Methodenartikel

Twee-foton Intravital Imaging van leukocyten tijdens de immuunrespons bij Lipopolysaccharide-behandelde muis lever

10.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/57191

⸱

6 februari 2018

 ,  ,  , 
1Department of Anatomy, Yonsei University College of Medicine, 2Brain Korea 21 Plus Project for Medical Science, Yonsei University College of Medicine, 3Department of Surgery, Yonsei University College of Medicine

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

We een nieuwe chirurgische protocol voor twee-foton beeldvorming van levende muizen lever met minimale invasie opgericht. Met deze techniek vastgesteld we de gedetailleerde structuur van de lever tijdens lipopolysaccharide-geïnduceerde endotoxemia. Wij verwachten dat deze methode kan worden gebruikt om te bepalen van de effectiviteit van verschillende behandeling van de reagentia te hepatische migratie.

Samenvatting

Sepsis is een soort ernstige infectie die orgaanfalen en weefsel kan veroorzaken schade. Hoewel de tarieven van de mortaliteit en morbiditeit geassocieerd met sepsis zijn extreem hoog, geen directe behandeling of orgel-gerelateerde mechanisme is onderzocht in detail in real-time. De lever is het belangrijkste orgaan, die worden beheerd met toxines en infecties in het menselijk lichaam. Hierin wilde we intravital beeldvorming van muis lever na inductie van endotoxemia uitvoeren om het bijhouden van de beweeglijkheid van immune cellen, zoals neutrofielen en lever kapselvorming macrofagen (LCMs). Dienovereenkomstig, we ontwierpen een nieuwe chirurgische methode voor blootstelling van de lever met minimaal invasieve chirurgie. Muizen werden intraperitoneally met lipopolysaccharide (LPS), een gemeenschappelijke endotoxine ingespoten. Met behulp van onze nieuwe chirurgische benadering voor blootstelling en intravital beeldvorming van de muis lever, dat we vonden dat neutrofiele aanwerving in LPS-behandeld LysM-groen fluorescente proteïne (GFP) werd muis lever verhoogd in vergelijking met die in fosfaatgebufferde Saline-behandelde lever. Na de behandeling van de LP's, het aantal neutrofielen aanzienlijk gestegen met tijd. Bovendien, met behulp van CX3Cr1-GFP muizen, we met succes lever resident macrofagen genaamd LCMs gevisualiseerd. Daarom voor het onderzoek naar de werkzaamheid van nieuwe reagentia te controleren immuun mobiliteit in vivo, kan vaststelling van de motiliteit en morfologie van neutrofielen en LCMs in de lever toestaan ons te identificeren therapeutisch effect in orgel falen en weefsel schade veroorzaakt door de activering van de leukocyten in sepsis.

Inleiding

De lever is het grootste metabole orgaan in zoogdieren; het fungeert als een verkeerstoren voor energie, hormonen en ontgifting1. Vanwege het belang ervan, hebben de onderzoekers vele in vitro en in vivo experimenten om het verhelderen van de wijzigingen in de lever tijdens ontsteking uitgevoerd. Intravital microscopie is gebruikt om live beelden van de lever2 te vangen. Inderdaad, introduceerde diverse lever beeldvormende methoden zijn2,3,,4,,5,6. Echter om een eenvoudigere chirurgische aanpak ontwikkelen en stabilisatie van de doel-orgel en de immuuncellen te bereiken, ontwierpen we een eenvoudige protocol dat onderzoekers om te minimaliseren van hun inspanningen voor intravital imaging kan begeleiden.

In deze studie introduceerde wij een stabiel en roman imaging kamer en chirurgische techniek die gebruikt kan worden om te minimaliseren van bloeden en mogelijke infecties. We hebben bevestigd dat de lever bleef intact gedurende meer dan 2 uur. Met deze methode vastgesteld we met succes morphologies van LCMs7 en neutrofielen onder septische voorwaarde. Aangezien deze methode storende factoren van fysische en biologische zoals beven en onverwachte ontsteking tijdens chirurgische ingreep minimaliseert, verwachten wij dat deze methode kan worden gebruikt om het observeren van acute reacties van immune cellen in de lever in reactie op reagentia zoals LPS.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle procedures werden uitgevoerd overeenkomstig de richtsnoeren van de institutionele Animal Care en gebruik Comité Yonsei University College of Medicine, Korea. LysM-groen fluorescente proteïne (GFP; gfp / +) muizen8 en CX3Cr1-GFP (gfp / +)9 muizen op 8-12 weken leeftijd werden gebruikt voor intravital imaging. Alle chirurgische instrumenten waren gesteriliseerde met autoclaaf en gedesinfecteerd met alcohol 70%.

1. douane-ontworpen muis lever imaging kamer met ondersteuning van tools

  1. Muis lever imaging kamer ontwerp
    1. Maken van een kamer van het volgende formaat voor muis lever imaging (Figuur 1): binnenkamer (120 mm lengte × 160 mm breedte × 30 mm hoogte), buitenste chamber (100 mm lengte × 100 mm breedte × 24 mm hoogte), bouten (Ф 3 mm × 30 mm hoogte), noten (Ф 4 mm) , en vleugel-vormige noten (Ф 4 mm).
    2. De uithardende agent en elastomeer basis in 1:9-verhouding zodat een totaal van 120 g silicone meten.
    3. Doe het mengsel van vloeibare siliconen in een conische kolf van 250 mL en meng het goed. Vervolgens zet de kolf in een exsiccator en verwijderen van luchtbellen voor ongeveer 1U onder drukvermindering door de pomp.
    4. Giet de mix van vloeibare siliconen in een douane-ontworpen muis kamer zo hoog als 10 mm hoogte en laat het remedie voor een paar dagen (figuur 1A).
  2. Voorbereiding van dekking dia's en de lever vaststelling bed
    1. Op de metalen frame, door het glas van de cover met behulp van siliconen lijm te koppelen. Laat het drogen voor 1 dag (figuur 1B).
    2. Om effectief het gedestilleerd water voor het water onderdompeling-lens, is een semipermanent water-blokkerende structuur essentieel. Maak van 1 mm siliconen lijm afronding en harden het 's nachts.
    3. Meng de uithardende agent en elastomeer basis en giet het in een 6-well-plaat op een hoogte van ongeveer 8-10 mm. uitvoeren de verharding proces zoals beschreven in 1.1.2-1.1.4.

2. voorbereiding van LPS

  1. Steriele 1 ×-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) om te verdunnen het LPS poeder van Salmonella enterica serotype enteritidis voor te bereiden. (1 × PBS: 137 mM NaCl, KCl 2,7 mM, 10 mM nb2HPO4, 1,8 mM KH2PO4).
  2. Verwarm in een waterbad bij 37 ° C op PBS en open de LPS poeder fles (25 mg) zorgvuldig.
  3. Met behulp van een pipet steun, giet de steriele PBS (5 mL) in de LPS poeder fles en zachtjes roeren of op te schorten de oplossing ter voorbereiding van de stockoplossing.
    Opmerking: Nadat LPS poeder is vloeibaar, harde vortexing kan bellen. Vermijden makend bubbles om verlies te minimaliseren bij het maken van aliquots in 1.5-mL tubes.
  4. Opslaan van de stockoplossing van de LPS van −20 ° C, en vul het in een 1 mg/mL LPS oplossing voor injectie.
  5. Injecteren de LPS oplossing van 1 mg/mL (20 mg/kg) in het buikvlies van een niet-verdoofd muis met behulp van een injectiespuit 1 mL. Injecteren hetzelfde volume van PBS voor het dier controle.
  6. Wacht 2 h voor voldoende inflammatoire respons.

3. voorbereiding van de Texas-rood Dextran om vlek van bloedvaten

  1. Twee kegelvormige buizen van 15 mL en 10 mL steriele PBS te bereiden.
  2. Verdun Texas-rood Dextran poeder (25 mg) in 3 mL PBS en meng het goed. Het mengsel overbrengen in een lege 15 mL conische buis.
  3. De resterende PBS (7 mL) overbrengen met de 15 mL conische buis met het mengsel van dextran (3 mL).
  4. Sluit een 0,45 µm spuit filter naar het uiteinde van een 10 mL spuit. Het filter van de spuit moet de naald vervangen.
  5. Filtreer het mengsel dextran (10 mL). Druk gelijkmatig op de spuit om te voorkomen dat morsen.
  6. Afzien van 500 µL van 2,5 mg/mL dextran oplossing in de 1.5-mL licht-geblokkeerde buis en op te slaan bij −20 ° C. Eenmaal ontdooid, bewaren bij 4° C.

4. het chirurgische proces

  1. Desinfecteer de operatie tafel en alle instrumenten met behulp van 70% alcohol voorafgaand aan de operatie. Vervolgens stelt u de hulpprogramma's voor de lever chirurgie en aanpassen van de verwarmingsplaat tot 37 ° C (figuur 2A, B).
  2. Voor anesthesie, intraperitoneally injecteren de muizen met 30 mg/kg tiletamine/zolazepam en 10 mg/kg xylazine. Deze oplossingen kunnen worden gemengd en voor gelijktijdige injectie in PBS is verdund. Bevestigen afstomping door zachtjes op de teen van de muis.  Gaan de volgende stap als er geen reflex is.
  3. Kleine hoeveelheid oog zalf om te voorkomen dat de droogte van muis vlek van toepassing.
  4. Lichaamshaar rond het gebied van de buik met behulp van hair removal cream (figuur 2C) verwijderen.
  5. Injecteren van 200 µL van Texas-rood Dextran oplossing (concentratie van 2,5 mg/mL) via de staart ader of retro-orbitaal injectie met een insuline-injectiespuit (figuur 2D).
  6. Het recht subcostal gebied markeren met een viltstift. De lijn moet worden getrokken uit de xiphoid proces tot het einde van de rib. Snijd de epidermis met Tang en schaar (figuur 2E, F).
  7. De buikholte met behulp van de micro-schaar en pincet open en bloot de lever zorgvuldig. De linker laterale kwab moet worden uitgerold met behulp van katoen swabs (Figuur 2 g, H).
  8. Giet 500 µL van steriele PBS op de buikholte ter voorkoming van droogheid van de lever.
  9. Plaatst u de muisaanwijzer op de positie van de recht-decubitus in een kamer speciaal ontworpen, en breng een kleine hoeveelheid weefsel lijm aan het bed van silicium. Zorgvuldig hechten dan de lever met katoenen wissers (figuur 2I).
    Opmerking: Omdat het leverweefsel extreem brokkelige is, mechanisch Trek niet uit de lever. Zachtjes uitrollen het met wissers van katoen.
  10. Een paar seconden later, natte de lever weer met 500 µL van steriele PBS te vermijden drogen uit de lever. Plaats de metalen frame op de lever en stevig repareren met noten (figuur 2J).

5. intravital beeldvorming van de lever met twee-foton microscopie

  1. Uitvoeren van ZEN software (Carl Zeiss) zet de laser, stelt u de golflengte aan 880 nm, en groene, en rode kanalen. Aanpassen laser macht volgens de intensiteit van de fluorescentie (figuur 3A). Emissie filterinformatie is als volgt: groen/Alexa488, 500-550 nm en rood/Alexa 555, 575-610 nm.
  2. Plaats van de kamer het imaging werkgebied en plaats de 20 X water-immersie objectief dicht bij de glazen cover.
  3. De siliconen rubber kachel onder het lichaam van de muis te handhaven van de lichaamstemperatuur (figuur 3B) vast te stellen.
  4. Drop 500 µL van gedistilleerd water op de metalen frame, en dan trek de objectief dicht bij de lever (Figuur 3 c).
  5. De focus aanpassen en bepalen van de diepte en de tijd van het imaginggebied.
  6. Gedrag imaging.
  7. Voor langdurige imaging, injecteren helft van een dosis van tiletamine/zolazepam en xylazine mengsel elk uur tijdens imaging. Handhaven van de lichaamstemperatuur van de muizen bij 37 ° C is essentieel tijdens deze etappe. Houd altijd op oog voor de muis, aangezien afstomping tijd van elke muis verschilt.
    Opmerking: Deze methode is niet geschikt voor herstel na de operatie en beeldvorming. We offeren ethisch de muis onmiddellijk na de operatie.
  8. Controleer de pedaal reflexen voor elke 30 min. voor stabiele afstomping.

6. de gegevensanalyse

  1. Open de data-analysesoftware Volocity en vervolgens de onbewerkte gegevens in de bibliotheek in de software importeren.
  2. Verwijder ruis van het beeld aanpassen aan de situatie te nemen van een momentopname.
    Opmerking: Voor het verkrijgen van goede beelden, het 'Fine' of 'Mediaan' filter gebruiken. Bovendien, de 'Contrast enhancement'-functie gebruiken om donkere of wazige beelden duidelijker te maken.
  3. Passen de bewerkte producten 100% te exporteren als JPEG- of TIFF-bestanden voor momentopname beelden en AVI-bestanden voor films.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Een eenvoudige en zeer stabiel imaging kamer was bedacht. De bodem van kamer was bedekt met silicone, waardoor het wegglijden van de muis lichaam en de organen. Bovendien, omdat silicium de juiste hoeveelheid elasticiteit heeft, kon het voorkomen dat van verwachte schade veroorzaakt door de druk van de cover dia (figuur 1A, C). Tweede, weefsel-kluis lijm (dierenarts bond) werd toegepast om te bevestigen de uitgepakte lever op het cirkelvormig...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De lever is actief bestudeerd door vele groepen3,10, vanwege het belang van zijn functie. Bijvoorbeeld, stelde Heymann et al. een gevoelige methode met behulp van agarose. Hoewel deze methode bleek te zijn zeer nauwkeurige, heeft de instelling van de agarose duurt. Echter, met onze methodologie alle procedures kunnen worden uitgevoerd binnen 30 min, minimaliseren van andere storende factoren. Ten tweede, het stabiliseren van de lever is zeer belangrijk omdat de h...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

Deze studie werd gesteund door een subsidie van de nationale onderzoek Stichting van Korea (NRF) gefinancierd door de regering van Korea (MSIP; subsidie no. 2016R1A2B4008199 tot Y-M. H.), en het ministerie van volksgezondheid en welzijn, Republiek Korea (verlenen van nummer: HI14C1324).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Custom designed chamberLive Cell InstrumentsOp maat ontworpen maat
Metal cover slideLive Cell InstrumentsOp maat ontworpen maat
Cover glassElectron Microscopy Sciences#72204-03
Sylgard 184 Silicone elastomer kitDow Corning
Erlenmeyer flaskDURAN21 216 36
Cell culture plate (Flat type)HYUNDAI Micro Co.H31006
DesiccatorADARSH55204
High Q BOND SE 5 mLBJM LABOm een semi-permanent dam te maken
Flexible Silicone Rubber HeatersOmegaSRFR/SRFG SERIES, M1250/0800
DC power supplyToyotechDP30-03A
Phosphate-buffered salineZelfgemaakt
Lipopolysaccharides (LPS) from Salmonella enteria serotype enteritidisSigma-AldrichL6011
Texas Red DextranThermo Fisher ScientificD1830
15 mL High-clarity polypropylene
conical tube		FALCON14-959-49B
0.45 μm filter (Minisart Syringe Filter)Sartorius16555k
1.5ml Micro Tube, AmberAxygenMCT-150-XVoor lichtblokkering
1 mL syringeKorea VaccineKV-S01
3 mL syringeKorea VaccineKV-S03
10 mL syringeKorea VaccineKV-S10
0.3 mL insulin syringeBecton Dickinson324900
Hair removal cream 100 mLBody natur
Cotton swabABDI
Zoletil 50 5 mLVirbac
Rompun 10 mLBayer
Heating plateLive Cell InstrumentsPH-S-10Op maat ontworpen maat
DC controllerLive Cell InstrumentsCU-301
Microdessection ScissorsHarvard Apparatus72-5418
ScissorsRobozRS-5882
ForcepsRobozRS-5137
Vet bond3M1469SB
ZEN software (Black Edition)Carl ZeissProgramma voor LSM 7 MP
LSM 7 MPCarl Zeiss
VolocityPerkinElmerAnalyseprogramma

Referenties

  1. Girard, J. R., et al. Fuels, hormones, and liver metabolism at term and during the early postnatal period in the rat. J Clin Invest. 52 (12), 3190-3200 (1973).
  2. Marques, P. E., et al. Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy. Nat Protoc. 10 (2), 258-268 (2015).
  3. Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. L. Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics. J Vis Exp. (101), e52303(2015).
  4. Honda, M., et al. Intravital imaging of neutrophil recruitment in hepatic ischemia-reperfusion injury in mice. Transplantation. 95 (4), 551-558 (2013).
  5. Jenne, C. N., Wong, C. H., Petri, B., Kubes, P. The use of spinning-disk confocal microscopy for the intravital analysis of platelet dynamics in response to systemic and local inflammation. PLoS One. 6 (9), e25109(2011).
  6. Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Sci Transl Med. 4 (158), 158ra145(2012).
  7. Sierro, F., et al. A Liver Capsular Network of Monocyte-Derived Macrophages Restricts Hepatic Dissemination of Intraperitoneal Bacteria by Neutrophil Recruitment. Immunity. 47 (2), 374-388 (2017).
  8. Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 719-726 (2000).
  9. Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol Cell Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).
  10. Heymann, F., et al. Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice. J Vis Exp. (97), (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Leukocytenmotiliteitimmuunrespons van de leverneutrofielenrekruteringmacrofagen van het leverkapselLPS behandelde muizenleverintravitale beeldanalysefluorescentiemicroscopiechirurgische blootstelling van de leverseptische shockmodel

Gerelateerde artikelen