We een nieuwe chirurgische protocol voor twee-foton beeldvorming van levende muizen lever met minimale invasie opgericht. Met deze techniek vastgesteld we de gedetailleerde structuur van de lever tijdens lipopolysaccharide-geïnduceerde endotoxemia. Wij verwachten dat deze methode kan worden gebruikt om te bepalen van de effectiviteit van verschillende behandeling van de reagentia te hepatische migratie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Twee-foton Intravital Imaging van leukocyten tijdens de immuunrespons bij Lipopolysaccharide-behandelde muis lever
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Sepsis is een soort ernstige infectie die orgaanfalen en weefsel kan veroorzaken schade. Hoewel de tarieven van de mortaliteit en morbiditeit geassocieerd met sepsis zijn extreem hoog, geen directe behandeling of orgel-gerelateerde mechanisme is onderzocht in detail in real-time. De lever is het belangrijkste orgaan, die worden beheerd met toxines en infecties in het menselijk lichaam. Hierin wilde we intravital beeldvorming van muis lever na inductie van endotoxemia uitvoeren om het bijhouden van de beweeglijkheid van immune cellen, zoals neutrofielen en lever kapselvorming macrofagen (LCMs). Dienovereenkomstig, we ontwierpen een nieuwe chirurgische methode voor blootstelling van de lever met minimaal invasieve chirurgie. Muizen werden intraperitoneally met lipopolysaccharide (LPS), een gemeenschappelijke endotoxine ingespoten. Met behulp van onze nieuwe chirurgische benadering voor blootstelling en intravital beeldvorming van de muis lever, dat we vonden dat neutrofiele aanwerving in LPS-behandeld LysM-groen fluorescente proteïne (GFP) werd muis lever verhoogd in vergelijking met die in fosfaatgebufferde Saline-behandelde lever. Na de behandeling van de LP's, het aantal neutrofielen aanzienlijk gestegen met tijd. Bovendien, met behulp van CX3Cr1-GFP muizen, we met succes lever resident macrofagen genaamd LCMs gevisualiseerd. Daarom voor het onderzoek naar de werkzaamheid van nieuwe reagentia te controleren immuun mobiliteit in vivo, kan vaststelling van de motiliteit en morfologie van neutrofielen en LCMs in de lever toestaan ons te identificeren therapeutisch effect in orgel falen en weefsel schade veroorzaakt door de activering van de leukocyten in sepsis.
Inleiding
De lever is het grootste metabole orgaan in zoogdieren; het fungeert als een verkeerstoren voor energie, hormonen en ontgifting1. Vanwege het belang ervan, hebben de onderzoekers vele in vitro en in vivo experimenten om het verhelderen van de wijzigingen in de lever tijdens ontsteking uitgevoerd. Intravital microscopie is gebruikt om live beelden van de lever2 te vangen. Inderdaad, introduceerde diverse lever beeldvormende methoden zijn2,3,,4,,5,6<....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle procedures werden uitgevoerd overeenkomstig de richtsnoeren van de institutionele Animal Care en gebruik Comité Yonsei University College of Medicine, Korea. LysM-groen fluorescente proteïne (GFP; gfp / +) muizen8 en CX3Cr1-GFP (gfp / +)9 muizen op 8-12 weken leeftijd werden gebruikt voor intravital imaging. Alle chirurgische instrumenten waren gesteriliseerde met autoclaaf en gedesinfecteerd met alcohol 70%.
1. douane-ontworpen muis lever imaging kamer met ondersteuning van tools
- Muis lever imaging kamer ontwerp
- Maken van een kamer van het volgende formaat voor muis lev....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Een eenvoudige en zeer stabiel imaging kamer was bedacht. De bodem van kamer was bedekt met silicone, waardoor het wegglijden van de muis lichaam en de organen. Bovendien, omdat silicium de juiste hoeveelheid elasticiteit heeft, kon het voorkomen dat van verwachte schade veroorzaakt door de druk van de cover dia (figuur 1A, C). Tweede, weefsel-kluis lijm (dierenarts bond) werd toegepast om te bevestigen de uitgepakte lever op het cirkelvormig.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De lever is actief bestudeerd door vele groepen3,10, vanwege het belang van zijn functie. Bijvoorbeeld, stelde Heymann et al. een gevoelige methode met behulp van agarose. Hoewel deze methode bleek te zijn zeer nauwkeurige, heeft de instelling van de agarose duurt. Echter, met onze methodologie alle procedures kunnen worden uitgevoerd binnen 30 min, minimaliseren van andere storende factoren. Ten tweede, het stabiliseren van de lever is zeer belangrijk omdat de h.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.
Dankbetuigingen
Deze studie werd gesteund door een subsidie van de nationale onderzoek Stichting van Korea (NRF) gefinancierd door de regering van Korea (MSIP; subsidie no. 2016R1A2B4008199 tot Y-M. H.), en het ministerie van volksgezondheid en welzijn, Republiek Korea (verlenen van nummer: HI14C1324).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Custom designed chamber | Live Cell Instruments | Op maat ontworpen maat | |
| Metal cover slide | Live Cell Instruments | Op maat ontworpen maat | |
| Cover glass | Electron Microscopy Sciences | #72204-03 | |
| Sylgard 184 Silicone elastomer kit | Dow Corning | ||
| Erlenmeyer flask | DURAN | 21 216 36 | |
| Cell culture plate (Flat type) | HYUNDAI Micro Co. | H31006 | |
| Desiccator | ADARSH | 55204 | |
| High Q BOND SE 5 mL | BJM LAB | Om een semi-permanent dam te maken | |
| Flexible Silicone Rubber Heaters | Omega | SRFR/SRFG SERIES, M1250/0800 | |
| DC power supply | Toyotech | DP30-03A | |
| Phosphate-buffered saline | Zelfgemaakt | ||
| Lipopolysaccharides (LPS) from Salmonella enteria serotype enteritidis | Sigma-Aldrich | L6011 | |
| Texas Red Dextran | Thermo Fisher Scientific | D1830 | |
| 15 mL High-clarity polypropylene conical tube | FALCON | 14-959-49B | |
| 0.45 μm filter (Minisart Syringe Filter) | Sartorius | 16555k | |
| 1.5ml Micro Tube, Amber | Axygen | MCT-150-X | Voor lichtblokkering |
| 1 mL syringe | Korea Vaccine | KV-S01 | |
| 3 mL syringe | Korea Vaccine | KV-S03 | |
| 10 mL syringe | Korea Vaccine | KV-S10 | |
| 0.3 mL insulin syringe | Becton Dickinson | 324900 | |
| Hair removal cream 100 mL | Body natur | ||
| Cotton swab | ABDI | ||
| Zoletil 50 5 mL | Virbac | ||
| Rompun 10 mL | Bayer | ||
| Heating plate | Live Cell Instruments | PH-S-10 | Op maat ontworpen maat |
| DC controller | Live Cell Instruments | CU-301 | |
| Microdessection Scissors | Harvard Apparatus | 72-5418 | |
| Scissors | Roboz | RS-5882 | |
| Forceps | Roboz | RS-5137 | |
| Vet bond | 3M | 1469SB | |
| ZEN software (Black Edition) | Carl Zeiss | Programma voor LSM 7 MP | |
| LSM 7 MP | Carl Zeiss | ||
| Volocity | PerkinElmer | Analyseprogramma |
Referenties
- Girard, J. R., et al. Fuels, hormones, and liver metabolism at term and during the early postnatal period in the rat. J Clin Invest. 52 (12), 3190-3200 (1973).
- Marques, P. E., et al. Imaging liver biology in vivo using conventional co....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
