Methodenartikel

Visualisatie van DNA verdichting in cyanobacteriën door hoogspannings-Cryo-Elektronentomografie

DOI:

10.3791/57197

⸱

17 juli 2018

 , 
1National Institute for Physiological Sciences, 2Graduate School of Science and Engineering, Saitama University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol wordt beschreven hoe de voorbijgaande verdichting van het DNA in cyanobacteriën visualiseren. Synchrone teelt, toezicht door fluorescentie microscopie, snelle invriezen, en hoge spanning cryo-Elektronentomografie worden gebruikt. Een protocol voor deze methodologieën wordt gepresenteerd, en toekomstige toepassingen en ontwikkelingen worden besproken.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol wordt beschreven hoe de voorbijgaande verdichting van het DNA in cyanobacteriën visualiseren. DNA verdichting is een dramatische cytoplasmatische evenement onlangs gevonden optreden in sommige blauwalgen voordat celdeling. Als gevolg van de grote Celgrootte en het voorbijgaande karakter is het echter moeilijk te onderzoeken van de structuur in detail. Om te overwinnen van de moeilijkheden, eerst is DNA verdichting reproducibly geproduceerd in de cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942 door synchrone cultuur met behulp van de 12 h elke licht/donker cyclus. Ten tweede, DNA verdichting is gecontroleerd door fluorescentie microscopie en gevangen genomen door snelle bevriezing. Ten derde, de gedetailleerde structuur van DNA gecomprimeerd cellen is gevisualiseerd in drie dimensies (3D) door hoogspanning cryo-Elektronentomografie. Deze set van methoden is breed inzetbaar te onderzoeken van tijdelijke structuren in bacteriën, bijvoorbeeld de afdeling van de cel, chromosoom segregatie, faag infectie enz., die worden gecontroleerd door fluorescentie microscopie en direct gevisualiseerd door Cryo-Elektronentomografie op passende tijdstippen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA verdichting is een dramatische cytoplasmatische evenement dat in sommige blauwalgen is geconstateerd. Wanneer Synechococcus elongatus werd gekweekt tot 12u elke licht/donker cyclus, DNA verkorte verscheen aan het eind van de periode van licht, die duidelijk afweek van haar verschijning op het andere moment wijst1. Er is gesuggereerd dat dit proces wordt gecontroleerd door een circadiane klok op basis van de Kai eiwitten2. Seki et al. hebben gemeld dat het DNA gekleurd met Hoechst 33342 was gecomprimeerd in S. elongatus cellen tegen het einde van de periode van lichte en toonde een golvende staaf-vorm onder een fluorescentie Microscoop. Het gecomprimeerde DNA wordt onderverdeeld in twee in het midden van de staaf als de cel verdeeld, en ten slotte keerde terug naar een normale uniforme verdeling in elke dochtercel3. Echter belemmerd de voorbijgaande aard en groot formaat voor elektronenmicroscopie structurele analyse. Murata et al. gecombineerd verschillende methoden, met inbegrip van synchrone cultuur, fluorescentie microscopie, snelle invriezen, en hoge spanning cryo-Elektronentomografie (cryo-HVET), en geslaagd bij het identificeren van de structuur van voorbijgaande DNA verdichting, met inbegrip van de eliminatiekinetiek polyfosfaat organen (PPBs)4. Het manuscript bevat visuele uitleg van een dergelijke moeilijke materie in detail door het combineren van de experimentele procedures.

S. elongatus heeft een capsule vorm, een lengte van 2 tot en met 5 µm, een breedte van over 0,5 µm en de perfecte DNA-verdichting in levende cellen alleen voor een zeer korte tijd weergegeven. Daarom waren de structurele veranderingen in de cyanobacteriën DNA verdichting onbekend in detail. Om te onderzoeken deze structuren door elektronenmicroscopie, is het noodzakelijk om twee belangrijkste technische problemen te overwinnen. Een is de waarneming van dergelijke een dikke specimen van de hele bacterie bij in de buurt van native voorwaarden, en anderzijds de snelle vastlegging van een dynamische structuur. Wat het eerste probleem, is het inelastisch gemiddelde gratis pad (iMFP) van elektronen afhankelijk van de versnellende spanning van de elektronenmicroscoop5. In een transmissie-elektronenmicroscoop (TEM) van 300 kV, het is minder dan 350 nm. Bijvoorbeeld, wanneer een ijs-ingebedde cyanobacterium (specimen dikte ≈ 600 nm) is waargenomen in 200kV TEM (iMFP ≈ 250 nm), de structuren binnen de cel zijn moeilijk te observeren. Door contrast, 1 MV TEM (iMFP ≈ 500 nm) kan geven en beeld van de cytoplasmatische structuur in de cel (Figuur 1). In dit protocol, als een deel van de oplossing, een elektronenmicroscoop hoogspanning (HVEM) bij een versnellende spanning van 1 MV werkte. Echter zijn de faciliteiten die HVEM implementeren wereldwijd beperkt. Mogelijke alternatieve oplossingen worden ook besproken in de sectie discussie. Het tweede probleem werd opgelost door cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM). Dit is een krachtige tool voor het visualiseren van dynamische structuren op in de buurt van native voorwaarden, waar het model is snel bevroren in vloeibaar ethaan met behulp van een snelle bevriezing apparaat, en het bevroren moment is rechtstreeks waargenomen met een minimum aan wijzigingen6. Combineren met tomografie, een momentopname van driedimensionale (3D) structuren kan worden gereconstrueerd op basis van de tilt serie7. In dit experiment, DNA verdichting werd gereproduceerd in S. elongatus met synchrone cultuur tot 12u elke licht/donker cyclus en de timing van de bevriezing van het model werd bepaald door het toezicht op onder een fluorescentie Microscoop.

De benaderingen die hier worden beschreven zijn breed toepasbaar is op de studie van dynamische structuren in bacteriële cellen, bijvoorbeeld de afdeling van de cel, chromosoom segregatie en phage infectie, en hebben een potentieel om te openen nieuwe wegen in microbiologisch onderzoek.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. synchrone cultuur van cyanobacteriën

  1. Cultuur S. elongatus PCC 7942 op gesteriliseerde BG 11 plaat (in een 9 cm steriel kunststof petrischaal) met 1,5% (m/v) agar en 0,3% (m/v) natrium thiosulfate8.
  2. Plaats de platen in een zaal van de groei bij 23 ° C met een lage intensiteit van 50 µE/m2/s en onder voorbehoud van 12 h licht/12 h donkere cycli.
  3. Overdracht van de cellen op verse BG11 agar platen eenmaal per week.
    Opmerking: De culturen op de agar verschijnt als groene bands van actief delende cellen na een week onder de voorwaarde van deze cultuur.
  4. Neem groene bosjes van cellen met een vlam gesteriliseerde draad lus en streep de cellen op een verse BG11-agarplaat. Doe dit op een schone bankje.

2. toezicht door fluorescentie microscopie

  1. Gebruik cellen gekweekt op de agarplaat voor 6 dagen om te observeren DNA verdichting. Verzamelen cellen van de plaat aan het einde van de periode van lichte door gieten 1 mL 0,2 M sacharoseoplossing over de gewenste cellen. Herhaal de oplossing op de cellen gieten, zodat de meeste van de cellen worden verzameld. Breng de oplossing opgeschort-cel in een micro buis voor DNA kleuring.
  2. Toevoegen van DNA kleurstofoplossing kleurstof (bv Hoechst 33342) tot 500 µL van de geschorste cell oplossing in een micro buis naar een eindconcentratie van 1 µg/mL. Houd vervolgens de buis in het donker gedurende 10 minuten.
  3. Centrifugeer gedurende 1 minuut bij 2.000 x g aan sediment de cellen. Verwijder het supernatant en voeg 10 µL van 0,2 M sacharoseoplossing te verkrijgen van een dichte celsuspensie.
  4. Breng 1 µL van de oplossing met gekleurde cellen aan een dia glas, zet een cover slip en observeren met een fluorescentie Microscoop voorzien van een UV-filter door middel van een objectief met een vergroting 100 X en immersie-olie.
  5. Bevestig dat de DNA-verdichting wordt waargenomen op dit punt in de meeste cellen en het monster voorbereiden met de volgende stap van de bevriezing.

3. voorbeeld bevriezing voor Cryo-HVET

  1. Een duik-bevriezing apparaat instellen. Vul de tank met vloeibare stikstof en start de cryo-kamer koeling na het aansluiten van de tank en de kamer met een Teflon-buis.
  2. Vul vloeibaar ethaan in een pot klein koper binnen de kamer na het afkoelen van de zaal tot de temperatuur van vloeibare stikstof. Draag een bril tijdens operatie, omdat er vloeibaar ethaan is explosief.
  3. Gloed kwijting de koolstof-kant van een een koolstof-gecoate EM raster (een raster) voor 30 s bij 50 mA met behulp van een plasma ion bombarder.
  4. Breng 1 µL van BSA gouden tracer (15 nm) tot het een net als een fiducial marker.
  5. Toepassen op een 2.5 µL hoeveelheid cellen in de fase van de verdichting DNA het een raster. Vlek uit de overtollige oplossing met filtreerpapier. Duik het raster in vloeibaar ethaan met behulp van een zuiger in het duik bevriezing apparaat onmiddellijk.
  6. De bevroren rasters in vloeibare stikstof opslag worden opgeslagen totdat zij worden onderzocht.

4. Cryo-HVET

  1. Instellen van de HVEM bij een hoge spanning van 1 MV.
  2. Mount het bevroren raster in een cryo-monsterhouder voor HVEM precooled tot-150 ° C met vloeibare stikstof binnen de cryo-workstation, en het laden in de HVEM. Wees voorzichtig om te voorkomen dat besmetting met ijs.
  3. Selecteer een opnamegebied bij een lagere vergroting van 1, 000 X. Pas de hoogte van de z-as eucentric.
  4. Kantelen van de specimen fase tot-60 ° en verwijder het verzet van de kantelbare rotatie.
  5. Aanpassen van de focus in de buurt van de doellocatie bij een vergroting van 10, 000 X. Stel een onder focus van 6 tot en met 10 µm door de afwijking van de gerichte afbeelding. Voor imaging, stelt u de dosis op de 2 e--/Å-2 of minder op het model vooraf.
  6. De dosis van het elektron door de stroomdichtheid op het scherm van de afbeelding in HVEM meten. Neem een afbeelding op een elektron-film of door digitale camera op de dezelfde vergroting in het gericht proces.
  7. Tilt afbeeldingen handmatig verzamelen door de zelfde procedure als in (4.5) van-60 ° tot + 60 ° op een tilt hoek toename van 2 ° tot 4 °.
    Opmerking: In veel moderne elektronenmicroscopen, de verwerving van de serie tilt is geautomatiseerd door de combinatie van een digitale camera. In dat geval Volg de gebruiksaanwijzing. Voor negatieve films, ontwikkelen de films voor 12 min bij 20° C in een tank van de ontwikkelaar met behulp van een volledig-sterkte-ontwikkelaar en op te lossen in een fixer voor 10 min. digitaliseren de films met een resolutie van 4000 dpi (0.635 nm/pixel op de afbeelding) een flatbedscanner gebruikt. In het geval van een digitale camera, onverminderd de verzamelde beelden direct de volgende beeld processing stap. Indien nodig, de beeldgrootte te verminderen door een mediane filter door middel van twee tot vier weggooien (grootte reducerende factor) en de juiste software (bijvoorbeeld ImageJ).

5. tomografische reconstructie

  1. Maak een stapel afbeeldingsbestand van het individu kantelen van de beelden met behulp van de opdracht "tif2mrc" of "newstack" in de IMOD software9.
  2. Start eTomo GUI-software in de IMOD en foto parameters instellen: pixelgrootte fiducial diameter, Beeldrotatie, enz. Maak scripts.
  3. Uitvoeren van afzonderlijke programma's volgens de software dat wordt vermeld in de tabellen van materialen, waar de serie tilt is uitgelijnd met behulp van fiducial markeringen (met een gemiddelde resterende fout minder dan 0,5). Tot slot, het reconstrueren van een 3D tomogram met behulp van de SIRT-algoritme in de IMOD.
  4. Uittreksel van een regio van belang (ROI) van de tomogram en denoise met behulp van een filter denoise: een anisotrope diffusie in IMOD, een bilaterale filter in EMAN10, of een wiskundige morfologie filter11, enz., met de juiste parameters om het contrast te verbeteren.

6. segmentatie van de functie van belang

Opmerking: De hieronder beschreven procedure is specifiek voor de gebruikte software (Zie Materialen tabel) maar andere softwarepakketten kunnen in plaats daarvan worden gebruikt. Raadpleeg de gebruikershandleiding.

  1. In de 3D-Viewer-venster, open het bestand tomogram op Amira software en genereren van een OrthoSlice.
  2. Maak een segmentatie-bestand door het selecteren van een nieuwe "labelveld" in het venster Editor voor segmentatie.
  3. Handmatig traceren de grens van de functie van belang (FOI). Volg de FOI via alle tomogram segmenten. Maak een nieuw "materiaal" voor de tweede FOI, en herhaal dezelfde bewerking.
  4. Genereer een oppervlakte weergave door de "SurfaceGen"-menu. Om te visualiseren het gesegmenteerde volume, het "SurfaceView"-menu te selecteren. Gebruik de gereedschappen in de 3D-Viewer-venster te verplaatsen, roteren en inzoomen van het 3D-volume.
  5. Gebruik de Magic Wand Tool voor automatische segmentatie. Klik op een object en pas de schuifregelaars in Display en maskeren ter dekking van het bereik van waarden, zodat het object is volledig geselecteerd door haar functies.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In een precieze synchrone cultuur tot 12u elke licht/donker cyclus, toont DNA aangeduid met Hoechst een normale uniforme verdeling in de donkere voorwaarde (Figuur 2a). Echter het geleidelijk gecomprimeerd binnen de cel tijdens de periode van lichte en wordt weergegeven als een golvende staaf-achtige structuur (Figuur 2b) aan het einde van de periode van het licht. Ten slotte, de staaf verdeelt in het midden (pijlen in Figuur 2 c) en de twee delen zijn verdeeld in de dochtercellen (figuur 2d). Na de celdeling, de gecomprimeerde DNA onmiddellijk verdwijnt en het DNA keert terug naar een normale uniforme verdeling.

Wanneer een aliquoot deel van de cellen met de cellen in de laatste fase van DNA verdichting werden onmiddellijk overgebracht naar een een raster en snelle bevroren in vloeibaar ethaan en het bevroren raster werd waargenomen door 1 MV cryo-HVEM, de interne structuur van cyanobacteriën met inbegrip van DNA, thylakoïde membraan lagen, celwanden en PPBs, verscheen in een momentopname op het moment van invriezen (Figuur 3a). Veel cellen liet verschillende DNA verdichting in de cellen (witte pijlen in Figuur 3a), en kunnen gemakkelijk worden onderscheiden van normale cellen (witte pijlpunten in Figuur 3b). Sommige tentoongesteld een vernauwing in het midden van de cellen zoals verwacht vóór celdeling (gele pijl in Figuur 3a).

In 3D-tomograms, kunnen grote organellen van de cel worden gesegmenteerd; celwand, thylakoïde membraan lagen, DNA en PPBs kunnen worden onderscheiden (Figuur 4). In het bijzonder werd het gecomprimeerde DNA gescheiden door een duidelijke kloof in het cytoplasma waar het DNA werd omringd door lage dichtheid materiaal en de thylakoïde membraan lagen langs de golvende roede van gecomprimeerde DNA werden vervormd. Dynamisch gedrag van PPBs werd onlangs waargenomen: in DNA gecomprimeerd cellen, vele kleine PPBs werden beschouwd te houden aan DNA, terwijl ze groot zijn en minder in normale cellen. Bovendien, allermeest naar de PPBs verschenen als paren, en sommige DNA leek te zijn in een proces van de scheiding van de PPBs. Dit stelde dat PPBs zelf zijn onderverdeeld in twee door DNA-verdubbeling en functie als leveranciers van fosfaat voor DNA-synthese.

figure-results-1
Figuur 1. Cryo-EM beelden van ijs-embedded normale cyanobacteriën, S. elongatus PCC 7942 op verschillende versnellende spanningen. a) 200kV en b) 1000kV. Schaal bar = 500 nm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-2
Figuur 2: Fluorescentie microscopie van cyanobacterium S. elongatus cellen. Na synchrone cultuur minder dan 12 uur elk licht/donker cycli, werden cellen gekleurd met Hoechst 33342. (a) cellen na 2U voor aanvang van de donkere staat Toon uniform DNA labeling. Het DNA in vele cellen gecondenseerd geleidelijk tijdens de periode van het licht. Het vormde uiteindelijk een dikke golvende rod (b) typische van DNA verdichting. Na deze etappe, de gecomprimeerde DNA structuren snel verdeeld bij hun centra (pijlpunten) tijdens de celdeling (c), en de twee fragmenten onderverdeeld in de dochtercellen (d). De dochtercellen keerde terug naar uniforme DNA labeling opnieuw in de donkere periode. Schaal bar = 2 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-3
Figuur 3: Cryo-HVEM afbeelding van cyanobacteriën ingebed in amorfe ice. (a) toont een raw beeld bij 0 ° tilt. Beelden werden genomen aan het eind van de periode van het licht. Sommige cellen Toon golvende staafvormig DNA organen vergelijkbaar eukaryotische verkorte chromosomen (witte pijlen). In normale cellen vertonen cyanobacteriën een waarneembare DNA-structuur in het cytoplasma (wit pijlpunten). Sommige vertonen een vernauwing in het midden van de cellen zoals verwacht vóór celdeling (gele pijl). (b) xy, xz, yz-segmenten van een 3D tomogram. Gele stippellijnen Toon snijpunten van segmenten. Schaal bar = 2 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-4
Figuur 4: ultrastructuur van cellen met DNA gecomprimeerd. De belangrijkste componenten zijn gesegmenteerd: celwand (fel geel), thylakoïde membranen (rood) en DNA (blauw). (a) toont een z-segment van een 3D tomogram. (b) alle segmenten. De vernauwing die aangeeft van de scheiding van de cel wordt weergegeven in het midden van de cel (pijl). PPBs worden gemodelleerd als gele of oranje bollen; Elke oranje sfeer vertegenwoordigt de tegenhanger van de dichtstbijzijnde gele bol. Schaal bar = 500 nm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We hebben een reeks van protocollen voor het visualiseren van voorbijgaande DNA verdichting in cyanobacteriën gepresenteerd. Het basisconcept is vergelijkbaar met die van oereenstemming licht- en elektronenmicroscopie (CLEM)12. Bovendien, in deze methode, werden live cyanobacteriën gecontroleerd door fluorescentie microscopie, snel bevroren op EM rasters en direct gevisualiseerd met hoogspanning cryo-Elektronentomografie. Als een eerste toepassing, de gedetailleerde structuur van DNA gecomprimeerd bacteriecellen werd met succes gevisualiseerd in 3D. Momenteel is deze procedure geldt specifiek voor dit onderwerp, maar uitgebreider, zal worden toegepast met de gewijzigde methodologie in sommige gevallen. Hier, worden de voordelen, de beperkingen en de toekomstige mogelijkheden van deze methode besproken.

Een van de voordelen van deze methode is de 3D visualisatie van de hele cel. 1 MV HVEM gevisualiseerd met succes de dynamische structuur van de subcellular organellen in het DNA gecomprimeerd cellen. De fijne structuur in normale cellen kon echter niet worden onderscheiden als gevolg van lage afbeeldingscontrast. Toenemende inelastisch en meerdere verstrooiing in dikke specimens vervaagt de afbeelding13. Nul-verlies en meeste-waarschijnlijk-verlies beeld filteren op een energie-filter afbeeldingscontrast kunt verbeteren door het verminderen van inelastische verstrooiing14,15, maar het zal niet werken voor specimens die dikker zijn dan iMFP. De nul-verlies alsmede de meeste-waarschijnlijk pieken verlagen drastisch met specimen dikte. Het is bijzonder moeilijk te verkrijgen van een voldoende signal-to-noise verhouding voor de elektron gevoelige ijs-ingesloten specimens. Murata et al. is gebleken dat de 1MV scannen transmissie microscopie (STEM)-geeft hoger afbeeldingscontrast dan een heldere veld afbeelding in kunststof ingesloten gistcellen met 5 µm dikte, waar het afbeeldingscontrast wordt hoofdzakelijk gegeven door amplitude contrast13 . Verwacht wordt echter dat het effect van Domino schade op hogere versnelde elektronen een andere beperking aan de dosis van de bestraling voor schade-gevoelige cryo-exemplaren16 creëert. De toepassing van de Volta en Zernike fase platen17,18 voor HVEM mogelijk Domino om schade te beperken door vermindering van de totale dosis in de toekomst. Een andere beperking voor het gebruik van HVEM voor dikke specimens afkomstig is van het feit dat de gebruiker voorzieningen waarmee HVEM schaarse wereldwijd.

Met behulp van een alternatieve methode om te observeren dikke specimens, cryo-stam tomografie op 300 kV gebleken contrastrijke beelden op bevroren-gehydrateerd exemplaren met dikte meer dan enkele honderden nanometer19. Om op te halen fase contrast in cryo-stam, is pthychographic elektronenmicroscopie ook ingevoerd, waarin de plaat van de fase in de condensor lens zet een fase-gemoduleerd diffractie aan een korrelig 2D detector20. De beelden worden opgehaald door berekening uit meerdere diffractions. Voor direct en snel 3D-cryo-imaging voor grote native bevroren monsters, cryo-FIB-SEM kan ook worden gebruikt21, waar seriële afdelen met een gerichte ion beam en gezicht beeldvorming blokkeren is toegepast voor beeldvorming gehydrateerd volledig bevroren exemplaren. Hoewel deze technologieën uit te het bereik van de weergave van biologische specimens breiden, is het moeilijk om te vinden de doellocatie van de bacteriën, bijvoorbeeld het label van bacteriën, omdat het doel volledig onder het ijs is en kan niet worden geïdentificeerd voordat trimmen.

DNA verdichting produceert een duidelijke structuur in cyanobacteriën. DNA gecomprimeerd cellen zijn gemakkelijk DN zelfs zonder als gevolg van een grote dichtheid vooroordeel binnen de cellen die niet aanwezig zijn in normale cellen wordt gekleurd. Om meer lokale evenementen binnen de cel te visualiseren, is het echter noodzakelijk de fluorescently geëtiketteerde ROI overbrengen naar de elektronenmicroscoop. Voor oereenstemming licht- en elektronenmicroscopie (CLEM), zijn lichte Microscoop afbeeldingen en elektronenmicroscoop afbeeldingen over het algemeen gecorreleerd met behulp van fluorescerende latex kralen of quantumdots op EM finder rasters12. De etikettering deeltjes moet hoge elektronen dichtheid naast fluorescentie. Ze kunnen nauwkeurig en betrouwbaar correleren de standpunten tussen de twee beelden. Bovendien, door de bevestiging van het gelabelde gebied met cryo-licht microscopie, volledige overlapping van ROI kan worden bereikt tussen de twee microscopen. Wanneer het karakteriseren van meer gedetailleerde structurele gebeurtenissen in DNA verdichting, zullen deze deeltjes en cryo-light Microscoop een onmisbaar instrument voor een meer robuuste en nauwkeurige correlatie in de toekomst.

Dit artikel laat zien hoe de voorbijgaande structuur van DNA verdichting in cyanobacteriën wordt gekenmerkt door een combinatie van synchrone cultuur, fluorescentie microscopie en hoogspanning cryo-Elektronentomografie. Dit protocol is gericht op de waarneming van gecomprimeerde DNA. Door deze methode te combineren met andere nieuwe technologieën die hierboven vermeld, zal het mogelijk zijn om het proces van DNA verdichting nader te onderzoeken, en voldoende gemodificeerde methoden zijn breed toepasbaar op andere dynamische structurele gebeurtenissen in bacteriën.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs bedanken Tammo Reisewitz voor kritische lezing van het manuscript, en zowel Mako Hayashi en Sayuri Hagiwara voor zorgvuldige teelt en waarneming van cyanobacteriën, Yoshitaka Kimori voor beeldverwerking, Chihong Song, Naoyuki Miyazaki en Miyoko Nagayoshi voor het helpen met segmentatie van de structuren. Dit werk werd gesteund door het gezamenlijke programma van de studie van het Nationaal Instituut voor fysiologische Wetenschappen (NIP's) aan Y.K.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Hoechst 33342 oplossingDojindo346-079511mg/mL in H2O
Agarpoeder (voor plantencultuur)Wako016-11875
BoorzuurWako027-0219299,5%
Mangaanchloride tetrahydraatWako139-0072299%
Zinksulfaat heptahydraatWako264-0040599,5%
NatriummolybdaatWako196-0247299%
Kopersulfaat pentahydraatWako039-0441299,5%
Kobaltnitraat hexahydraatWako031-0375299,5%
NatriumnitraatWako191-0254299%
Magnesiumsulfaat heptahydraatWako131-0040599,5%
Calciumchloride dehydraatWako031-0043599,5%
CitroenzuurWako036-0552298%
EDTA-2NaDojindo343-0186199,5%
NatriumcarbonaatWako197-0158199,8%
Kaliumfosfaat dibasischWako164-0429599%
TES (Good’s buffer)Dojindo344-0265399%
FerriammoniumcitraatWako092-008021e klasse
Natriumthiosulfaat pentahydraatWako197-0358599%
BSA-goudtracer 15nmAurion215.133
Quantifoil EM rasterQuantifoil MicroToolsR3.5/1 Koperraster
ElektronenfilmsKodakSO-163
OntwikkelaarKodakD19
FixeermiddelKodakRapid fixerOplossing
FilterpapierWhatmanGrade 1
GroeikamerNKsystemLH-100SP
FluorescentiemicroscoopNikonECLIPSE 50i
Hoge spanning TEMHItachiH1250M
Cryo-monsterhouder voor HVEMGatan
DuikvriesapparaatLeicaEM CPC
Plasma Ion bombarderVacuum devicePIB-10
Vloeibare stikstofopslagTaylor-Wharton25LDB
OntwikkelingstankDosaka EMTB-3-75
FlatbedscannerNikonCoolscan 9000ED
SegmentatiesoftwareFEIAmirahttps://www.fei.com/software/amira
Tomografische reconstructiesoftwareeTOMOhttp://bio3d.colorado.edu/imod

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Smith, R. M., Williams, S. B. Circadian rhythms in gene transcription imparted by chromosome compaction in the cyanobacterium Synechococcus elongatus. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 103 (22), 8564-8569 (2006).
  2. Kondo, T. A cyanobacterial circadian clock based on the kai oscillator. CSHS Quant. Biol. 72, 47-55 (2007).
  3. Seki, Y., Nitta, K., Kaneko, Y. Observation of polyphosphate bodies and DNA during the cell division cycle of Synechococcus elongatus PCC 7942. Plant biol. 16 (1), Stuttgart, Germany. 258-263 (2014).
  4. Murata, K., Hagiwara, S., Kimori, Y., Kaneko, Y. Ultrastructure of compacted DNA in cyanobacteria by high-voltage cryo-electron tomography. Sci. Rep. 6, 34934(2016).
  5. Koster, A. J., et al. Perspectives of molecular and cellular electron tomography. J. struct. boil. 120 (3), 276-308 (1997).
  6. Lučić, V., Rigort, A., Baumeister, W. Cryo-electron tomography: The challenge of doing structural biology in situ. J. Cell Biol. 202 (3), 407-419 (2013).
  7. Murata, K., et al. Visualizing Adsorption of Cyanophage P-SSP7 onto Marine Prochlorococcus. Sci. Rep. 7, 44176(2017).
  8. Rippka, R., Deruelles, J., Waterbury, J. B., Herdman, M., Stanier, R. Y. Generic assignments, strain histories and properties of pure cultures of Cyanobacteria. J. Gen. Microbiol. 111, 1-61 (1979).
  9. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J. struct. boil. 116, 71-76 (1996).
  10. Jiang, W., Baker, M. L., Wu, Q., Bajaj, C., Chiu, W. Applications of a bilateral denoising filter in biological electron microscopy. J. Struct. Biol. 144, 114-122 (2003).
  11. Kimori, Y. Morphological image processing for quantitative shape analysis of biomedical structures: effective contrast enhancement. J. Sync. Rad. 20, 848-853 (2013).
  12. Jun, S., Zhao, G., Ning, J., Ga Gibson,, Watkins, S. C., Zhang, P. Correlative microscopy for 3D structural analysis of dynamic interactions. J. Visual. Exper. 76, e50386(2013).
  13. Murata, K., Esaki, M., Ogura, T., Arai, S., Yamamoto, Y., Tanaka, N. Whole-cell imaging of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae by high-voltage scanning transmission electron tomography. Ultramicros. 146, 39-45 (2014).
  14. Kortje, K. H., Paulus, U., Ibsch, M., Rahmann, H. Imaging of thick sections of nervous tissue with energy-filtering transmission electron microscopy. J. Microsc. 183, 89-101 (1996).
  15. Bouwer, J. C., et al. Automated most-probable loss tomography of thick selectively stained biological specimens with quantitative measurement of resolution improvement. J. Struct. Biol. 148 (3), 297-306 (2004).
  16. Egerton, R. F., Li, P., Malac, M. Radiation damage in the TEM and SEM. Micron. 35 (6), 399-409 (2004).
  17. Danev, R., Buijsse, B., Khoshouei, M., Plitzko, J. M., Baumeister, W. Volta potential phase plate for in-focus phase contrast transmission electron microscopy. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 111 (44), 15635-15640 (2014).
  18. Murata, K., et al. Zernike phase contrast cryo-electron microscopy and tomography for structure determination at nanometer and subnanometer resolutions. Structure. 18 (8), 903-912 (2010).
  19. Wolf, S. G., Houben, L., Elbaum, M. Cryo-scanning transmission electron tomography of biological cells. Nat. Methods. 11 (4), 423-428 (2014).
  20. Ophus, C., et al. Efficient linear phase contrast in scanning transmission electron microscopy with matched illumination and detector interferometry. Nat. Comm. 7, 1-7 (2016).
  21. Schertel, A., et al. Cryo FIB-SEM: Volume imaging of cellular ultrastructure in native frozen specimens. J. Struct. Biol. 184 (2), 355-360 (2013).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

DNA compactie bij cyanobacteri nfluorescentiemicroscopiesynchrone cultuurDNA visualisatiecryo specimenhoudertilt serie reconstructieSIRT algoritmeoppervlakteredendering3D tomogramanalyse

Gerelateerde artikelen