Een methode voor de omental transplantatie van de eilandjes in een muis is ingevoerd. De geïsoleerde eilandjes met hydrogel zijn gemengd en het mengsel wordt geplaatst in de omental etui van een diabetische muis. Vervolgens de bloedglucose wordt gecontroleerd en immuno-histochemische analyse wordt uitgevoerd.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een methode voor Islet transplantatie aan de majus in muis
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Islet Transplantatie is voorgesteld als een mogelijke behandeling voor diabetes type 1. Recente overtuigend bewijs geeft aan dat intravasculaire islet infusie verre van ideaal is en de majus daarom opnieuw opkomende als een potentieel waardevolle site voor islet transplantatie. Dit experiment vereist het isolement van hoge kwaliteit eilandjes en de inplanting van de eilandjes aan de diabetische ontvangers. Transplantatie aan de majus vereist chirurgische stappen die kunnen beter visueel worden aangetoond. Hier is de gedetailleerde stappen voor deze procedure worden gepresenteerd. Twee methoden voor het mengen van de geïsoleerde eilandjes met hydrogel voor het plaatsen van het mengsel in het omental zakje van diabetesmuizen worden hier beschreven. Verschillende hydrogels worden gebruikt voor de verschillende omstandigheden. Niveaus van de glucose van het bloed van syngeneic kleine eilandjes in de majus gegevensontvangers diabetische muis werden gevolgd tot maximaal 35 dagen. Sommige dieren werden opgeofferd na 14 dagen naar immuno-histochemische analyses uit te voeren. Deze aanpak van de pre-klinische transplantatie kan worden gebruikt als voorlopige gegevens aanloop naar vertaling naar klinische transplantatie.
Inleiding
Volgens de internationale Diabetes Federatie (IDF), diabetes mellitus is momenteel invloed op 382 miljoen mensen, met een verwachte toename 592 miljoen mensen van 20351. In beide allogene en XENOGENECELLEN islet transplantatie is systemische immunosuppressieve therapie noodzakelijk. Zonder immunosuppressiva is immuun afwijzing een belangrijke oorzaak van graft verlies2. Er is ook een groot probleem van getransplanteerde islet verlies als gevolg van de onmiddellijke bloed gemedieerde inflammatoire reactie (IBMIR)3,4. Echter, zelfs in de afwezigheid van een immuunrespons zoals syngeneic of auto-transplantatie modellen, in de lever via de portal vein getransplanteerd eilandjecellen verloren gaan als gevolg van ontsteking en/of aan ongunstige omgevingsfactoren, als arme bloed voorzien van verminderde oxygenatie en/of nutriënten5,6. Dientengevolge, met het oog op een langdurige metabole functie, zijn hogere islet nummers nodig om te compenseren voor het verlies van de oorspronkelijke cel dat engraftment7 vermindert.
In een poging om het eilandje engraftment optimaliseren, verschillende alternatieve anatomische sites experimenteel zijn onderzocht, evenals klinisch, met veelbelovende, nog geen definitieve resultaten8. Overwegende dat sommige van de alternatieve sites bieden een gemakkelijke en veilige toegang (bv., huid, nieren, maag submucosa en de capsule anterior kamer van het oog) of een groter oppervlak voor grotere islet massa (bv., peritoneale holte), overleven en fysiologische metabole prestaties van de getransplanteerde eilandjes zijn nog steeds beperkt en blijven een zorg-9. Het zoeken naar een meer geschikte plaats voor islet engraftment loopt.
De majus was een van de vele anatomische sites die werden onderzocht in de vroege ontwikkeling van islet transplantatie, en bleek een succesvolle omgeving voor eilandjes10,11,12,13, 14. Echter, intraportal islet infusie werd de klinische keuze due gedeeltelijk aan de relatieve eenvoud van de procedure en vroege succes in dierlijke modellen6. Ook, gedeeltelijk, de negatieven die is gekoppeld aan deze site, met name massale vroege islet verlies, waren minder begrepen en minder beperken in de vroege dagen van de experimentele islet transplantatie als het veld verviel. Met meer recente dwingende aanwijzingen waaruit blijkt dat intravasculaire islet infusie verre van is ideaal, de majus is opnieuw opkomende als een potentieel waardevolle site voor transplantatie van de cel.
De majus (in de vorm van een omental zakje) biedt relatieve voordelen ten opzichte van de lever15,16. Het is goed gevacuoliseerd en gemakkelijk toegankelijk. Het kunt ophalen van de prothese (indien nodig) en/of een biopsie. De ischemische periode ervaren door de eilandjes is verminderd in vergelijking met de lever en de majus kan relatief grote islet massa die niet mogelijk in de intraportally, waar een stijging van de portal druk kunnen leiden tot complicaties.
Een syngeneic muismodel van transplantatie werd gebruikt in het protocol getest in de studie, dienst C57BL/6 mannelijke muizen tussen 6-8 weken oud met een lichaamsgewicht van 20 – 25 g. Islet ontvangers werden weergegeven met een enkele injectie van streptozotocin met een dosis van 250 diabetische mg/kg ip. De inductie van diabetes kan succesvol worden beschouwd als de bloedglucose niveau van de muis meer dan 24 mmol/L 48 h na injectie is en boven dat niveau voor een minimum van 5 dagen blijft.
Syngeneic eilandjes werden geïsoleerd uit de alvleesklier van leeftijd-matched donoren volgende eerder gepubliceerde methoden met enkele wijzigingen. Kortom, werd de collagenase geïnjecteerd in de galblaas in de plaats van de koker van de gal. Dit werd gedaan als een verbetering ter vergemakkelijking van het gemak van injectie. Collagenase infusie werd gevolgd door incubatie, verstoring van het weefsel, dichtheid verlopende scheiding en hand-picking te verkrijgen pure eilandjes. Eilandjes werden 's nachts gekweekt in CMRL-1066 medium aangevuld met 10% warmte-geïnactiveerd foetale runderserum (FBS) in T175 kolven bij 37 ° C, onder 95% lucht - 5% CO2 vóór de transplantatie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle muizen gebruikt in deze studie werden verkregen uit de medische dier Center van Guangdong provincie. Het gebruik van dieren werd goedgekeurd door de ethische beoordeling Comité van Shenzhen tweede People's Hospital, overeenkomstig de beginselen van het welzijn van dieren.
1. islet transplantatie aan de majus
Opmerking: Dit protocol vereist 2 personen te bereiken.
- Monteren van chirurgische materialen die zijn vermeld in tabel 1. Voorbereiden van aseptische veld in chirurgische gebied met steriele materialen zoals gordijnen en disposables en onderhouden van aseptische condities tijdens chirurgie. Alle chirurgische instrumenten te steriliseren. Steriele jassen dragen.
- Kies de eilandjes met behulp van een 200 µL pipette uiteinde onder de stereomicroscoop. Elke muis ontvangt 450 – 500 Islet gelijkwaardig (IEQ) per tansplant. Voor elk dier, genoeg eilandjes één transplantatie in een tube module-top steriele 1,5 mL met 100 µL van CMRL-1066 medium te plaatsen.
Opmerking: Eilandjes kunnen worden geïsoleerd op de dag van de transplantatie, maar het is beter om te isoleren ze eergisteren dat herstel voor het proces van isolement. - Houd de module-top buizen met eilandjes op ijs totdat u transplantatie.
- Ontdooi de kelder membraan matrix hydrogel en houden het op ijs na het verwijderen uit de diepvries van-20 ° C. De hydrogel bij 4 ° C tot 10 ° C vloeibaar is en stolt bij hogere temperaturen.
- Wegen en alle geadresseerden diabetesmuizen tag. Injecteren van 60 mg/kg pentobarbital natrium intraperitoneally. Test de de diepte van de verdoving door het toedienen van een teen snuifje. Een extra 10 mg/kg pentobarbital natrium geven als het dier op het knijpen reageert. Als er geen trekken van reflex, het niveau van de verdoving klopt voor chirurgie.
- Doekje de chirurgische site op de buik met behulp van 70% ethanol. Scheren van het haar van de site met een razer blade en Desinfecteer de omgeving met Iodophor. Beheren dierenarts zalf voor de ogen om te voorkomen dat droogte terwijl onder verdoving.
- Gebruik de oogheelkundige schaar te openen van de buik langs de middellijn van de buik met een snede van 4 tot en met 5 cm. Zet de darmen aan de linkerkant en bedek met zoute doorweekt gaas om overmatige uitdroging tijdens de operatie procedure te voorkomen.
- Gebruik katoenen wissers volledig bloot het gezichtsveld van de maag en zoek de majus (gevestigd onder de maag). Gebruik twee paar fijne pincet om de majus opzwellen. Zorg om te voorkomen dat schade scheuren.
- De hydrogel is op dit punt volledig ontdooid. Draai de buis met de eilandjes voor 30 s bij 200 x g en verwijder de bovendrijvende substantie. Gecombineerd 50 µL hydrogel, toe te voegen aan de buis met de eilandjes en resuspendeer de mix zachtjes de vorming van luchtbellen vermijden. Houd de buizen op ijs tijdens de procedure.
- Gebruik twee paar pincet te halen van de randen van de majus en het vormen van een groef tussen de wand van de maag en darmen die geschikt is voor een klein volume van de vloeistof met de prothese islet zachtjes te verhogen.
- Laat de tweede persoon bijstaan in de procedure en de geresuspendeerde islet-hydrogel mengsel (de gehele inhoud van de tube) gecombineerd met een 200 µL Pipetteer tip, het leveren van de inhoud in de groef.
- Zorg ervoor dat het mengsel is goed gepositioneerd in de groef door zachtjes verhogen of te verlagen van de randen van de majus. Volledige plaatsing van het mengsel binnen 3 min voordat de hydrogel stolt als gevolg van de lichaamstemperatuur. Nadat de hydrogel ingesteld, vouw de majus ter dekking van de prothese.
Opmerking: de majus zal houden aan de omliggende maag muur, zoals de hydrogel stolt. - Nadat de hydrogel is volledig verhard, gebruik katoenen wissers te verplaatsen van de darmen terug in de buikholte, verzorgen niet te raken van de site van transplantatie.
- Voeg 20 µL van cefalosporine (5 ~ 10 mg) in de buikholte om besmetting te voorkomen, dan gebruik 4-0 hechtdraad om te sluiten van de buik.
- De muis terug naar haar kooi en herhaal alle stappen uit voor elke muis-ontvanger. De muizen warm te houden en visueel volgen totdat ze volledig weer voldoende bewustzijn te handhaven sternale ligcomfort. De muizen gescheiden van andere dieren houden totdat zij volledig zijn hersteld.
- Injecteren 50 µL van cefazolin natrium (0,05 mg/mL) elke dag voor een week als na chirurgie profylaxe. Beheren van Bupivicaine + buprenorfine, d.w.z. toepassen 1-3 druppels van 0,25% Bupivicaine op de site van de incisie topisch vóór plaatsing van wond clips. Beheer van Buprenorphine(0.03 mg/ml with sterile 0.9% saline, 0.05-0.10 mg/kg) via de intraperitoneaal (IP)-route.
- Meten van niet-vasten bloedglucose niveau uit een staart-veneuze bloedmonster met behulp van een bloedglucosemeter eenmaal per dag na de transplantatie. Wanneer transplanteren naar de majus, kan de prothese islet hebben een vertraagde functie en niet het bereiken van een volledig normale bloedglucose niveau 2-3 weken.
- Voor histologie, verwijder de omental prothese van de muis aan het einde van het experiment na de transplantatie. Het weefsel volgens de histologische protocollen vast te stellen. De prothese kan worden geanalyseerd voor immunokleuring of immunofluorescentie studies.
2. alternatieve methode voor transplantatie aan de majus
Opmerking: Een alternatieve fibrine-trombine hydrogel die wordt gebruikt bij kamertemperatuur kan worden vervangen voor de kelder membraan matrix hydrogel. Het bestaat uit 2 componenten, een fibrine sealer eiwit oplossing (50 U/mL trombine en 10 mg/mL fibrinogeen). Wanneer de componenten worden gemengd, vormen ze een klonter die houdt van de eilandjes op zijn plaats.
- Gebruik de samengestelde fibrine-thombin-hydrogel bij kamertemperatuur. Zoals in stap 1.2 ontvangt elke muis 450 – 500 islet equivalenten (IEQ) per transplantatie. Plaats de eilandjes in een tube module-top steriele 1,5 mL met 100 µL van CMRL-1066 medium. Onmiddellijk vóór de transplantatie, gecombineerd de eilandjes in een steriele PE50 buizen voor een lengte van 10 cm en centrifugeer zachtjes (30 bij 200 x g s) vormen een losse pellet.
- Voorbereiding van het dier zoals aangegeven vorenstaand (1.5-1.8 stappen) met de majus verspreid. Mengen van de componenten van de hydrogel (10 µL/elke) en plaats op de majus. (Afbeelding 3D)
- Onmiddellijk verdrijven de eilandjes van de buizen op de hydrogel. De hydrogel maakt een klonter rond de eilandjes. (Figuur 3E)
- Vouw de majus over de hydrogel en de eilandjes vormen een zakje. (Figuur 3F) Verder met stappen 1.13 aan 1.18.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Post-Digestive staat van de alvleesklier wordt weergegeven in figuur 1A. Gezuiverde eilandjes worden weergegeven in figuur 1B. Dithizone kleuring en testen van de levensvatbaarheid van de eilandjes zijn afgebeeld in Figuur 2. De belangrijkste stappen van de islet transplantatie voor de majus zijn afgebeeld in Figuur 3. De niveaus van de glucose van het bloed van de ontva...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Islet transplantatie aan de lever via de portal-ader is de meest gebruikte methode van islet transplantatie bij de mens, maar er zijn nog steeds zorgen voor efficiëntie en veiligheid zoals portal veneuze trombose en lever steatosis17. Recente studies tonen aan dat de majus mogelijk een geschikt alternatief voor de lever, maar er moet meer onderzoek worden verricht voorafgaand aan klinische vertaling12,14,18
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs melden geen belangenconflicten.
Dankbetuigingen
Enkele van de auteurs van dit werk werden deels gesteund door subsidies van nationale toets R & D programma van China (2017YFC1103704), Sanming Project van geneeskunde in Shenzhen (SZSM201412020), Fonds voor hoog niveau medische Discipline bouw van Shenzhen (2016031638), Shenzhen Stichting voor wetenschap en technologie (JCJY20160229204849975, GJHZ20170314171357556, JCYJ20160425110110658), Shenzhen Stichting van gezondheid en gezinsplanning Commissie (SZXJ2017021).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Uitrusting | |||
| 5 inch (12-13 cm) Schaar | RWD Life Science | S12030-11 | |
| Fijne pincetten | RWD Life Science | F11010-13 | |
| Kleine wondclips | RWD Life Science | R33003-01 | |
| Acutenaculum | RWD Life Science | F31044-13 | |
| 2 paar weefselpincetten | RWD Life Science | F13023-10 | |
| 4-0 Naald met hechtdraad | Chenghe, China | 17094 | |
| 200 μL Pipet en tips | Gilson | PN11 | |
| One Touch ultraeasy Basic bloedglucosemonitoringsysteem | Johnson & Johnson | 33391713 | |
| Scheermesje | Philips | HC1099/15 | |
| Materiaal en dieren | |||
| Pentobarbitalnatrium | Sigmaaldrich.com | P3761 | Voor anesthesie |
| Hydrogel | bdbiosciences.com | 356234 | Basement Membrane Matrix |
| Fibrine-Trombinegrostel | Baxter.com | 1501250 | Componenten stollen wanneer ze worden gemengd |
| 70% Ethanol | Yingniu medical, Anhui, China | 23170608 | |
| Iodofoor | Lierkang medical technology, Shangdong, China | 170521 | |
| Normale zoutoplossing | Baxter.com | 2B1324 | |
| Cefalexine | Lukang medical, Shangdong, China | 150303 | |
| Cefazolin | Baxter.com | 2G3508 | |
| smeermiddel oogzalf | Major Pharmaceuticals | 203964 | |
| streptozotocine | Sigmaaldrich.com | S0130 | |
| collagenase Type V | Sigmaaldrich.com | C9262 | |
| CMRL-1066 media | celltrans, Wenzhou, China | X018D1 | |
| histopaque | Sigmaaldrich.com | 10771 | dichtheidsgradiënt |
| PE50 slang | Braintreesci.com | PE50 100 FT | Polyethyleen.023" x.038 |
| Calcein AM | Sigmaaldrich.com | C1359 | |
| Propidiumjodide | Sigmaaldrich.com | P4864 | |
| optimale snijtemperatuur compound (OCT) | Tissue-Tek; Miles, Naperville, IL | 4583 | inbeddingsmedium |
| insuline antilichaam | Cell Signaling Technology, Danvers, MA 01923 | 8138S | |
| hematoxyline kleurmiddel | Cell Signaling Technology, Danvers, MA 01923 | 14166S | |
| eosine kleurmiddel | Beyotime Biotech, China | C0109 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific Inc. | D1306 | |
| C57Bl/6 Muizen | Medical Animal Center of Guangdong Province | / | |
| Foetaal runderserum | GE Healthcare Life Sciences | SH30084 | |
| T175 kolven | Falcon | 353112 | |
| 1,5 mL Snap-topbuisjes | Axygen | MCT-150-C |
Referenties
- Guariguata, L., et al. Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035. Diabetes research and clinical practice. 103 (2), 137-149 (2014).
- Bellin, M. D., et al. Potent Induction Immunotherapy Promotes Long-Term Insulin Independence After Islet Transplantation in Type 1 Diabetes. American Journal of Transplantation. 12 (6), 1576-1583 (2012).
- Moberg, L., et al. Production of tissue factor by pancreatic islet cells as a trigger of detrimental thrombotic reactions in clinical islet transplantation. The lancet. 360 (9350), 2039-2045 (2002).
- Nilsson, B., Ekdahl, K. N., Korsgren, O. Control of instant blood-mediated inflammatory reaction to improve islets of Langerhans engraftment. Current Opinion in Organ Transplantation. 16 (6), 620-626 (2011).
- Bellin, M. D., et al. Similar islet function in islet allotransplant and autotransplant recipients, despite lower islet mass in autotransplants. Transplantation. 91 (3), 367-372 (2011).
- Bruni, A., Gala-Lopez, B., Pepper, A. R., Abualhassan, N. S., Shapiro, A. J. Islet cell transplantation for the treatment of type 1 diabetes: recent advances and future challenges. Diabetes, metabolic syndrome and obesity: targets and therapy. 7, 211(2014).
- Shapiro, A. J., Pokrywczynska, M., Ricordi, C. Clinical pancreatic islet transplantation. Nature reviews Endocrinology. 13 (5), 268-277 (2017).
- Cantarelli, E., Piemonti, L. Alternative transplantation sites for pancreatic islet grafts. Current diabetes reports. 11 (5), 364(2011).
- Cantarelli, E., et al. Murine animal models for preclinical islet transplantation: no model fits all (research purposes). Islets. 5 (2), 79-86 (2013).
- Beli, E., et al. Erratum to: CX3CR1 deficiency accelerates the development of retinopathy in a rodent model of type 1 diabetes. J Mol Med (Berl). 95 (5), 565-566 (2017).
- Hafner, J., et al. Regional Patterns of Retinal Oxygen Saturation and Microvascular Hemodynamic Parameters Preceding Retinopathy in Patients With Type II Diabetes. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (12), 5541-5547 (2017).
- Schmidt, C. Pancreatic islets find a new transplant home in the omentum. Nature Biotechnology. 35 (1), 82017(2017).
- Voigt, M., et al. Prevalence and Progression Rate of Diabetic Retinopathy in Type 2 Diabetes Patients in Correlation with the Duration of Diabetes. Exp Clin Endocrinol Diabetes. , (2017).
- Baidal, D. A., et al. Bioengineering of an Intraabdominal Endocrine Pancreas. New England Journal of Medicine. 376 (19), 1887-1889 (2017).
- Espes, D., et al. Rapid restoration of vascularity and oxygenation in mouse and human islets transplanted to omentum may contribute to their superior function compared to intraportally transplanted islets. American Journal of Transplantation. , (2016).
- Berman, D. M., et al. Bioengineering the endocrine pancreas: intraomental islet transplantation within a biologic resorbable scaffold. Diabetes. 65 (5), 1350-1361 (2016).
- Delaune, V., Berney, T., Lacotte, S., Toso, C. Intraportal islet transplantation: the impact of the liver micro-environment. Transplant International. 30 (3), 227-238 (2017).
- Espes, D., et al. Rapid restoration of vascularity and oxygenation in mouse and human islets transplanted to omentum may contribute to their superior function compared to intraportally transplanted islets. American Journal of Transplantation. 16 (11), 3246-3254 (2016).
- Hajizadeh-Saffar, E., et al. Inducible VEGF expression by human embryonic stem cell-derived mesenchymal stromal cells reduces the minimal islet mass required to reverse diabetes. Scientific Reports. 5, (2015).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
