (DMEM) met 4,5 g/L glucose, natriumbicarbonaat, en L-glutamine gebruiken als basis voor de cultuur-media.
2. Voeg 10 mL van antibiotica de 0.5 l van DMEM in een steriele laminaire flow kap.
3. Met behulp van een steriele precisiepipet, overbrengen in 50 mL van de oplossing DMEM antibiotica een conische buis van steriele 50 mL.
4. Voeg 50 mL van het kuiken serum aan de resterende DMEM antibiotica oplossing in de fles 0,5 L in de steriele kap.
5. Opslaan van de eindoplossing (hierna chick voedingsbodems [CCM]) in 50 mL conische buis aliquots bij-20 ° C.

2. ei incubatie

1. Gebruik delicate veegt met 70% ethanol bevruchte specifieke pathogenen vrije wit Leghorn kippeneieren schoon te maken. Eieren in een longitudinale oriëntatie op houders te regelen.
2. Zet een ei incubator een doel temperatuur van 37,5 ° C instellen en onderhouden van de luchtvochtigheid op 48-55%. De luchtvochtigheid wordt gecontroleerd door een juiste hoeveelheid water toe te voegen aan de incubator.
3. Incubeer de eieren tot en met HH11-13, ongeveer 40-44 h.
4. Laat die de eieren bij kamertemperatuur gedurende ongeveer 15-30 minuten vóór het spuiten/reiniging met 70% ethanol afkoelen.

3. Trek glazen capillairen

1. Een 10 cm lange glazen capillaire buizen met een buitendiameter van 1,0 mm en een inwendige diameter van 0,5 mm monteren op een trekker van de micropipet.
2. Instellen van de hitte en trek parameters naar 750 en 400, respectievelijk. Druk op de knop van de pull te trekken van het capillair in dunne naalden.

4. filtreerpapier vervoerder methode

1. Snijd de cirkels van ongeveer 3 cm in diameter van filtreerpapier.
2. Snijd een rechthoek ongeveer 1 cm 2 cm van de cirkel met behulp van een perforator. Zorg ervoor dat te verwijderen elke uitsteekt of scherpe hoeken.

5. embryo oogsten en voorbereiding

1. Barst van de eieren van de bodem, trek uit elkaar de shell voorzichtig en zorgvuldig stort inhoud in een petrischaal 150 x 15 mm. Om ervoor te zorgen dat de embryo-kant is, houden de eieren in dezelfde afdrukstand die ze werden geïncubeerd terwijl ze kraken.
2. Verwijder de dunne albumine met behulp van een wegwerp Pipet van Pasteur.
3. De dikke albumine te scheiden van de dooier met behulp van botte eindigde pincet. Ervoor zorgen dat de dikke albumine is verwijderd door de bovenkant van de dooier licht te schrapen met de botte eindigde pincet.
4. Gebruik schone-tipped pincet te centreren en plaatst u een filtreerpapier ring op het embryo, overeenkomen met de lengteas van de ring met de lange as van het embryo.
5. De dooier rondom het filtreerpapier-ring met een schaar te knippen.
6. Trek de ring en het embryo uit de dooier in een schuine richting van de site waar de dooier eerst werd gesneden.
7. Spoel de embryo's in twee opeenvolgende 100 mm gerechten met kamertemperatuur 1 x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
8. Plaats eerst een filtreerpapier ring in een petrischaal 35-mm. Plaats dan de dorsale zijde van embryo tot op het filtreerpapier al in 35-mm petrischaal.
9. Plaats een roestvrij stalen ring op de top van de sandwich filtreerpapier. Zorg ervoor dat niet te beschadigen van het embryo.
10. Voeg 3 mL van de eerder bereid CCM toe aan elke petrischaal.
11. Verwijder de VM van elk embryo door licht het afromen van de getrokken capillaire naald aan de bovenkant van het embryo en peeling de VM weg, vanaf de voorste einde (pal boven de reukkolf) en over te gaan tot het chorda (figuur 1A).
12. Plaats acht 35-mm petrischalen in een 150 mm schotel dat werd bekleed met water verzadigd delicate taak doekjes (om vochtigheid).
13. Plaats de petrischaal 150-mm in een afsluitbare plastic zak dan de zak vullen met een mengsel van koolwaterstofgassen bestaat uit 95% O₂ en 5% CO₂.
14. Sluit de zak en plaatst u deze in een 37,5 ° C incubator.
15. Incubeer de embryo's voor een extra 27 h tot HH15-HH16 (figuur 1B).

6. het induceren van oppervlaktespanning

1. Verwijder de embryo's uit de incubator en een optische coherentie tomografie (OCT) systeem gebruiken om het imago van hen. Gebruik OCT om te bepalen van de torsional hoek van de neurale buis (NT) (Figuur 2).
2. De embryo's overbrengen in een lichte Microscoop en visualiseer bij 10 X vergroting. Gebruik een pipet 200 microliter om stapsgewijs 0,2 mL van de media van de petrischaal.
3. Neem helderveld beelden bij elk interval te observeren van de effecten van de media-lucht-interface op het embryo.
4. Media verwijderen totdat de oppervlaktespanning over het embryo torsie (Figuur 1 c induceert).
5. Het imago van het embryo met behulp van de OCT-systeem eens te meer om een definitieve torsional hoek voor vergelijking met de controle van de embryo's.  Opmerking: De Bright-veld beelden werden verkregen met behulp van een Microscoop ontleden. Een optische coherentie tomografie systeem met een bijgevoegde Microscoop werd gebruikt voor het verwerven van transversale afbeeldingsstapels van levende embryo's. Beelden werden verkregen in een 3 x 10 x 3 mm³ scannen domein en vervolgens verwerkt in een imagingsoftware. Tot slot, de fysieke model beelden werden genomen met een digitale single-lens reflex camera.

7. fysieke modellering van de oppervlaktespanning/VM krachten

1. Ontwikkelen van een vereenvoudigde 3D-geometrie die lijkt op een embryo tussen HH14-17 in commerciële modeling software (figuur 3A).
2. Het ontwerp van de negatieve schimmel van de 3D-geometrie in commerciële 3D-computer grafische software.
3. Gebruik een 3D-printer geladen met 1,75 mm acrylonitril butadieen styreen gloeidraad naar 3D print de ontworpen schimmel, in stereolithographic (.stl) formaat.
4. Om de schimmel, mengen van silicone rubber elastomeer componenten A en B in gelijke delen en giet het mengsel in de mal snel; Stel de mal gieten om te genezen bij kamertemperatuur voor 12u (figuur 3B).
5. Markeer het fysisch model van het embryo langs de NT aan de dorsale zijde om te visualiseren torsie.
6. Gebruik een dekglaasje aan om te repliceren de kracht toegepast op het 3D-fysieke model die het VM of oppervlaktespanning (figuur 3D bootst).
7. Plaats een aantal starre draden van gelijke lengte aan de kant van het fysieke model. Nadat het dekglaasje aan een externe kracht op het model van de hersenen oefent, worden de draden gekanteld in een hoek dat afhankelijk van de locatie. Bepalen de rotatie hoek arctan van de geprojecteerde lengte over de oorspronkelijke lengte van elke draad (figuur 3E).

8. wijzigen van de richting van het hart-lus

1. Volg de stappen in 3.1 en 3.2 bij het verkrijgen van een getrokken capillaire buis.
2. Volg de stappen in 5.1 tot en met 5.10 ter voorbereiding van het embryo.
3. Gebruik een paar pincet te spiegelen het koffiefilter zodat het embryo ventrale-side-up wordt.
4. Hiermee kunt u dat het getrokken capillair opengesneden een spleet in het membraan van de splanchnopleure (SPL).
5. Gebruik het capillair aan het uitoefenen van een mechanische kracht te duwen het hart van de rechterkant naar de linkerkant.
6. Volg de stappen in 5.12 tot 5.15 te observeren van de verandering in de torsie.

Resultaten

In deze studie werd de VM van het embryo op HH11 verwijderd uit het anterior einde aan de thoracale flexure. De embryo's werden door een systeem van OCT beeld. In dit stadium heeft de torsie van hersenen buis niet (figuur 1A) gestart. Na HH15-16 worden geïncubeerd, tentoongesteld embryo's met hun VM verwijderd verminderd hersenen buis torsie, ongeveer 35 graden (figuur 1B) in vergelijking met controle van embryo's, die torsie van...

Discussie

Terwijl fysische verschijnselen een integrale rol in genuitdrukking^{26,27,28,29,30}, specifieke mechanische mechanismen, samen met de coördinatie van de mechanische speelt en moleculaire mechanismen, blijven grotendeels onontgonnen. Het is bekend dat de ventrale flexure en naar rechts torsie van de primitieve hersenen zijn twee centrale processen die tot de vroe...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Bevruchte specifiek pathogeen-vrije White Leghorn-kippeneieren	Charles River
Optical Coherent Tomography Microscope	Thorlabs	GAN220C1
Siliconen elastomeer	Smooth-On, Inc.	EcoFlex 00-50
Dissectiemicroscoop	Leica	MZ8
Dulbecco’s Gemodificeerd Eagle’s Medium (DMEM)	Lonza	12-604F
Antibiotica	Sigma	P4083
Kippenserum	Sigma	C5405
Micropipet-trekker	Sutter Instrument	Model P-30
Filterpapier	Whatman	5202-110
Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)	Corning	21-040-CV
Comsol MultiPhysics	Comsol
3D computer grafische software	Rhino 5
Microscoop voorzien van OCT	Nikon	FN1
Digitale spiegelreflexcamera	EOS	Rebel T3i