Method Article

Size Matters: Meting van de Diameter van de Capsule in Cryptococcus neoformans

DOI:

10.3791/57171

⸱

February 27th, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Middle Tennessee State University, 2DRVision Technologies

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De polysaccharide capsule is de primaire virulentiefactor in Cryptococcus neoformans, en haar grootte correleert met de virulentie van de stam. De diameter van de capsule metingen worden gebruikt bij het testen van de fenotypische en te meten van de therapeutische werking. Hier een standaardmethode van capsule inductie wordt gepresenteerd, en twee methoden van kleuring en het meten van de diameter worden vergeleken.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De polysaccharide capsule van Cryptococcus neoformans is de primaire virulentiefactor en een van de meest algemeen studeerde aspecten van deze pathogene gist. Capsule grootte sterk kan verschillen tussen stammen, heeft de mogelijkheid om snel te groeien wanneer ingevoerd om stressvolle of lage nutriënten voorwaarden en heeft al positief gecorreleerd met de virulentie van de stam. Om deze redenen is de grootte van de capsule van groot belang voor C. neoformans onderzoekers. De groei van de C. neoformans capsule wordt veroorzaakt tijdens de fenotypische test om te helpen begrijpen van de effecten van verschillende behandelingen op de gist of grootte verschillen tussen stammen. Hier beschrijven we een van de standaardmethoden voor capsule inductie en Vergelijk twee aanvaarde methoden van kleuring en het meten van de diameter van de capsule: (i) Oost-Indische inkt, een negatieve vlek, gebruikt in combinatie met de lichte microscopie van conventionele en (ii) mede kleuring met fluorescente kleurstoffen van zowel de celwand en de capsule gevolgd door confocale microscopie. Tot slot laten we zien hoe de meting van de diameter van de capsule van de Oost-Indische inkt gebeitste monsters kan worden geautomatiseerd met behulp van computationele beeldanalyse.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Invloed zijn op een kwart miljoen mensen per jaar, wat resulteert in meer dan 180.000 doden jaarlijks is Cryptococcus neoformans een pathogene, intracellulaire gist en de verwekker van cryptococcosis1,2, 3. zwaarst getroffen zijn HIV-positieve patiënten in arme landen die niet hebben klaar toegang tot antiretrovirale therapie, waardoor ze zeer gevoelig voor de ziekte4,5,6. Gegevens van de CDC blijkt dat in sub-Saharisch Afrika, C. neoformans meer mensen dan tuberculose jaarlijks en meer elke maand dan een Ebola-uitbraak op record1 doodt. De meest voorkomende route van blootstelling treedt op tegen het inademen van gedroogde sporen die gemeengoed in de omgeving-7 zijn. Bij binnenkomst van de longen, zijn er verschillende Virulentiefactoren die aan het succes van C. neoformans binnen besmette personen bijdragen. De polysaccharide capsule wordt beschouwd als de microbe van primaire virulentiefactor, aangezien acapsular stammen niet virulente8.

De cryptococcal capsule bestaat uit drie onderdelen van het principe: glucuronoxylomannan (GXM), galactoxylomannan (GalXM), en mannoproteins (MPs)9. Terwijl MPs een relatief kleine celwand-geassocieerde onderdeel van de capsule zijn, ze zijn immunogeen en een meestal pro-inflammatoire respons9,10kunnen bevorderen. In tegenstelling, GXM en GalXM maken het grootste deel van de capsule (> 90% van het gewicht) en immunosuppressieve effecten11hebben. Naast de immunomodulerende gevolgen ervan creëert de snelle uitbreiding van de capsule in vivo een mechanische barrière naar inname door gastheer fagocytische cellen (dat wil zeggen, neutrofielen en macrofagen)12. De capsule C. neoformans en de synthese zijn complex, maar overall, verhoogde capsule diameter is gecorreleerd met verhoogde virulentie6,13,14. Gezien dit, is het belangrijk voor C. neoformans onderzoekers om snel en nauwkeurig kwantificeren capsule metingen te kunnen.

Zowel de cel C. neoformans en haar polysaccharide capsule zijn dynamische structuren en wijzigingen weergeven over tijd15. De capsule kunt wijzigen in dichtheid, de grootte en vergadering in reactie op veranderingen in het ontvangende milieu16,17,18. Laag ijzer of nutriëntengehalten, blootstelling aan serum, de menselijke fysiologische pH en verhoogde CO2 zijn bekend tot capsule groei16,18,19,20. Verder, onderzoekers hebben aangetoond structurele veranderingen ten gevolge aanzienlijke verschillen in de immunoreactivity tijdens een infectie, leningen een voordeel aan C. neoformans over de Heerscharen21,22. Dit is bekend omdat de architectuur van de capsule C. neoformans heeft geanalyseerd in een verscheidenheid van manieren. Elektronenmicroscopie, bijvoorbeeld, is gebleken dat de capsule een heterogene matrix met een elektron-dichte binnenlaag onder een buitenste, meer doorlatende laag23 heeft. Lichtverstrooiing en het gebruik van optisch pincet hebben onderzoekers verder het ophelderen van de macromoleculaire eigenschappen24toegestaan. Het analyseren van de resultaten uit beide metingen van statische en dynamische lichtverstrooiing, weten we dat de polysacharide capsule een complexe vertakkende structuur23 heeft. Optisch pincet zijn gebruikt om de test van de stijfheid van de structuur, alsmede het evalueren van de antistof reactiviteit24. Maar is verreweg het vaakst werkzaam analyse van de capsule C. neoformans de meting van de grootte.

Om te kwantificeren capsule grootte, onderzoekers gebruiken wat moet een eenvoudige meting: de lineaire diameter van de capsule. Digitale microscopen worden gebruikt om beelden van meerdere C. neoformans cellen (in het algemeen honderden) gekleurd met Oost-Indische inkt of fluorescente kleurstoffen te vangen. De grootte van elke cel lichaam en omliggende capsule wordt gemeten. De gegevens zijn samengesteld, en de gemiddelde diameter van de capsule wordt berekend door de diameter van de cel lichaam van de diameter van de gehele cel (cel lichaam + capsule) af te trekken. Tot dit punt, zijn deze metingen gedaan handmatig. Terwijl in het algemeen nauwkeurig, heeft deze methode nadelen voor onderzoekers. Grote gegevenssets kunnen nemen dagen of zelfs weken te analyseren met de hand. En omdat deze metingen zijn handmatig gedaan, subjectiviteit en menselijke fouten het resultaat kunnen beïnvloeden.

Geautomatiseerde computationele beeldanalyse is een onmisbaar hulpmiddel geworden voor onderzoekers op vele terreinen van moleculaire celbiologie, waardoor snellere en meer betrouwbare analyse van biologische beelden 25,26,27. Nauwkeurige beeld analysetechnieken zijn nodig om de kwantitatieve gegevens uit wat vaak complexe en enorme gegevenssets zijn. Echter, sommige metingen, met name het meten van C. neoformans capsule, moeilijk geweest te automatiseren. De interface tussen de celwand en capsule, die over het algemeen wordt weergegeven als een donkere ring wanneer beeld door fase contrast microscopie, nauwkeurig te identificeren kan worden lastig op te lossen met behulp van een eenvoudige drempel. Verder, C. neoformans cellen in cultuur de neiging om het groepje samen en nauwkeurige segmentatie van de cellen is noodzakelijk voor nauwkeurige metingen.

Het doel van dit project was om (i) illustreren een van de standaard protocollen voor capsule inductie in C. neoformans, (ii) vergelijken en contrast Oost-Indische inkt en fluorescentie kleuring als ze betrekking hebben om de capsule van de diameter van de metingen, (iii) de ontwikkeling van eenvoudige, computationele methoden voor het meten van de diameter van de capsule met behulp van beelden van de Oost-Indische inkt gekleurd cellen met behulp van de software van de analyse van een afbeelding, en (iv) beoordeling van de voordelen en beperkingen van het meten van de diameter van de capsule handmatig en met behulp van de software automation. Wij vinden dat de kleuring gemakkelijkst, fluorescerende etikettering van de celwand en capsule, terwijl meer tijd in beslag, de meest consistente resultaten tussen experimenten opgeleverd. Echter beide methoden ingeschakeld ons succesvol onderscheiden tussen lab en klinische C. neoformans capsule spanningen vertonen verschillende maten. Verder konden we automatiseren de meting van de diameter van de capsule van de Oost-Indische inkt gekleurde beelden en vond dat dit een levensvatbaar alternatief voor handmatige meting van de capsule.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opmerking: C. neoformans is een ziekteverwekker Biosafety Level 2 (BSL-2) en onderzoekers die werken met het juiste voorzorgsmaatregelen moeten nemen. Gedetailleerde procedures over hoe te veilig werken met BSL-2 ziekteverwekkers kan worden gevonden op het Center for Disease Control (CDC) website, maar het is belangrijk op te merken dat alle personen die in contact C. neoformans komen goed moeten worden opgeleid in behandeling ziekteverwekkers en altijd passende persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM), over het algemeen latex of nitril handschoenen moet dragen. Verder moeten de rotoren op centrifuges om te voorkomen dat aerosolization van monsters en eventuele lekkages opgeruimd onmiddellijk met behulp van een 10% bleekwater oplossing28worden verzegeld.

1. de capsule inductie

Opmerking: Alle stappen moeten worden uitgevoerd bij kamertemperatuur tenzij anders vermeld.

  1. C. neoformans in Gist-pepton dextrose (YPD) Bouillon (pH 6,5 +/-0.2) cultuur en Incubeer bij 37 ° C met schudden tot ze in logboek fase (ongeveer 18-36 h).
  2. Centrifugeer cellen bij 870 x g gedurende 5 minuten bij 21 ° C en spoel driemaal met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
  3. Gebruik een hemocytometer (of een geautomatiseerde cel teller) om te rekenen van de cellen en resuspendeer bij 2 x 105 cellen/2 mL in Dulbecco van minimale essentiële media (DMEM).
  4. Om de capsule, Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2 voor 18u.
    Opmerking: De combinatie van het ontbreken van voedingsstoffen in de media en de aanwezigheid van CO2 C. neoformans capsule groei stimuleert.
  5. Na incubatie, oogsten van de cellen door centrifugeren (zoals hierboven) en het verwijderen van alle, maar 5-10 µL supernatant. Op hetzelfde moment, de oogst een overeenkomstige un-geïnduceerde cel steekproef voor elke spanning te meten. Gebruik deze als negatieve controles.
    Opmerking: De cel pellets zullen zeer klein en moeilijk te zien. Wees voorzichtig bij het zuigen supernatant.
  6. Vlek met Oost-Indische inkt (punt 2.1) of fluorescente kleurstoffen (punt 2.2).

2. kleuring

  1. Kleuring met alleen Oost-Indische inkt
    1. Om de gist met Oost-Indische inkt vlekken, resuspendeer de pellet in het resterende supernatant en toevoegen van 4μL (ongeveer de helft) van celsuspensie en 4μL voor Oost-Indische inkt op een glasplaatje Microscoop. Voorzichtig mengen en Vermijd schuimvorming.
    2. Breng een dekglaasje van 13 mm glas aan (#1.5 dikte) en verzegel randen met een niet-toxisch sealant (duidelijk nagellak) om te voorkomen dat het monster uitdrogen.
  2. Kleuring met alleen fluorescente kleurstoffen
    1. Om de gist met een fluorescente kleurstof vlek, resuspendeer de pellet cel in 50 µL PBS met 1% bovien serumalbumine (BSA).
    2. Incubeer de cultuur met een gelijk volume Calcofluor wit (CFW) (1 µg/mL) en capsule mAb 18B7 (Zie Tabel van materialen) geconjugeerd met AlexaFluor488 (AF488) (10 µg/mL) gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
    3. Centrifugeer cellen bij 870 x g gedurende 5 minuten bij 21 ° C na incubatie en supernatant gecombineerd.
    4. Resuspendeer de pellet cel in 10 µL PBS met 1% bovien serumalbumine (BSA).
    5. Pipetteer 8 µL celsuspensie op een glasplaatje Microscoop.
    6. Breng een dekglaasje van 13 mm glas aan (#1.5 dikte) en verzegel randen met een niet-toxisch sealant (duidelijk nagellak) om te voorkomen dat het monster uitdrogen.
  3. Kleuring met zowel Oost-Indische inkt en fluorescente kleurstoffen
    1. Als u wilt meer direct vergelijken de werkzaamheid van de Oost-Indische inkt vlekken die van fluorescente kleurstoffen, vlek mede de dezelfde celpopulatie met beide soorten van de vlek. Om dit te doen, incubeer eerste cellen met zowel een TL capsule en de celwand vlek, volgens stappen 2.2.1 - 2.2.3.
    2. Pipetteer vervolgens gelijk volumes (4 µL) van de fluorescently gebeitst celsuspensie en de Oost-Indische inkt op een glasplaatje. Voorzichtig mengen.
    3. Breng een dekglaasje van 13 mm glas aan (#1.5 dikte) en verzegel de randen met een niet-toxisch sealant (duidelijk nagellak) om te voorkomen dat het monster uitdrogen.

3. image Acquisition/microscopie

  1. Imaging cellen gekleurd met Oost-Indische inkt.
    1. Verwerven van beelden met behulp van een standaard lichte Microscoop (100 X vergroting).
    2. Het imago van een minimum van 50 cellen per voorwaarde.
      Opmerking: Het aantal cellen per veld zal variëren, en dit is aanvaardbaar. Het is belangrijk, echter dat overlappende cellen worden bewaard bij een minimum, zoals deze moeilijk zijn te meten (zowel handmatig als met geautomatiseerde software). Voor deze experimenten, werden beelden verkregen op een diepte van 16 bits met belichtingstijden geoptimaliseerd om het afbeeldingscontrast te maximaliseren terwijl het minimaliseren van de onscherpte veroorzaakt door kleine bewegingen van de cellen.
  2. Imaging cellen gekleurd met fluorescente kleurstoffen
    1. Naar image de cellen door fluorescentie microscopie, open de Microscoop denkbaar software en selecteer de juiste excitatie en emissie golflengten voor de fluorophores gebruikt (CFW en AF488 zijn opgewekt met behulp van de 405nm en 488 nm verlichting, respectievelijk). Verwerven van beelden met behulp van een fluorescentie Microscoop.
    2. Het imago van een minimum van 50 cellen per voorwaarde.
      Opmerking: Het aantal cellen per veld zal variëren, en dit is aanvaardbaar. Het is belangrijk, echter dat overlappende cellen tot een minimum worden gehouden, zoals deze moeilijk zijn te meten (zowel handmatig als met geautomatiseerde software).
    3. Verwerven van een z-stack afbeelding serie van de cellen om ervoor te zorgen dat de maximale capsule diameter voor elke cel binnen een bepaald gebied wordt verkregen.
      1. In de software van de controle van de Microscoop, klik op de balk "z-stack" openstellen van het "z-stack" control panel en selecteer de optie van de "Eerste/laatste" in de linker bovenhoek van het paneel.
      2. Gebruik de schone-focus controle op de Microscoop te concentreren op een niveau dat lager is dan het breedste punt van een enkele gistcel en de capsules voor alle binnen het gezichtsveld van de huidige en klik op "Eerste instellen".
      3. De fine-focus controle te richten boven het breedste punt van de cel lichaam van dezelfde cel en de capsule voor alle cellen binnen het gezichtsveld van de huidige en klik op "Instellen Last".
      4. Klik vervolgens op "Start Experiment" op het tabblad van de "Overname" te verwerven van de z-stack voor de huidige positie. Herhaal de procedure op meerdere posities tot z-stack beelden van een minimum van 50 cellen zijn verkregen.
        Opmerking: Bij deze experimenten, was de confocal pinhole ingesteld op 1.0 AU en een overlappende z-Reeksen van 10-20 segmenten die betrekking hebben op elk 0,7 µM werden verworven op de geselecteerde posities. AU = luchtige eenheid.
    4. Vervolgens converteren naar elke z-stack serie maximumlichtsterkte projecties (MIP) met behulp van de software van de analyse van de juiste afbeelding.
      Opmerking: MIPs project de grootste intensiteit op elk vliegtuig van de afbeelding van de gestapelde29. Creëren van MIPs kan men voor de productie van een 2D-weergave van beelden die met de maximale cel en de capsule diameter binnen de vastgelegde 3D-stack corresponderen.
  3. Imaging cellen gekleurd met zowel Oost-Indische inkt en fluorescente kleurstoffen
    1. Verwerven van beelden met behulp van een widefield (40 X vergroting) of de confocal microscoop (63 X of 100 X vergroting). Voor cellen gekleurd met zowel Oost-Indische inkt en fluorescente kleurstoffen, opnamen met behulp van een widefield Microscoop uitgerust met een computergestuurde toneel- en olie-immersie-doelstelling.
      Opmerking: De Microscoop in gebruik moet worden gecontroleerd met behulp van een imagingsoftware CFW. fluorescentie die wordt opgewekt door een filter van 340-380 nm excitatie en uitgestraalde licht moet worden gedetecteerd door een 435-485 nm barrière filter weerkaatst door een dichroïde spiegel van 400 nm. AF488 fluorescentie kan worden opgewekt door een filter van 465-495 nm excitatie en uitgestraalde licht kan worden opgespoord door een 515-555 nm barrière filter weerkaatst door een 505-nm dichroïde spiegel.
    2. Het imago van een minimum van 50 cellen per voorwaarde voor elke kleuringstechniek.

4. handmatige meting van de Capsule

  1. Voor cellen gekleurd met Oost-Indische inkt of fluorescerende vlekken, een cel meting software handmatig maatregel capsule en cel diameter te gebruiken (Zie Tabel van materialen). Om dit te doen, ga naar 'Bestand' > "Open afbeelding" > "Maatregel" en gebruik de cursor om een rechte lijn door het breedste punt van de hele cel (totale diameter) tekenen.
  2. Vervolgens klikt u opnieuw op "Maatregel" en teken een rechte lijn door het lichaam van de cel (de diameter van de cel lichaam).
    Opmerking: Metingen worden automatisch opgeslagen op de cellen.
  3. Herhaal dit proces voor alle cellen (minimaal 50/groep).
  4. Als beelden wilt opslaan zodra zij worden gemeten, klik op "Bestand" > "Save As" en de naam van de afbeeldingen op de juiste manier.
  5. Selecteer de zojuist gemeten bestanden en gegevens exporteren naar een spreadsheet-software.
  6. Berekenen van de gemiddelde diameter van de capsule met behulp van de vergelijking: ([totale doorsnede] - [de diameter van de cel lichaam]).

5. geautomatiseerde meting van de Capsule

Opmerking: Voor succesvolle geautomatiseerde meting, gebruikt u 16-bits afbeeldingen met een hoog contrast en die zijn goed gericht samen met de software van de analyse van een passende afbeelding (Zie Tabel van materialen). Wanneer imaging C. neoformans voor capsule meting, is het belangrijk om zich te concentreren op de donkere ring op de grens tussen de celwand en de capsule. Hierdoor kan de software af te bakenen correct de cel en de capsule.

  1. Omkeren en een kopie maken van alle Oost-Indische inkt gekleurd cel beelden met behulp van een geschikte software voor het bewerken van afbeeldingen (Zie Tabel van materialen). Om dit te doen, klikt u op 'Bestand' > 'Open' te openen van de Oost-Indische inkt gekleurde beelden en vervolgens "Control" + "I" om de afbeelding omkeren. Klik op "Bestand" > "Save As" om de omgekeerde beeld te bewaren.
  2. Afbeeldingen in de software importeren van zowel de oorspronkelijke als de omgekeerde Klik op "Bestand" > "Importeren Sequence" > "Load Image" > "Definiëren volgnummer (handmatig)" > "Afmetingen (kanaal)" > "Import" > "Apply".
    Opmerking: De C. neoformans cel organen en capsules kunnen worden geïdentificeerd en gemaskeerd met behulp van specifieke algoritmen - hierna aangeduid als 'recepten' - opgenomen in de software.
  3. Het recept 'Kolonie Analyzer (fluorescentie)' op de omgekeerde afbeelding gebruiken om te detecteren en de cel lichaam te maskeren, dan klik op "apply". In de omgekeerde afbeelding wordt de donkere ring definiëren de celgrens C. neoformans helderder dan de omliggende capsule.
  4. Gebruik het recept van de 'Kolonie Analyzer (fluorescentie)' op de omgekeerde afbeelding te segment van de C. neoformans cel organen uit hun capsules, dan klik op "apply". Hiermee maakt u een masker graaf. Wijzig de naam van dit masker graaf "Cel lichaam" door met de rechtermuisknop op het tabblad met het label "graaf mask".
    Opmerking: Het recept bestaat uit meerdere stappen voor beeldverwerking: achtergrond verwijderen, object detectie object scheiding en subset filteren.
  5. Vervolgens het recept 'Celproliferatie' op de oorspronkelijke afbeelding gebruiken om te detecteren en maskeren de capsule en klik op "apply". Hiermee maakt u een masker graaf. Wijzig de naam van dit masker graaf "Capsule" door met de rechtermuisknop op het tabblad met het label "graaf mask".
  6. Met behulp van het recept, 'Capsule verdeling', het maken van een nieuwe masker op de oorspronkelijke afbeelding om te partitioneren van aangrenzende capsules uit elkaar. Om dit te doen, klik op "Capsule partitie" van het recept dropdownmenu. Kies in het vak Capsule partitie het masker nu omgedoopt tot graaf "Capsule" (5.5) voor Capsule regio. Kies het masker nu omgedoopt tot graaf "Cel lichaam" voor Crypto cellen (5.4). Kies "Original" voor het invoerkanaal, en "Create Mask voor Partitioned Capsule. Klik op "Apply
    Opmerking: Het recept genereert cel en capsule diameter, gedefinieerd als het gemiddelde van de langste en kortste assen overschrijding van het midden van de cel en capsule en metingen van het gebied van detectie maskers. Vind de uitgang die is gelegen onder het tabblad van het werkblad in deze software. Herhaal dit proces voor alle afbeeldingen (minimaal 50 cellen/groep). Het recept van parameters kunnen worden afgestemd om te optimaliseren detectie van afzonderlijke beelden of geoptimaliseerd voor batch detectie van meerdere afbeeldingen. Aanvullende metingen kunnen worden berekend door het recept voor uitgebreide karakterisering van de cel en de capsule morfologie.
  7. Gegevens exporteren naar een spreadsheet-software van keuze voor verdere analyse.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ter illustratie van de capsule inductie, cel kleuring, imaging en meettechnieken, gebruikten we drie stammen van C. neoformans: het gemeenschappelijk, goed gekarakteriseerd laboratorium stam, H99S30, en twee klinisch geïsoleerde stammen van eerder onbekende capsule diameter, B18 en B5231.

De workflow van de capsule inductie, kleuring en beeldacquisitie met Oost-Indische in...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De capsule is al decennia een belangrijk aandachtspunt van het onderzoek voor zowel mycologen en clinici geïnteresseerd in C. neoformans en cryptococcosis vanwege zijn rol als een belangrijke virulentiefactor voor het pathogene agens oplevert. Met behulp van microscopie te meten van verschillen in capsule grootte tussen stammen en onder verschillende groei kunnen voorwaarden bieden belangrijke informatie over het pathogene agens en de reacties op verschillende stimuli (d.w.z., verschillende milieu-omsta...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteur, Hoyin Lai, is de productmanager bij DRVision die door de software van de analyse van geautomatiseerde beeld, Moondragon worden gepubliceerd.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken de moleculaire Biosciences (MOBI) doctorale programma en de biologie-afdeling op Middle Tennessee State University (MTSU) voor het verstrekken van de financiering voor deze studie. Het project werd ook gedeeltelijk gefinancierd door een speciale projecten subsidie toegekend aan D.E.N. door de MTSU Foundation.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Capsule Inductie
C. neoformans cellenDe klinische lab stam, H99S, was een vriendelijke gift van Dr. John Perfect (Duke University).  De klinische stammen, B18 en B52, waren vriendelijke geschenken van Dr. Greg Bisson (University of Pennsylania). 
Gist Pepton Destrose Bouillon (YPD)Fisher ScientificDF0428-17-5
Fosfaat Buffered Saline (PBS)Dit wordt in het lab gemaakt volgens standaard recept (137mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4O, 2 mM Kh2PO4O)
DMEM/hoge glucose met L-glutamine, zonder natriumpyruvaatGE Life SciencesSH30022.01
6-well platenFalconCL5335-5EA
Schudende incubatorThermo Scientific MaxQ6000
CO2 incubatorFisher ScientificIsotemp
CentrifugeThermo ScientificLegend XTR
Kleuren
MicrocentrifugeThermo ScientificLegend Micro 21R
India inktFisher Scientific14-910-56
Calcofluor witSigma-Aldrich18909-100ML-F
18B7 muis anti-GXM antilichaam geconjugeerd aan Alexafluor 488Een vriendelijke gift van Dr. Arturo Casadevall (Johns Hopkins University) 
PBS met 1% Bovine Serum Albumine (BSA)PBS is hetzelfde recept als hierboven vermeld (regel 4) met 1% BSA toegevoegd en filter gesteriliseerd.
Bovine Serum AlbumineSigma-AldrichA9418
Superfrost microscoopglazenFisher Scientific12-550-143
Glazen dekseltjesCorning2855-18#1.5 dikte
Doorzichtige nagellak of andere niet-giftige verzegelingsmiddel
Beeldverwerving 
ImmersieverlofsvloeistofCargille 16484
Lichtmicroscoop met immersieverlofsobjectiefZeissZeiss Axio A1 met een Plan - NEOFLUAR 100x olievloersvergroting NA 1.30 objectief
Lichtmicroscoop cameraZeissZeiss Axiocam ErCD camera
Confocale microscoop met olievloersvergrotingsobjectiefZeissLSM 700 laser scanning confocal uitgerust met een Plan-Apochromat 63X NA 1.4 olievloersvergroting DIC M27 objectief. 
Confocale microscoop softwareZen 2009
Confocale microscoop cameraNikonNikon Ti-Eclipse met een Intensilight epifluorescente verlichting (Nikon), CoolSNAP MYO microscoopcamera (Photometrics), Plan Apo 60x NA 1.40 olievloersvergroting objectief (Nikon) en 1.5x vergrotingsveranderaar. 
Widefield beeldvormingssoftwareNikon Elements (Nikon)
Capsule Meting
BeeldbewerkingssoftwarePhotoshop (Adobe)
Microscoopsoftware voor handmatige metingAxiovision (Carl Zeiss)
Beeldanalysesoftware voor geautomatiseerde metingAivia (DRVision Technologies)
Spreadsheet softwareExcel (Microsoft)

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Park, B. J., et al. Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS. AIDS. 23 (4), 525-530 (2009).
  2. Coelho, C., Bocca, A. L., Casadevall, A. The intracellular life of Cryptococcus neoformans. Annu Rev Pathol. 9, 219-238 (2014).
  3. Rajasingham, R., et al. Global burden of disease of HIV-associated cryptococcal meningitis: an updated analysis. Lancet Infect Dis. 17 (8), 873-881 (2017).
  4. Limper, A. H., Adenis, A., Le, T., Harrison, T. S. Fungal infections in HIV/AIDS. Lancet Infect Dis. 17 (11), e334-e343 (2017).
  5. Casadevall, A. Crisis in Infectious Diseases: 2 Decades Later. Clin Infect Dis. 64 (7), 823-828 (2017).
  6. McClelland, E. E. C., Eisenmann, A., H, Ch 6. New Insights in Medical Mycology. , Springer. Netherlands. 131-157 (2007).
  7. Leopold Wager, C. M., Wormley, F. L. Jr Classical versus alternative macrophage activation: the Ying and the Yang in host defense against pulmonary fungal infections. Mucosal Immunol. 7 (5), 1023-1035 (2014).
  8. Kwon-Chung, K. J., Rhodes, J. C. Encapsulation and melanin formation as indicators of virulence in Cryptococcus neoformans. Infect Immun. 51 (1), 218-223 (1986).
  9. Vecchiarelli, A., et al. Elucidating the immunological function of the Cryptococcus neoformans capsule. Future Microbiol. 8 (9), 1107-1116 (2013).
  10. Murphy, J. W. Influence of cryptococcal antigens on cell-mediated immunity. Rev Infect Dis. 10 Suppl 2, S432-S435 (1988).
  11. Cherniak, R., Morris, L. C., Belay, T., Spitzer, E. D., Casadevall, A. Variation in the structure of glucuronoxylomannan in isolates from patients with recurrent cryptococcal meningitis. Infect Immun. 63 (5), 1899-1905 (1995).
  12. Collins, H. L., Bancroft, G. J. Encapsulation of Cryptococcus neoformans impairs antigen-specific T-cell responses. Infect Immun. 59 (11), 3883-3888 (1991).
  13. Yasuoka, A., Kohno, S., Yamada, H., Kaku, M., Koga, H. Influence of molecular sizes of Cryptococcus neoformans capsular polysaccharide on phagocytosis. Microbiol Immunol. 38 (11), 851-856 (1994).
  14. Robertson, E. J., et al. Cryptococcus neoformans ex vivo capsule size is associated with intracranial pressure and host immune response in HIV-associated cryptococcal meningitis. J Infect Dis. 209 (1), 74-82 (2014).
  15. Cordero, R. J., Bergman, A., Casadevall, A. Temporal behavior of capsule enlargement by Cryptococcus neoformans. Eukaryot Cell. 12 (10), 1383-1388 (2013).
  16. O'Meara, T. R., Alspaugh, J. A. The Cryptococcus neoformans capsule: a sword and a shield. Clin Microbiol Rev. 25 (3), 387-408 (2012).
  17. McClelland, E. E., Smith, J. M. Gender specific differences in the immune response to infection. Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis. 59 (3), (2011).
  18. McClelland, E. E., Perrine, W. T., Potts, W. K., Casadevall, A. Relationship of virulence factor expression to evolved virulence in mouse-passaged Cryptococcus neoformans lines. Infect Immun. 73 (10), 7047-7050 (2005).
  19. Zaragoza, O., Fries, B. C., Casadevall, A. Induction of capsule growth in Cryptococcus neoformans by mammalian serum and CO(2). Infect Immun. 71 (1), 6155-6164 (2003).
  20. Vartivarian, S. E., et al. Regulation of cryptococcal capsular polysaccharide by iron. J Infect Dis. 167 (1), 186-190 (1993).
  21. McFadden, D. C., Fries, B. C., Wang, F., Casadevall, A. Capsule structural heterogeneity and antigenic variation in Cryptococcus neoformans. Eukaryot Cell. 6 (8), 1464-1473 (2007).
  22. Garcia-Hermoso, D., Dromer, F., Janbon, G. Cryptococcus neoformans capsule structure evolution in vitro and during murine infection. Infect Immun. 72 (6), 3359-3365 (2004).
  23. Gates, M. A., Thorkildson, P., Kozel, T. R. Molecular architecture of the Cryptococcus neoformans capsule. Mol Microbiol. 52 (1), 13-24 (2004).
  24. Pontes, B., Frases, S. The Cryptococcus neoformans capsule: lessons from the use of optical tweezers and other biophysical tools. Front Microbiol. 6, 640(2015).
  25. Shen, H., et al. Automated tracking of gene expression in individual cells and cell compartments. J R Soc Interface. 3 (11), 787-794 (2006).
  26. Dorn, J. F., Danuser, G., Yang, G. Computational processing and analysis of dynamic fluorescence image data. Methods Cell Biol. 85, 497-538 (2008).
  27. Nketia, T. A., Sailem, H., Rohde, G., Machiraju, R., Rittscher, J. Analysis of live cell images: Methods, tools and opportunities. Methods. , 65-79 (2017).
  28. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , Centers for Disease Control and Prevention, Government Printing Office. Atlanta, GA. 33-38 (2015).
  29. Kwon, O., Kang, S. T., Kim, S. H., Kim, Y. H., Shin, Y. G. Maximum intensity projection using bidirectional compositing with block skipping. J Xray Sci Technol. 23 (1), 33-44 (2015).
  30. Janbon, G., et al. Analysis of the genome and transcriptome of Cryptococcus neoformans var. grubii reveals complex RNA expression and microevolution leading to virulence attenuation. PLoS Genet. 10 (4), e1004261(2014).
  31. Bisson, G. P., et al. The use of HAART is associated with decreased risk of death during initial treatment of cryptococcal meningitis in adults in Botswana. J Acquir Immune Defic Syndr. 49 (2), 227-229 (2008).
  32. van Teeffelen, S., Shaevitz, J. W., Gitai, Z. Image analysis in fluorescence microscopy: bacterial dynamics as a case study. Bioessays. 34 (5), 427-436 (2012).
  33. Granger, D. L., Perfect, J. R., Durack, D. T. Virulence of Cryptococcus neoformans. Regulation of capsule synthesis by carbon dioxide. J Clin Invest. 76 (2), 508-516 (1985).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cryptococcus neoformansCapsule DiameterIndia Ink StainingFluorescent Dye StainingConfocal MicroscopyLight MicroscopyAutomated Image AnalysisCapsule InductionYeast Cell MeasurementZ Stack Imaging

Related Articles