Methodenartikel

Met behulp van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide Hepatocyte-achtige cellen voor drugontdekking

DOI:

10.3791/57194

⸱

19 mei 2018

 ,  , 
1Department of Regenerative Medicine and Cell Biology, Medical University of South Carolina

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het hier gepresenteerde protocol beschrijft een platform voor het identificeren van kleine moleculen voor de behandeling van de leverziekte. Een stapsgewijze beschrijving wordt gepresenteerd detailing how to onderscheiden iPSCs in cellen met hepatocyte kenmerken in 96-wells-platen, en gebruiken van de cellen om te screenen op kleine moleculen met potentiële therapeutische activiteit.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De mogelijkheid om te differentiëren van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) in hepatocyte-achtige cellen (HLCs) biedt nieuwe kansen om te studeren van aangeboren fouten in hepatische metabolisme. Echter, om een platform die ondersteuning biedt voor de identificatie van kleine molecules die potentieel kunnen worden gebruikt voor de behandeling van de leverziekte, de procedure vereist een cultuur-indeling die compatibel is met de screening van duizenden verbindingen. Hier beschrijven we de volledig gedefinieerde kweekomstandigheden, waarmee reproduceerbare differentiatie van menselijke iPSCs naar hepatocyte-achtige cellen in de weefselkweek 96-wells-platen die gebruikmaakt van een protocol. We bieden ook een voorbeeld van het gebruik van het platform scherm verbindingen voor hun vermogen tot lagere apolipoproteïne B (APOB) geproduceerd van iPSC afkomstige hepatocyten gegenereerd op basis van een familiale hypercholesterolemie patiënt. De beschikbaarheid van een platform dat compatibel is met drugontdekking mag onderzoekers te identificeren van nieuwe therapieën voor ziekten die invloed hebben op de lever.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Succes bij het identificeren van de drugs die kunnen worden gebruikt voor het richten van een zeldzame ziekte is afhankelijk van de ontwikkeling van tests die kunnen worden gebruikt voor de screening. Hypothese of doel gebaseerde schermen (omgekeerde Farmacologie) zijn nuttig, maar vereisen een gedetailleerd inzicht in de moleculaire basis van de ziekte. Fenotypische schermen (klassieke Farmacologie) voorkomen naar de nood voor een gedetailleerd begrip van biochemische pathways, maar in plaats daarvan vertrouwen op de ontwikkeling van modellen die een nauwkeurige afspiegeling van de pathofysiologie van de ziekte. Ondanks het enthousiasme voor doel-gebaseerde benaderingen onthullen analyses van het FDA keurt first-in-class drugs dat fenotypische schermen veel succesvoller1 zijn. Het algemene doel van deze methode is om een platform voor hoge throughput screening die kan worden gebruikt voor het identificeren van kleine moleculen voor de behandeling van metabole leverziekte. Verscheidene in vitro modellen zijn beschreven inclusief primaire hepatocyten, hepatoma cellen en lever voorlopercellen cellen2. Echter de meeste van deze modellen hebben beperkingen, en er is behoefte aan nieuwe modellen die nauwkeurig de pathofysiologie van metabole lever tekortkomingen in cultuur kan herhalen. Onlangs, menselijke pluripotente stamcellen gecombineerd met gen bewerken kunnen model zelfs de zeldzaamste van zeldzame ziekten in cultuur zonder de noodzaak om patiënten toegang hebben aangeboden direct3. Terwijl het gebruik van patiënt-specifieke iPSCs als een instrument om te ontdekken van de kleine moleculen voor de behandeling van zeldzame lever ziekten conceptueel redelijk wordt, zijn er alleen een paar verslagen aantonen van de haalbaarheid van deze aanpak4. Echter hebben we onlangs een platform waarmee iPSC afkomstige hepatocyten succesvol identificeren drugs die andere doelen kunnen worden gebruikt voor de behandeling van tekortkomingen in de lever metabolisme5opgericht.

Dit protocol legt het proces van menselijke iPSCs naar hepatocyte-achtige cellen in 96-wells-platen te differentiëren en ze te gebruiken om het scherm van een bibliotheek van kleine moleculen. Hierin wordt ook de eindpunt-analyse met behulp van hypercholesterolemie als een voorbeeld van stofwisselingsziekte van de lever. Deze aanpak moet nuttig zijn te onderzoeken van de rol en de toepassing van kleine moleculen in het kader van besmettelijke leverziekte, stofwisselingsziekte van de lever, drug toxiciteit en andere leveraandoeningen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. cultuur van mensenrechten geïnduceerde pluripotente stamcellen

  1. Coating van recombinante menselijke E-cadherine Fc fusieproteïne (E-cad-Fc) of andere matrices geschikt voor hPSC cultuur 6
    1. E-cad-Fc wordt met Dulbecco de Phosphate-Buffered zoute met calcium en magnesium (DPBS (+)) tot 15 μg/mL verdund.
    2. Jas van 100 mm vering weefselkweek gerechten met 5 mL verdunde E-cad-Fc en Incubeer bij 37 ˚C voor ten minste 1 h. verwijderen substraat en vervangen met 5 mL medium (b.v., mTeSR1 M-medium voortaan genoemd)7.
      Opmerking: Het kweekmedium gebruikt in dit protocol is opgesteld in vervolg op gepubliceerde protocollen7. Echter, verschillende andere media preparaten zijn beschreven of beschikbaar zijn commercieel, die waarschijnlijk compatibel met de procedure.
    3. Een flesje van cryopreserved iPSCs ophalen in vloeibare stikstof. Ontdooien op 37 ˚C tot een kleine ijs kristal blijft. Pipetteer zachtjes cellen in een steriele 15 mL conische buis met 4 mL van het M-medium.
    4. Centrifugeer bij 300 x g voor 5 min. Verwijder het supernatant en resuspendeer zachtjes cellen met 5 mL van het medium aangevuld met 10 µM van Y-27632, een selectieve remmer van Rho-geassocieerde, spiraalsnoer-spoel met proteïne kinase (ROCK).
    5. De M-medium verwijderen uit stap 1.1.2 en 5 mL van cellen uit stap 1.1.4 aan E-cad-Fc-coated 100 mm vering weefselkweek gerechten.
  2. Behoud van de menselijke iPSCs in cultuur
    1. Zodra iPSCs rond bereiken 80% confluentie, verwijder kweekmedium en een keer wassen met calcium en magnesium gratis DPBS (-). De DPBS (-) gecombineerd en voeg een voldoende hoeveelheid van de EDTA-oplossing van 0,02% naar dekking van de platen en incubeer gedurende maximaal 3 minuten bij kamertemperatuur.
      Opmerking: Bij 80% samenvloeiing, moet de plaat rond 2 x 107 cellen bevatten. Het is belangrijk niet te overwoekeren de cellen, en om ervoor te zorgen dat de cellen behouden een ongedifferentieerde morfologie. De pluripotent van de cellen kan worden bepaald door de kleuring met marker Tra-1-60 van de cel van de stam of gelijkwaardige8.
    2. Zodra de cellen beginnen te laat, verwijderen van de EDTA-oplossing van 0,02% en overstroming van de schotel met 10 mL van de M-medium om de cellen vrij te geven. Steun het detachement van iPSCs door zachtjes pipetteren.
      Opmerking: De gemiddelde incubatietijd voor cellen om los te maken is ongeveer 3 min, maar dit moet worden empirisch bepaald voor elke regel van de iPSC. De cellen moeten worden vrijgelaten als kleine clusters met rond 5-10 iPSCs per cluster.
    3. Overdracht van 1/10 van de zwevende cellen per verse E-cad-Fc gecoat 100 mm vering weefselkweek schotel met 5 mL voor de M-medium. Incubeer de culturen op 37 ˚C minder dan 4% O2/5% CO2 en het medium wijzigen dagelijks.
      Opmerking: Hoewel iPSCs routinematig onder fysiologische zuurstof voorwaarden gekweekt worden ter bevordering van pluripotent, kunnen iPSCs ook worden gekweekt met behulp van ambient zuurstof.

2. differentiatie van menselijke iPSCs naar Hepatocyte-achtige cellen in 96-wells-platen

Opmerking: Deze sectie beschrijft de differentiatie van iPSCs in een indeling die compatibel is met de screening. Met deze aanpak, is het mogelijk voor het opwekken van menselijke iPSCs te onderscheiden en vormen van de hepatocyte-achtige cellen in 20 dagen. Terwijl dit geschikt voor de meeste testen is, kan de lengte van cultuur worden uitgebreid om de looptijd van de cellen.

  1. Coating van weefselkweek 96-wells-platen met verminderde groeifactor kelder membraan matrix
    1. Bereid de voorraad door verdunning van de matrix tot 2 mg/mL met ijskoude steriele DMEM/F12 weefselkweek medium. De matrix in 250 μL aliquots verdelen en opslaan bij-80 ˚C totdat vereist. Chill 10 mL DMEM/F12 op ijs voor 30 min. ophalen een 250 μL aliquoot deel van 2 mg/mL matrix materieel en dooi op ijs.
    2. Combineer de matrix met 10 mL koude DMEM/F12 door het mengen zachtjes met behulp van een vooraf gekoeld pipet om een eindconcentratie van 0,05 mg/mL.
    3. Breng 100 μl van verdunde matrix aan elk putje van een weefselkweek 96-wells-plaat. Incubeer bij 37 ˚C, 4% O2/5% CO2 voor ten minste 1 h. de matrix verwijderen en vervangen door 50 μl van M-medium per putje. Bewaren bij 37 ° C, 4% O2/5% CO2 totdat het nodig is.
  2. Plaat cellen voor differentiatie
    1. Cultuur van de iPSCs op 100 mm platen totdat de cellen aanpak samenvloeiing van 80%. Ervoor zorgen dat de plaat rond 2 x 107 cellen bevat. Cel nummers door cel stroom cytometer of hemocytometer te bepalen.
      Opmerking: Met ervaring, kan de kwaliteit van de iPSCs cellen worden beoordeeld door microscopie; echter, bijna 98% van de cellen moeten uiten pluripotent markeringen zoals de TRA-1-60 epitoop gemeten naar FACS of immunokleuring. Het is belangrijk dat de cellen actief verdelen blijven en zijn niet begroeid.
    2. Oogst van de iPSCs van elke 100 mm plaat, gecombineerd het kweekmedium en spoel met 5 mL DPBS (-). Vervang de spoeling met 3 mL oplossing voor mobiele-detachement (bijvoorbeeld, accutase) en incubeer gedurende ongeveer 2 minuten bij 37 ° C, 4% O2/5% CO2.
      Opmerking: Het is belangrijk te volgen van het detachement van cellen door microscopie. Niet via digest met accutase doen. Het doel is om de cellen als kleine clusters met minimale behandeling vrij te geven.
    3. Zodra de cellen beginnen om los te maken, oogsten door toevoeging van 7 mL van het M-medium. Pipetteer van meerdere keren te distantiëren van de cel kolonies in kleine clusters van rond 3-6 cellen (figuur 1A).
    4. De iPSCs in een 15-mL steriele centrifugebuis en centrifuge op 300 x g verzamelen voor 5 min. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet cel in 5 mL M-medium.
    5. Verdeel de cellen op matrix beklede 96-wells-platen door pipetting 50 μl van schorsing cellen in elk putje. Voor het instellen van elke 96-wells-plaat, een 100-mm plaat van iPSCs met cellen op ongeveer 80% confluentie waarin ongeveer 5 x 106 cellen de differentiatie aan opstelling te gebruiken. Een meerkanaalspipet gebruiken om dit proces te versnellen. Cultuur van de cellen 's nachts op 37 ˚C, 4% O2/5% CO2.
      Opmerking: Het is belangrijk dat een gelijk aantal cellen wordt gestort in elk putje om reproduceerbare differentiaties.
  3. Veroorzaken van de differentiatie van de cellen
    1. Het bestuderen van de 96-wells-platen met microscopie om ervoor te zorgen dat de cellen ten minste 70% van het oppervlak van elk individu goed dekken. Als de dekking is minder dan 70%, vervangt het medium met verse medium en incubeer gedurende een aanvullende 24 uur bij 37 ˚C, 4% O2/5% CO2.
      Opmerking: Het broeden van cellen voor meer dan 48 uur na plating zonder differentiatie algemeen vermindert de efficiëntie van differentiatie. Differentiatie zal zich ook voordoen met behulp van ambient zuurstof, hoewel de efficiëntie mogelijk getroffen.
    2. Voor dag 1 tot dag 2 van differentiatie, vervangen door het kweekmedium RPMI aangevuld met 2% B27 (zonder insuline), 100 ng/mL Activin A 10 ng/mL BMP4 en 20 ng/mL FGF2. Voeg 100 μl van medium per putje en Incubeer bij 37 ˚C, in ambient O2/5% CO,2 met een dagelijkse middellange verandering voor 2 dagen.
      Opmerking: Omgaan met grote aantallen 96-wells-platen vereisen het gebruik van een gesubsidieerde pipet of de robot. 12-kanaals en 96-kanaal pipetten zijn ideaal voor de dagelijkse middellange wijzigen.
    3. Voor dag 3 dag 5 van differentiatie, vervang het kweekmedium met RPMI aangevuld met 2% B27 (zonder insuline) en 100 ng/mL Activin A. Culture cellen op 37 ˚C, in ambient O2/5% CO,2 met dagelijkse middellange verandering voor 3 dagen.
    4. Bij de differentiatie eergisteren 5, vervangen door verse kweekmedium, traktatie, elk goed met 100 μl 0,02% EDTA-oplossing voor 30 s, dan verwijderen en vervangen met verse kweekmedium.
      Opmerking: Als de differentiatie naar endoderm efficiënt is, is de enkelgelaagde van differentiatie van cellen gevoelig voor peeling van de plaat. Een korte behandeling met 0,02% EDTA oplossing helpt verlichten van mobiele-detachement. Deze behandeling heeft geen gevolgen voor de differentiatie naar hepatocyten.
    5. Voor differentiatie tussen dagen 6 tot en met 10, vervang het kweekmedium met RPMI / 2% B27 (met insuline) aangevuld met 20 ng/mL BMP4 en 10 ng/mL FGF2 en Incubeer bij 37 ˚C, 4% O2/5% CO2 voor 5 dagen met dagelijkse middellange wijzigen. Dit stadium induceert cellen te onderscheiden in de hepatische voorlopercellen.
    6. Voor differentiatie tussen dagen 11 tot en met 15, vervangen door het kweekmedium met RPMI / 2% B27 (met insuline) aangevuld met 20 ng/mL HGF. Incubeer bij 37 ˚C, 4% O2/5% CO2 voor 5 dagen met dagelijkse middellange wijzigen.
    7. Voor differentiatie tussen dagen 16 tot 20, wordt het kweekmedium vervangen door een hepatocyte cel kweekmedium (HCM) aangevuld met 20 ng/mL van Oncostatin-M (OSM). Incubeer de cellen bij 37 ˚C, in ambient O2/5% CO,2 met dagelijkse middellange verandering voor 5 dagen.
      Opmerking: De reproduceerbaarheid van differentiatie tussen individuele putten kan efficiënt worden bepaald door het meten van het relatieve niveau van albumine, AFP of APOB uitgescheiden in het medium door ELISA (zie 3.2).

3. klein molecuul Screening

Opmerking: Het volgende beschrijft de procedure waarmee verbindingen die kunnen worden gebruikt voor het verlagen van het niveau van APOB in het medium van de hepatocyte-achtige cellen afgeleid van familiale hypercholesterolemie iPSCs wordt aangeduid. Een beschrijving van het model en het gebruik ervan in de identificatie van cholesterolverlagende medicijnen is beschreven in detail eerder5,9. In het huidige voorbeeld werden 1000 stoffen uit de bibliotheek van South Carolina samengestelde collectie (SC3) vertoond. Elke compound werd getest op een concentratie van 2 μg/mL.

  1. Behandeling van iPSC - afgeleide hepatocyten met kleine moleculen
    1. Verdun de master samengestelde bibliotheek wilt genereren platen van werkende voorraden met verbindingen met een concentratie van 20 μg/mL in 2% DMSO en winkel op-20 ˚C.
    2. Bereiden genoeg 96-wells-platen van iPSC afkomstige hepatocyten toe elke verbinding te beproeven.
      Opmerking: Het aantal verbindingen worden vertoond zal bepalen het aantal 96-wells-platen die vereist zijn. In het algemeen, moet een honkslag goed worden voorbereid voor elke samengestelde, plus extra putten voor controlemonsters. De ultraperifere putjes van de plaat zijn meestal vermeden om de mogelijkheden van randeffecten die interpretatie annuleerteken omkoopbaar te beperken. Hits kunnen worden geïdentificeerd met behulp van de methode van de z-score zonder de noodzaak te gebruiken wordt gerepliceerd. Als wordt gerepliceerd opgenomen zijn, is het meer geschikt voor gebruik van de t-test.
    3. Bij de voltooiing van de differentiatie (dag 20, zie 2.3.7), vervangen door het kweekmedium 100 μl van verse HCMaangevuld met 20 ng/mL van Oncostatin-M. Incubeer bij 37 ˚C, 4% O2/5% CO2 voor precies 24 h. het kweekmedium ophalen in een verse 96-wells-plaat en de winkel op-20 ˚C. In dit voorbeeld gebruiken voor het berekenen van het niveau van APOB in het medium voor de toevoeging van drug.
    4. Voeg 90 l verse HCM aangevuld met 20 ng/mL van Oncostatin-M in elk putje. Voeg 10 μL van elke stof uit de voorraad van de werken na mengen door pipetteren. DMSO toevoegen aan 0.2% controle putten Combineer de uiteindelijke concentratie in de behandelde steekproeven en Incubeer bij 37 ˚C, ambient O2/5% CO2 voor precies 24 h. het kweekmedium verzamelen en opslaan bij-20 ˚C. Gebruik dit voorbeeld om te bepalen van het niveau van APOB na behandeling met verbindingen.
    5. Optioneel - de resterende cellen kunnen worden verwerkt voor immunokleuring, levensvatbaarheid van de cellen of analyses van mRNA niveaus met behulp van standaard benaderingen.
      Opmerking: Dit scherm is ontworpen om te identificeren van geneesmiddelen die een snelle effect gehad op APOB niveaus. Afhankelijk van het model van de ziekte, stroomafwaarts testen of werkingsmechanisme drug, kan het echter nuttig zijn voor de behandeling van het monster voor meerdere dagen.
  2. Bepalen van APOB niveaus door ELISA
    1. Bepaal apolipoproteïne B (APOB) concentratie van zowel de pre- en post drug behandelde steekproeven met een menselijke APOB ELISA development kit van de fabrikant protocollen.
    2. Voorbereiding van de volgende oplossingen
      1. Was buffer, samengesteld van 0,05% Tween-20 in PBS, pH 7.4. Bewaren bij 4 ˚C tot gebruik.
      2. Incubatie buffer, samengesteld uit 0,05% Tween-20 en 0,1% bovien serumalbumine (BSA) in PBS, pH 7.4. Bewaren bij 4 ˚C tot gebruik.
    3. Bereiden APOB (mAB 20/17) antilichaam door verder verdunnen tot 2 µg/mL in PBS, pH 7.4. Voeg 100 μl van het verdunde antilichaam per putje en na een nacht bebroeden bij 4 ˚C.
    4. Verwijder het antilichaam aan de assay platen en wassen elk goed tweemaal met 200 μL van PBS, pH 7.4.
    5. Toevoegen van 200 μl per putje van 0,05% Tween 20, 0.1% bovien serumalbumine (BSA) in PBS, pH 7.4 en uit te broeden op een schudden platform gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
    6. Een 8-punts standaard curve met behulp van 0,05% Tween-20 en 0,1% BSA in PBS, pH 7.4 met de volgende concentraties van APOB bereiden: 300 ng/mL, 200 ng/mL, 175 ng/mL, 150 ng/mL, 125 ng/mL, 100 ng/mL, 75 ng/mL, en 50 ng/mL.
    7. Verdun de test monsters 1:4 met 0,05% Tween-20 en 0,1% BSA in PBS, pH 7.4.
    8. Na 1 uur van het blokkeren met incubatie buffer, negeren de buffer en wassen van de platen assay vijfmaal met 200 μL van 0,05% Tween-20 in PBS, pH 7.4.
    9. Volledig verwijderen van alle resterende wassen buffer en 90 μL van de verdunde monsters en de normen van APOB overbrengen in de assay-platen. Incubeer bij kamertemperatuur op een shaker gedurende 1 uur.
    10. Negeren van het monster en wassen met 200 μl 0,05% Tween-20 in PBS, pH 7.4 per putje. Herhaal de wasbeurten in totaal 5 keer. Voeg 100 μl per putje van mAB LDL 11-Biotine verdunde 1:1,000 in 0,05% Tween-20 en 0,1% BSA in PBS, pH 7.4. Incubeer bij kamertemperatuur op een schudden platform voor 1 h.
    11. Negeren van het reagens en wassen met 200 μL per goed wassen buffer 5 keer. Voeg 100 μl per putje van daar-HRP antilichaam (1:1, 000 verdunning met behulp van incubatie buffer), vervolgens Incubeer bij kamertemperatuur op een schudden platform voor 1 h.
    12. Negeren van het reagens en wassen met 200 μl 0,05% Tween-20 in PBS, pH 7.4 per putje. Herhaal de wasbeurten in totaal 5 keer. Volledig verwijderen van de resterende wassen buffer aan de assay platen 100 μl per putje van Tetramethylbenzidin (TMB) substraat oplossing toevoegen en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 8 minuten.
    13. Zonder het verwijderen van de TMB substraat, direct Voeg 100 μl per putje van eindeoplossing (1N HCl).
    14. Bepaal de extinctie bij 450 nm met behulp van een afleesapparaat.
    15. Een standaard curve kan worden vastgesteld, met behulp van de methode vier Parameter logistische regressie, dan gebruikt voor het definiëren van de concentratie van APOB in elk monster10.
    16. Onderzoeken van de pre drug: na drug verhouding van APOB in elk monster te identificeren van verbindingen met het potentieel om te verlagen van APOB niveaus in het medium.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Generatie van de hepatocyte - cellen zoals: Figuur 1 beschrijft het tijdsbestek van de veranderingen die tijdens de differentiatie van menselijke iPSCs naar hepatocyte-achtige cellen optreden. De cultuur van de iPSCs op E-Cad-Fc biedt ongeveer 2 mm diameter kolonies die uitdrukking geven aan de pluripotente markering OCT4 (figuur 1A-B). De morfologie van de celle...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doel gebaseerd drugontdekking, waar kleine moleculen worden geïdentificeerd die invloed hebben op de activiteit van een specifieke proteïne, is de focus van vele bestaande screening inspanningen. Hoewel deze benadering heeft verstrekt talrijke geneesmiddelen, schermen op basis van het omkeren van een fenotype, klassieke farmacologie, meer succesvol geweest in het identificeren van first-in-class-verbindingen die klinisch doeltreffend1 zijn. Een nadeel van fenotypische drugontdekking is dat het afh...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gesteund door de National Institutes of Health (DK55743, DK087377, DK102716 en HG006398 naar S.A.D). Wij wil Dr. Behshad Pournasr, Dr. James Heslop en Ran Jing bedanken voor hun bijdragen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
100 mm x 20 mm steriele weefselkweekschalen Corning430167
100 mm x 20 mm steriele suspensiekweekschalenCorning430591
96-wells weefselkweekplaat Corning3595
Anti-human AlbuminDakoA 0001
Anti-human FOXA2(6C12)Novus BiologicalH00003170-M12
Anti-human HNF4 alphaSanta CruzSC-6556
Anti-human Oct-3/4 antibodySanta CruzSC-9081
Anti-human SOX17R&DAF1924
Anti-human TRA-1-60 FITC-geconjugeerdMilliporeFCMAB115F
Activin A Recombinant Human Protein InvitrogenPHC9563
B-27 Supplement, minus insulin Invitrogen0050129SA
B-27 Supplement, serum free Invitrogen17504044
BMP4 Recombinant Human Protein InvitrogenPHC9533
Cell Dissociation Reagent StemPro  Accutase InvitrogenA1110501
CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay Promega7572
DPBS+(calcium, magnesium)Invitrogen14040-133
DPBS-(geen calcium, geen magnesium)Invitrogen14190-144
DMEM/F-12, HEPES Invitrogen11330057
ELISA human APOB ELISA ontwikkelingskitMabtech3715-1H-20
Fibroblast Growth Factor 2 (FGF2)InvitrogenPHG0023
Hepatocyte Culture Medium (HCM Bullet Kit) LonzaCC-3198
Hepatocyte Growth Factor  (HGF)InvitrogenPHC0321
L-Glutamine Invitrogen25030081
MEM Non-Essential Amino Acids SolutionInvitrogen11140076
Oncostatin M (OSM) Recombinant Human Protein InvitrogenPHC5015
Penicillin-Streptomycin Invitrogen15140163
Feeder free pluripotent stamcelmedium: mTesR1 STEMCELL technologies5850
Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix InvitrogenA1413301
RPMI 1640 Medium, HEPES Invitrogen22400105
StemAdhere Defined Matrix for hPSC (E-cad-Fc)Primorigen BiosciencesS2071
TMB-ELISA Substraat OplossingThermo Scientific 34022
Anti-TRA-1-60 FITC-geconjugeerdMilliporeFCMAB115F
Versene (EDTA) 0.02% Lonza17-711E
Y-27632 ROCK inhibitorSTEMCELL Technologies72302

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered? Nat Rev Drug Discov. 10 (7), 507-519 (2011).
  2. Zeilinger, K., Freyer, N., Damm, G., Seehofer, D., Knospel, F. Cell sources for in vitro human liver cell culture models. Exp Biol Med (Maywood. 241 (15), 1684-1698 (2016).
  3. Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481 (7381), 295-305 (2012).
  4. Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461 (7262), 402-406 (2009).
  5. Cayo, M. A., et al. A Drug Screen using Human iPSC-Derived Hepatocyte-like Cells Reveals Cardiac Glycosides as a Potential Treatment for Hypercholesterolemia. Cell Stem Cell. 20 (4), 478-489 (2017).
  6. Nagaoka, M., et al. E-cadherin-coated plates maintain pluripotent ES cells without colony formation. PLoS One. 1, e15(2006).
  7. Ludwig, T. E., et al. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nat Methods. 3 (8), 637-646 (2006).
  8. International Stem Cell Initiative. Characterization of human embryonic stem cell lines by International Stem Cell Initiative. Nat Biotechnol. 25 (7), 803-816 (2007).
  9. Cayo, M. A., et al. JD induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes faithfully recapitulate the pathophysiology of familial hypercholesterolemia. Hepatology. 56 (6), 2163-2171 (2012).
  10. DeSilva, B., et al. Recommendations for the bioanalytical method validation of ligand-binding assays to support pharmacokinetic assessments of macromolecules. Pharm Res. 20 (11), 1885-1900 (2003).
  11. Rowland, T. J., et al. Roles of integrins in human induced pluripotent stem cell growth on Matrigel and vitronectin. Stem Cells Dev. 19 (8), 1231-1240 (2010).
  12. Nagaoka, M., Si-Tayeb, K., Akaike, T., Duncan, S. A. Culture of human pluripotent stem cells using completely defined conditions on a recombinant E-cadherin substratum. BMC Dev Biol. 10, 60(2010).
  13. Hay, D. C., et al. Efficient differentiation of hepatocytes from human embryonic stem cells exhibiting markers recapitulating liver development in vivo. Stem Cells. 26 (4), 894-902 (2008).
  14. Mallanna, S. K., Cayo, M. A., Twaroski, K., Gundry, R. L., Duncan, S. A. Mapping the Cell-Surface N-Glycoproteome of Human Hepatocytes Reveals Markers for Selecting a Homogeneous Population of iPSC-Derived Hepatocytes. Stem Cell Reports. 7 (3), 543-556 (2016).
  15. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
  16. Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. J Biomol Screen. 16 (7), 775-785 (2011).
  17. Lorenz, C., et al. Human iPSC-Derived Neural Progenitors Are an Effective Drug Discovery Model for Neurological mtDNA Disorders. Cell Stem Cell. 20 (5), 659-674 (2017).
  18. Rashid, S. T., et al. Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells. J Clin Invest. 120 (9), 3127-3136 (2010).
  19. Lu, W. Y., et al. Hepatic progenitor cells of biliary origin with liver repopulation capacity. Nat Cell Biol. 17 (8), 971-983 (2015).
  20. Ogawa, M., et al. Directed differentiation of cholangiocytes from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 33 (8), 853-861 (2015).
  21. Sampaziotis, F., et al. Cholangiocytes derived from human induced pluripotent stem cells for disease modeling and drug validation. Nat Biotechnol. 33 (8), 845-852 (2015).
  22. Mallanna, S. K., Duncan, S. A. Differentiation of hepatocytes from pluripotent stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 26 (Unit 1G 4), (2013).
  23. Song, Z., et al. Efficient generation of hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells. Cell Res. 19 (11), 1233-1242 (2009).
  24. Cai, J., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional hepatic cells. Hepatology. 45 (5), 1229-1239 (2007).
  25. Si-Tayeb, K., et al. Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51 (1), 297-305 (2010).
  26. Pashos, E. E., et al. Diverse Population Cohorts of hiPSCs and Derived Hepatocyte-like Cells Reveal Functional Genetic Variation at Blood Lipid-Associated Loci. Cell Stem Cell. 20 (4), 558-570 (2017).
  27. Davidson, M. D., Ware, B. R., Khetani, S. R. Stem cell-derived liver cells for drug testing and disease modeling. Discov Med. 19 (106), 349-358 (2015).
  28. Choi, S. M., et al. Efficient drug screening and gene correction for treating liver disease using patient-specific stem cells. Hepatology. 57 (6), 2458-2468 (2013).
  29. Tafaleng, E. N., et al. Induced pluripotent stem cells model personalized variations in liver disease resulting from alpha1-antitrypsin deficiency. Hepatology. 62 (1), 147-157 (2015).
  30. Jing, R., Duncan, C. B., Duncan, S. A. A small-molecule screen reveals that HSP90beta promotes the conversion of induced pluripotent stem cell-derived endoderm to a hepatic fate and regulates HNF4A turnover. Development. 144 (10), 1764-1774 (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Menselijke ge nduceerde pluripotente stamcellenHigh throughput screeningPlatform voor geneesmiddelenonderzoek96 wells weefselkweekplatenGedefinieerde kweekconditiesApolipoprote ne B assayModel voor familiale hypercholesterolemieProtocol voor hepatische differentiatieMethode voor compoundscreening

Gerelateerde artikelen