Detectie van wasmiddel-gevoelige interacties tussen membraaneiwitten

Samenvatting

Beschrijven we een protocol voor de detectie van wasmiddel-gevoelige interacties tussen membraaneiwitten binding van de sorteer-receptor, sortilin, aan de eerste luminal lus van de glucose transporter proteïne, GLUT4, waarbij als voorbeeld.

Samenvatting

Ons vermogen om te verkennen van eiwit-eiwitinteractie is de sleutel tot het begrijpen van regelgevende verbindingen in de cel. Detectie van eiwit-eiwitinteractie in veel gevallen is echter geassocieerd met significante experimentele uitdagingen. In het bijzonder, interageren Sorteer receptoren met hun lading van de eiwitten in het lumen van het membraan compartimenten vaak in een wasmiddel-gevoelige mode, waardoor co-immunoprecipitation van deze proteïnen onbruikbaar. Binding van het sorteren receptor sortilin aan glucose transporter die glut4 als een voorbeeld van zwakke luminal interacties tussen membraaneiwitten dienen kan. Hier beschrijven we een snelle, eenvoudige en goedkope assay voor het valideren van de interactie tussen sortilin en GLUT4. Wij hebben daarvoor ontworpen en chemisch gesynthetiseerd het myc-gelabeld peptide overeenkomt met de potentiële sortilin-bindende epitoop in het luminal deel van GLUT4. Gelabeld met zes histidines Sortilin was uitgedrukt in zoogdiercellen en geïsoleerd van cel lysates met behulp van kobalt kralen. Sortilin geïmmobiliseerd op de parels was geïncubeerd met de peptide oplossing bij verschillende pH-waarden, en het eluted materiaal werd geanalyseerd door het westelijke bevlekken. Deze test kan gemakkelijk aangepast worden aan andere wasmiddel-gevoelige eiwit-eiwitinteractie te bestuderen.

Inleiding

GLUT4 is een glucose transporter proteïne die overwegend wordt uitgedrukt in vet en skeletale spiercellen, waar het het effect van de insuline op postprandiale bloed glucose goedkeuring¹bemiddelt. Wordt een zeer stabiele eiwitten, is GLUT4 op een posttranslationele niveau geregeld. Bij gebrek aan insuline, GLUT4 is grotendeels uitgesloten uit het plasma-membraan (vandaar lage basale permeabiliteit voor glucose) en is gelokaliseerd vooral binnen de cel in kleine insuline-responsieve blaasjes (IRVs) en trans-Golgi network (TGN) die dreigt te vertegenwoordigen de IRV donor compartiment. Op insuline toediening, de IRVs zekering met het plasma-membraan en GLUT4 leveren op de site van de werking ervan. Dit verhoogt de permeabiliteit van het plasma-membraan voor glucose, zodat dat glucose-opname uit bloed in adipocytes en skeletale myocytes 10 tot 40-fold stijgt. Na de terugtrekking van de insuline, is GLUT4 geïnternaliseerd in vroege/sorteren Endosomen en vervolgens opgehaald voor TGN waar de IRVs zich opnieuw gevormd. Beide sorteren stappen in het GLUT4 traject, d.w.z. wegnemen uit de perifere vroege Endosomen tot het perinuclear TGN, en de vorming van de IRVs op de TGN donor membranen zijn ingeschakeld door een familielid van Vps10p, sortilin, die een type vertegenwoordigt I transmembraan eiwit en een sorteer receptor. Volgens één model, sortilin werkt als een transmembraan steiger eiwit: het GLUT4 in het lumen van de Endosomen en TGN bindt, en werft adapters van de retromer of clathrin naar de cytoplasmatische kant van de donor membraan via haar C-terminus^{2, 3}. Dit vergemakkelijkt de verdeling van de GLUT4 in vesiculaire dragers die GLUT4 tussen de intracellulaire compartimenten translocate.

De interactie van de cytoplasmatische staart van sortilin met retromer en verschillende adaptor eiwitten is goed gedocumenteerd. Echter, de binding van sortilin naar GLUT4 (en op een aantal van haar andere proteïne liganden) heeft zijn uitdagend om te bewijzen. In het bijzonder, pogingen om te co-immunoprecipitate sortilin en GLUT4 niet gelukt waarschijnlijk te wijten aan het wasmiddel-gevoelige aard van de interactie tussen deze twee eiwitten. Bovendien, als een typische transporter proteïne, heeft GLUT4 12 transmembraan domeinen en 6 luminal loops elke mogelijke combinatie van die potentieel een sortilin-bindende site vertegenwoordigen kan. Op hetzelfde moment, een grote hoeveelheid indirect bewijs, zoals aanzienlijke co lokalisatie in de cel, dwarsbinding met membraan-permeabele DSP, en de interactie in gist twee hybridesysteem suggereren dat sortilin kan binden aan de GLUT4. Bovendien hebben gebruikt de laatste benadering in een combinatie met de alanine scannen mutagenese, wij eerder vastgesteld dat het domein van de Vps10p van sortilin voornamelijk aan de eerste luminal lus van GLUT4 bindt. Echter, het bewijs van een dergelijke interactie in zoogdiercellen heeft ontbroken. Hier hebben we geïsoleerd zijn-gelabeld sortilin uit cellen transfected 3T3-L1 met behulp van kobalt hars en aangetoond dat kan communiceren met chemisch gesynthetiseerde peptide overeenkomt met de eerste luminal lus van GLUT4 bij pH 6 en pH 8 die lijken op zure milieu in de endosomal lumen en neutrale omgeving in het lumen van de TGN membranen. Geen bindend peptide werd ontdekt in controle experimenten waar uittreksel bereid uit niet-transfected cellen was geladen op de dezelfde parels.

Protocol

1. het hanteren van de Peptide

1. Ontwerpen en bestellen van de peptide
   1. Kies de gewenste volgorde van de peptide en toevoegen van een tag, zoals myc epitope (EQKLISEED) op haar beide N - of C-terminus.
   2. Controleer de voorspelde oplosbaarheid van de peptide in water, met behulp van peptide oplosbaarheid rekenmachine http://pepcalc.com/peptide-solubility-calculator.php. Als de oplosbaarheid laag is, probeert toe te voegen een andere in water oplosbare tag als de balans van de kosten wilt wijzigen.
      Opmerking: We gebruikten de peptide die overeenkomt met de eerste luminal lus (fll) van GLUT4 die zijn gelabeld met de myc epitope (vet) in de N-terminus (Myc-fll-GLUT4): EQKLISEED-LNAPQKVIEQSYNATWLGRQGPGGPSSIPPGTLTTLWA met "goed" voorspelde oplosbaarheid in water .
   3. Bestel de aangepaste peptide met ten minste 75% zuiverheid die is voldoende voor de bepaling, en vragen van de provider voor oplosbaarheid. Scheiden de volgorde in ten minste twee aliquots in geval van onvoorziene problemen met het oplossen van de peptide.
      Opmerking: Myc-fll-GLUT4 werd besteld in twee porties. De gerapporteerde oplosbaarheid in water, ultrapure is ≤10 mg/mL.
2. Ontbinding van de peptide
   Opmerking: Ultrapure water is het beste oplosmiddel. Als de peptide niet oplosbaar in water lijkt, verwijzen naar http://www.genscript.com/peptide_solubility_and_stablity.html voor instructies.
   1. 100 x werkoplossing van de peptide in ultrazuiver water of in de buffer van keuze, met de concentratie van 100 μg/mL voor te bereiden.
   2. Scheiden van de oplossing in 50-100 µL aliquots, en bewaar ze bij-20 ° C.

2. het hanteren van cellen

1. Celcultuur
   1. Wild type (WT) cellen worden gebruikt als een negatieve controle, en de cellen, uiting geven aan het doel-eiwit gelabeld met zes histidines (HisP).
      Opmerking: We gebruikt 3T3 L1 pre adipocytes stabiel transfected met Sortilin-myc/zijn⁵.
   2. Het groeien van de cellen in de Dulbecco bewerkt Eagle Medium (DMEM) hoge suiker, aangevuld met 10% kalf runderserum, glutamine (2 mM) en penicilline/streptomycine (5 μg/mL) bij 37 ° C in 10% CO,₂.
   3. Vier 10 cm schotels van cellen zitten, twee van hen met HisP transfect en transfect van de andere twee met controle plasmide (WT). 48 h na transfectie, cellen moeten 80-90% confluentie bereiken.
2. Voorbereiding van de cel Lysates
   1. Bereiden van lysis-buffermengsel (10 mM Hepes, 30 mM NaCl, 5% glycerol, 10 mM imidazool, 0,5% Triton X-100 en protease inhibitor van de omwenteling zonder EDTA cocktail voor de isolatie van Zijne-gelabelde proteïnen, pH 7.4) en houd het bij 4 ° C:
   2. Wassen van de cellen drie keer met 10 mL, 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) bij 4 ° C.
   3. Zet de gerechten op het ijs en 500 µL van lysis buffer toevoegen aan elk gerecht. Oogst van de cel lysates met behulp van een cel schraper.
   4. Plaats de cel lysate van elk gerecht in een verschillende 1,5 mL-buis. Label de buizen als WT-pH6 WT-pH8, HisP-pH6, HisP-pH8.
   5. Passeren de cel lysates een injectiespuit met een naald 26G vijf keer op en neer, tot volledige lysis.
   6. Centrifugeer de cel lysates bij 16.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
   7. Het supernatant overbrengen in nieuwe identiek gelabelde buizen.
   8. Analyseren met behulp van de BCA eiwit Assay Kit of andere kit eiwitconcentratie.
   9. Met behulp van lysis-buffermengsel, egaliseren eiwitconcentratie van alle vier lysates.
   10. Scheiden van een klein (ca. 20 µL) hoeveelheid van elk lysate en houd het bij-20 ° C voor mogelijke controle experimenten en/of het oplossen van problemen.

3. bindende van Zijne-gelabeld eiwitten aan de HisPur Cobalt kralen

1. Het gebruik van verkrijgbare was buffer of bereiden een (50 mM nb₂HPO₄/NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 20 mM imidazool, pH 8) en houd het bij 4 ° C.
2. Bereiden van wassen buffer met pH 6 door tittering wassen buffer pH 8 met HCl. Houd het bij 4 ° C.
3. Zachtjes swirl de fles van de kobalt parels te maken van homogene suspensie.
4. Afzien 40 µL van de schorsing van de kralen kobalt in vier 1,5 mL buizen zoals hierboven aangegeven (stap 2.2.4).
5. Voeg 1 mL lysisbuffermengsel aan elke buis, de buizen bij 1000 x g Centrifugeer gedurende 5 s. Aspirate het supernatant en 40 μL van lysis buffer toevoegen aan vaste kralen.
6. De cel lysates aan overeenkomstige buizen toevoegen.
7. Incubeer de buizen voor 90 min bij 4 ° C op een buis rotator bij 20 omwentelingen per minuut.
8. Centrifugeer de buizen bij 1000 x g voor 5 s en verzamel het supernatant. Houd het supernatant bij 4 ° C.
9. Voeg 500 µL van pH 8 of pH 6 was buffer overeenkomstige buizen en resuspendeer de kralen zachtjes.
10. Centrifugeer de buizen bij 1000 x g gedurende 5 s en negeren het supernatant.
11. Herhaal stap 3.9 en 3.10 voor vier keer.

4. de binding van de Peptide aan de zijne-gelabeld proteïne geïmmobiliseerd op de parels

1. Met behulp van 100 x werkende oplossing van de peptide (stap 1.2.1), bereiden 1 x werkoplossing in pH 6 of pH 8 was buffer (twee 100 µL aliquots voor elk, 1 µg/mL).
2. Voeg 100 μl van 1 x peptide oplossing aan de gewassen kralen met de bijbehorende pH.
3. Incubeer de kralen gedurende 30 minuten bij 4 ° C op een buis rotator bij 20 omwentelingen per minuut.
4. Centrifugeer de buizen bij 1.000 x g gedurende 5 s, verzamelen het supernatant en bewaar deze bij-20 ° C.
5. Herhaal stap 3.9 en 3.10 voor vier keer.
   Opmerking: Ter vermindering mogelijk achtergrond, kunnen de volgende stappen stappen 4.4 en 4.5 vervangen.
6. Neem vier micro kolommen met 30 μm poriën, label hen zoals in stap 2.2.4, en plaats van de kolommen in collectie buizen.
7. Na voltooiing van stap 4.3, breng het incubatie-mengsel in de kolommen, kunt u de oplossing te passeren door de zwaartekracht. Houden van de stroom door bij-20 ° C.
8. Pass 500 µL van wassen buffer met pH 6 of pH 8 door overeenkomstige kolommen door de zwaartekracht. Gooi de stroom door.
9. Herhaal stap 4.8 vier keer.
10. Na de laatste wassen, centrifugeren de kolommen bij 1.000 x g gedurende 15 s.

5. de elutie van kobalt kralen

1. Gebruik commerciële Tricine monster buffer (200 mM Tris-HCl, 40% glycerol, 2% SDS, 0,04% Coomassie Blue, pH 6.8) en β-mercaptoethanol toevoegen aan de uiteindelijke concentratie van 2%.
2. Voeg toe 40 µL van Tricine monster buffer (met β-mercaptoethanol) aan de gewassen kralen en vortex het monster.
3. Verwarm de monsters gedurende 10 minuten bij 100 ° C, vortex de monsters weer samen en centrifugeer de buizen bij 1.000 x g gedurende 5 s.
   Opmerking: Ter vermindering van mogelijke niet-specifieke binding in de elutie, kunnen de volgende stappen stappen 5.1-5.3 vervangen.
4. 40 μL van elutie imidazool Buffer (50 mM nb₂HPO₄/NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 0,25 M imidazol) toevoegen aan de gewassen kralen, vortex en de buizen bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten uit te broeden.
5. Centrifugeer de buizen bij 3000 x g gedurende 30 s, het supernatant (geëlueerd monsters) verzamelen en overdragen naar nieuwe gelabelde buizen.
6. Voeg 40 l Tricine monster buffer aan elke buis, heat van de monsters gedurende 10 minuten bij 100 ° C, vortex en centrifuge de buizen bij 1.000 x g gedurende 5 s.
   Opmerking: Als micro kolommen worden gebruikt, de elutie buffer toevoegen aan de gewassen kralen, Incubeer gedurende 20 min en verzamelen de elutie door centrifugeren bij 8.000 x g gedurende 2 min.
   Opmerking: Monsters kunnen worden bewaard bij-20 ° C tot elektroforese wordt uitgevoerd.

6. elektroforese en het westelijke bevlekken

Opmerking: De monsters zijn klaar voor de scheiding door SDS-pagina en de daaropvolgende westelijke bevlekken. Volg protocol van de Elektroforese van het gel (https://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot) met de volgende wijzigingen.

1. Gebruik verkrijgbare 10-20% Tricine kleurovergang gels.
2. Op de gel, door 20 µL van de eluted monsters en 20 µL van lysates (stap 2.2.10) te laden. Voor het oplossen van problemen, is het aangeraden om te laden 20 µL van niet-afhankelijke materiaal (stap 3.8) en 10 ng van de peptide; vóór het laden, toevoegen u gelijke hoeveelheid Tricine monster buffer aan deze monsters.
3. Verrichten van elektroforese in commerciële Tris/Tricine/SDS buffer (100 mM Tris, 100 mM Tricine, en 0,1% SDS, pH 8.3) uitgevoerd.
4. Het materiaal van de gel op een membraan van 0,45 µm nitrocellulose met overdracht buffer (25 mM Tris base, 192 mM glycine, pH 8.4) aangevuld met 20% methanol overbrengen.
5. Blokkeren van het membraan met 3% boviene serumalbumine (BSA) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Met behulp van vooraf gebeitst molecuulgewicht markeringen als gidsen, knippen het membraan horizontaal, vlek van het bovenste deel met een antilichaam tegen HisP en vlek het onderste gedeelte met een antilichaam tegen het myc epitoop te identificeren van de peptide myc-gelabeld.
   Opmerking: In ons geval, snijden van het membraan is niet vereist omdat zowel HisP als Myc-fll-GLUT4 kunnen worden opgespoord met een anti-myc antilichaam.

7. analyse van de resultaten

1. De intensiteit van alle westelijke vlek signalen met behulp van een Image Station of ImageJ programma te kwantificeren.
2. Normaliseren van het signaal van de peptide myc-gelabeld tegen het signaal van de HisP op beide pH-waarden.

Resultaten

Lysates waren bereid uit 3T3 L1 cellen transfected stabiel met Sortilin-myc/zijn⁵ en uit WT 3T3 L1 cellen, gebruikt als een negatieve controle. Beide lysates werden geïncubeerd met kobalt kralen op pH 6 of pH 8 en grondig gewassen. Kralen met geïmmobiliseerdet eiwitten werden vervolgens geïncubeerd in de oplossing van Myc-fll-Glut4. Na voorzichtig wast, werden eiwitten gebonden aan de parels geëlueerd met 0,25 M imidazool. Monsters werden blootgesteld, samen met de...

Discussie

Sortilin is een evolutionaire Geconserveerde proteïne van de multi ligand-receptor die betrokken is in beide signalering op het plasma-membraan en intracellulaire Sorteer gebeurtenissen^6,7. De zoektocht naar de authentieke sortilin liganden (waarvan sommige zijn luminal of integraal membraaneiwitten) is echter ingewikkeld als de interactie van sortilin met een aantal van haar partners bindende lijkt te zijn gevoelig voor detergentia. Daarom een eenvoudig en een b...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Protease inhibitor cocktail	Sigma	P8849	voor gebruik bij de zuivering van histidine-tag-eiwitten
Phosphate-Buffered Saline	Corning	21-040-CV	PBS
1mL Insulin Syringe U-100	BD	329652	26G x 1/2
BCA Protein Assay Kit	Pierce	23228
Wash buffer	Boston BioProducts	BP-234	Voor His-tag-eiwit zuivering
HisPur Cobalt Resin	Thermo Scientific	89964
Tricine sample Buffer	Bio-Rad	161-0739	met SDS, b-Mercaptaethanol moet worden toegevoegd
Elution  Buffer	Boston BioProducts	BP-236	Voor His-tag-eiwit zuivering met 250mM Imidazol
Mini-Protean Tris-Tricine precast gels 10-20%	Bio-Rad	456-3115	Voor scheiding van peptide en klein eiwit
Tris/Tricine/SDS running buffer	Bio-Rad	161-0744
Transfer Buffer	Boston BioProducts	BP-190	Voeg 20% methanol toe
Nitrocellulose membrane  0.45 mm	Bio-Rad	1620115
Bovine Serum Albumin	Sigma	A9647	BSA
Anti Myc antibody	Cell Signaling	2272	Konijn
Peptide	Genscipt		Op maat gemaakte bestelling
Precision Plus Protein Dual color Standarts	BioRad	161-0374