Kwantificering van Site-specific eiwit Lysine Acetylation en Succinylation stoichiometrie met behulp van spectrometrie van de massa van het gegevens-onafhankelijke overname

Samenvatting

Hier presenteren wij onbevooroordeelde kwantificering van site-specific eiwit acetylation en/of succinylation bezetting (stoichiometrie) van een volledige Proteoom door middel van een analyse van de ratiometric van endogene aangebrachte wijzigingen na kwantitatieve chemische acylering met behulp van stabiele isotoop-geëtiketteerden anhydriden. In combinatie met de Spectrometrie van de massa van de gevoelige gegevens-onafhankelijke acquisitie, worden nauwkeurige site bezetting metingen verkregen.

Samenvatting

Posttranslationele wijziging (PTM) van eiwit lysine residuen door N_Ɛ- acylering induceert structurele veranderingen die dynamisch eiwitfuncties, reguleren kunnen, bijvoorbeeld door enzymatische activiteit te wijzigen of door bemiddeling van interacties. Precieze kwantificering van site-specific eiwit acylering bezetting of stoichiometrie, is van essentieel belang voor het begrijpen van de functionele gevolgen van zowel globale low-level Stoichiometrie en individuele op hoog niveau acylering stoichiometrie van specifieke lysine residuen. Andere groepen hebben melding gemaakt van meting van lysine acetylation stoichiometrie door vergelijking van de verhouding van peptide voorloper isotopen van endogene, natuurlijke overvloed acylering en exogene, zware isotoop-geëtiketteerden acylering geïntroduceerd na kwantitatieve chemische acetylation van eiwitten met behulp van stabiele isotoop-geëtiketteerden azijnzuur-anhydride. Dit protocol beschrijft een geoptimaliseerde aanpak met verscheidene verbeteringen, waaronder: (1) verhoogde chemische acylering efficiëntie, (2) de mogelijkheid voor het meten van eiwit succinylation naast acetylation, en (3) verbeterd kwantitatieve nauwkeurigheid gevolg verminderde storingen met fragment ion kwantificering van gegevens-onafhankelijke acquisities (DIA) in plaats van voorloper ion signaal van gegevens-afhankelijke acquisition (DDA). Het gebruik van uitgepakte piek gebieden van fragment ionen voor kwantificering kan ook uniek differentiatie van op siteniveau acylering stoichiometrie van Proteolytische peptiden met meer dan één lysine residu, wat niet mogelijk met behulp van de voorloper van ion signalen voor kwantificering. Data visualisatie in Skyline, een open source kwantitatieve proteomics omgeving, zorgt voor gemakkelijk gegevens controle en beoordeling. Deze workflow biedt samen, onpartijdige, nauwkeurige en correcte kwantificering van site-specific lysine acetylation en de succinylation bezetting van een hele Proteoom, die kan onthullen en prioriteren van biologisch relevante acylering sites.

Inleiding

N_Ɛ- acylering van eiwit lysine residuen is een belangrijke regulator van eiwitfunctie. Lysine-acetylation en andere organische, zoals succinylation, malonylation en glutarylation, worden verondersteld om te regelen van de stofwisseling, cel signalering en andere cellulaire processen^1,2,3,4 , en gevolgen hebben in metabolische wanorde⁵. Talrijke studies hebben geconstateerd dat lysine acyl wijzigingen ondergaan grote vouw-veranderingen onder verschillende omstandigheden in zoogdieren weefsels en cell lijnen^5,,^6,,^7,8 , evenals bacteriën^9,10,11, echter deze relatieve vouw veranderingen bieden geen inzicht in het aandeel van de totale proteïne bewerkt. Studies rapporteren metingen van acylering site bezetting zijn schaars^12,13,14, ondanks de relevantie en behoefte aan dergelijke studies, aangezien zij meer detail dan de relatieve vouw bieden wijzigen. Een 10-fold verandering kon vertegenwoordigen bijvoorbeeld de verhoging van de bezetting van een site van 0,01 tot 0,1%, 1 tot en met 10% of zelfs 10 tot 100%. Nauwkeurige stoichiometrie metingen zijn vereist te interpreteren biologische betekenis van acylering en te voorspellen gevolgen met betrekking tot de omvang van de structurele, eiwit en eventueel, functionele veranderingen.

Een vorige methode te kwantificeren van de bezetting van de site maakt gebruik van zware testing-isotoop chemische labeling van ongewijzigde lysine residuen gevolgd door Spectrometrie van de massa te meten van de verhouding tussen endogene "light" acetylation in vergelijking met de exogene, chemisch-geëtiketteerden "zware" acetyl-lysine voorloper ion intensiteiten¹²gebruikt. Een andere recente studie door Zhou et al. ¹³ beschreven een soortgelijke aanpak om te beoordelen van lysine acetylation stoichiometrie die ook een volledige chemische acetylation van alle ongewijzigde lysine residuen in eiwitten met stabiele isotoop labeling aangewend, maar fragment ion intensiteiten zoals gemeten door ONTWIKKELINGSAGENDA VAN DOHA. Nakayasu et al. ¹⁴ een soortgelijke aanpak van de DDA gebruikt, maar in plaats daarvan gebruikt de verhouding van lichte en zware acetyl-lysine immonium ionen voor kwantificering. Kwantificering op basis van fragment ionen, immonium of sequentie ionen (MS2), in de meeste gevallen resulteert in minder signaal storingen in vergelijking tot de verwerking van ionen (MS1) voorloper intact peptide. Echter, kwantificering van fragment ionen uit DDA gegenereerde MS/MS-spectra kan lijden stochastische bemonstering tekortkomingen, waar de voorloper van de hoge-overvloed-ionen zijn meer kans om te worden geselecteerd voor MS/MS en dus leiden tot een partijdig en onvolledig bemonstering van voorloper van de ionen.

Deze nieuwe werkstroom⁴ (Figuur 1) gebruikt conceptueel een stabiele isotoop chemische aanpak oorspronkelijk ontwikkeld door Baeza et al.labeling. ¹², echter is de werkstroom vervolgens gekoppeld aan DIA te verzamelen van zowel voorloper en meerdere fragment ion abundanties over de detecteerbare massa variëren^15,16 verstrekken van nauwkeurige stoichiometrie berekeningen.

Piek gebieden van fragment ionen die de site acylering van belang bevatten, of 'differentiëren fragment ionen', worden gebruikt om te kwantificeren acylering site bezetting (Figuur 2). Fragment ionen die de wijziging geen identieke lichte en zware m/z-waarden, en worden gebruikt voor peptide identificatie, maar niet voor de kwantificering. Skyline software¹⁷ wordt gebruikt voor het uitpakken van de voorloper en fragment piek gebieden. De aanwezigheid van meerdere fragment ionen met een bepaalde acylering-site biedt flexibiliteit als storingen worden aangetroffen in enkele van de fragment-ionen. Data visualisatie in Skyline zorgt voor kritische inspectie van licht-tot-zware fragment ion ratio's. Naast handmatige data-analyse, werd een open-source R pakket geschreven in eigen huis, StiochiolyzeR (https://github.com/GibsonLab/StoichiolyzeR), ontwikkeld, die de voorloper ion en fragment ion gegevens verzameld door middel van de DIA worden gebruikt en kwantificeert Sitespecifiek acylering stoichiometrie van peptiden die meerdere lysine residuen, een functie die niet mogelijk zijn met voorloper alleen-ion intensiteit metingen⁴.

Dit protocol ook demonstreert het gebruik van endoproteinase Glu-C, die specifiek is voor C-terminal decollete op glutaminezuur en asparaginezuur residuen, in plaats van het gebruik van tripsine of Arg-C protease, als de laatste vaak zeer grote produceren en potentieel vermenigvuldigen GEACYLEERDE Proteolytische peptiden als gevolg van geblokkeerde trypsine decollete op GEACYLEERDE lysine residuen. De chemische stof labeling procedure werd ook uitgebreid met gebruik van succinic anhydride (en) (Figuur 1), waardoor de kwantificering van succinylation stoichiometrie succinylation. Naast verbeteringen aan de bereiding van de monsters, de uitvoering van peptide fractionering door offline, fundamentele pH, daalde omgekeerd-(bRP) fasenscheiding van peptiden verder kwantificering storingen, waardoor betere ambtshalve convolutie van acylering stoichiometrie in hele Proteoom monsters. Samen, deze methode beschikt en hoogtepunten van verschillende voordelen: (1) verhoogde efficiëntie van chemische acylering; (2) meting van eiwit succinylation stoichiometrie naast acetylation; en (3) verbeterde kwantificering nauwkeurigheid. De verbeterde kwantificering is te wijten aan verminderde storingen in fragment ion signalen van DIA in vergelijking met de DDA voorloper signaal, alsmede de uitvoering van off-line peptide pre fractionering van bRP.

Protocol

1. kwantitatief Acetylate en/of Succinylate eiwitten met behulp van isotopen-geëtiketteerden azijnzuur of Succinic anhydride (en)

1. Bereiden 3 replicatieonderzoeken van 100 µg bovien serumalbumine (BSA) eiwitSteekproef parallel, in een concentratie tussen 1 µg/µL (totaal 100 µL), met behulp van ureum en triethylammonium bicarbonaat (TEAB) oplossing (8 M ureum, 200 mM TEAB, pH 8).
   Opmerking: Het is belangrijk dat het gebruik van amine-vrije buffer. De eiwitsteekproeven hier gebruikt in de sectie representatieve resultaten zijn BSA, kwantitatief BSA, succinylated en mengsels daarvan opbrengst BSA monsters met gedefinieerd succinylation bezetting op 0%, 1%, 10%, 50% en 100%, respectievelijk (elk monster zal worden voorbereid in 3 wordt gerepliceerd). Dit protocol is ook uitgevoerd met behulp van eiwit lysates van Escherichia coli en lever⁴muis. Het protocol kan ook worden toegepast op andere cel of een weefsel lysates.
2. Verlagen 100 µL van BSA monster (100 µg) met 8 µL van 250 mM dithiothreitol (DTT) te bereiken een eindconcentratie van 20 mM DTT en Incubeer het monster bij 37 ° C gedurende 30 minuten met agitatie bij 1400 t/min.
3. Alkylate de BSA deelmonster met 21.6 µL van 200 mM iodoacetamide te bereiken een eindconcentratie van 40 mM iodoacetamide en Incubeer het monster in het donker bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
   Opmerking: Het is belangrijk dat de concentratie van de iodoacetamide iets meer dan 2 x van de concentratie van DTT om ervoor te zorgen dat alle eiwit thiolen verminderd zijn Gealkyleerde.
4. Doorgaan met de voorbereiding van azijnzuur-anhydride -d₆ (stap 1.4.1) of succinic anhydride (en) -d₄ (stap 1.4.2) die nodig zijn voor chemische (kwantitatieve) acetylation of succinylation van de monsters.
   1. Het bepalen van de molarity (M) van het afgepipetteerde deel. 1 g van waterige azijnzuur anhydride -d₆ -oplossing van het molecuulgewicht (108.13 g/mol) en dichtheid (1.143 g/mL bij 25 ° C).
      Opmerking: De 1 g-pakket bevat 9,248 µmol van azijnzuur-anhydride -d₆ in 875 µL volume, opbrengst van een 10.57 M-oplossing gebruikt voor de per-acetylation van de monsters.
   2. Bereid een 5 M-oplossing voor succinic anhydride (en) -d₄ door het poeder in watervrij DMSO onmiddellijk voorafgaand aan de reactie te voorkomen de hydrolyse van het reagens oplost. Los 0,24 g succinic anhydride (en) -d₄ in 461 µL van watervrij DMSO te verkrijgen van een oplossing van 5 M.
5. Het uitvoeren van kwantitatieve chemische acetylation of succinylation door respectievelijk toe te voegen 60 µmol van azijnzuur-anhydride -d₆ (6 µL van de oplossing 10.57 M) of succinic anhydride (en) -d₄ (12 µL van de 5 M oplossing), en Incubeer de monster bij 4 ° C gedurende 20 minuten op een vortex-mixer.
   Opmerking: Als gevolg van de zuurgraad van afgeleide anhydriden, eiwitten kunnen neerslaan. Neem nota en aanpassen zoals beschreven in stap 1.6.
6. Voeg 10 µL van 7,25 M NaOH na de incubatie te verhogen van de pH tot en met ~ 8 te heffen geen O-acylering kant-producten. Vortex kort en controleer de pH van het monster door spotten 1 µL op pH-papier.
   Opmerking: Het kan noodzakelijk zijn om toe te voegen meer dan 10 µL van 7,25 M NaOH te bereiken pH 8 zijn. Potentieel neergeslagen eiwitten moeten bovendien opnieuw los.
7. Herhaal de per-acylering en pH aanpassing 1.5 en 1.6 voor een totaal van drie keer. Controleer de pH-waarden en noteer de hoeveelheid basisoplossing toegevoegd per herhaling. Werk snel tijdens het bovenstaande chemische acylering stappen omdat de afgeleide anhydriden zal gehydrolyseerd en reactiviteit te verliezen.
8. Na de definitieve labeling reactie en pH aanpassing, voeg 10 µL van 50% hydroxylamine-oplossing om terug te keren O-acylering kant reacties.

2. Digest reageerde EiwitSteekproeven met behulp van Glu-C Endoproteinase

1. Verdun de concentratie ureum tot 0.8 M met 50 mM TEAB, pH 8 en normaliseren van de volumes van de steekproef.
2. De eiwitsteekproeven verteren door toevoeging van endoproteinase Glu-C aan een 1:50 protease aan substraat eiwitverhouding (w/w) en uit de monsters bij 37 ° C's nachts met agitatie bij 1400 t/min te broeden.
3. Breng en doven van de spijsvertering EiwitSteekproeven door toevoeging van mierenzuur 1% volume.
4. Desalt van de monsters met behulp van hydrofiele-lipofiele evenwicht solid-phase extraction cartridges. Gebruik één 30 mg sorptiemiddel cartridge per monster, maximaal 5 mg materiaal per cartridge^4,18.
   Opmerking: Het is belangrijk dat de sorptiemiddel binnen de cartridge nat in dit hele demineralisatie proces. Wanneer nodig, draai van de vacuümpomp voor zacht waas naar de passage van het oplosmiddel of het monster door de cartridge.
   1. De cartridge(s) in de poort(en) op de 24-port glazen blok vacuüm variëteit invoegen en zet de vacuümpomp. Laat ongebruikte poort(en) afgetopt. Laat één of twee poorten un-afgetopte om lagere druk op de vacuum-meter indien nodig.
   2. NAT elke cartridge tweemaal met 800 µL van 80% acetonitril (ACN)/0.2% mierenzuur acid/19.8% water. Gehandhaafd oplosmiddel niveau 2-3 mm boven het sorptiemiddel niveau. Zorg ervoor dat de gauge vacuum op het spruitstuk leest 16,9 – 67.7 kPa (5-20 in Hg).
   3. Equilibreer elke cartridge driemaal met 800 µL van 0,2% mierenzuur in water. Zorg ervoor dat de gauge vacuum op het spruitstuk leest 16,9 – 67.7 kPa (5-20 in Hg).
   4. Laden van de peptide monsters op de cartridge. Zorg ervoor de gauge vacuum op het spruitstuk leest 6.77 – 8,47 kPa (2 – 2.5 in Hg), en het debiet niet groter is dan 1 mL/min.
   5. Wassen elke cartridge driemaal met 800 µL 0,2% mierenzuur in water. Zorg ervoor dat de gauge vacuum op het spruitstuk leest 16,9 – 67.7 kPa (5-20 in Hg).
   6. Verwijder de cassette van de vacuüm variëteit en regelen in een 1,5 mL microtube.
   7. Elueer peptiden één keer met 800 µL van 80% ACN/0.2% mierenzuur acid/19.8% water en laat het oplosmiddel te broeden met sorptiemiddel voor 2-3 min.
   8. Gebruik een pipet te duwen oplosmiddel door de sorptiemiddel laag binnen het patroon. Herhaal voor de tweede elutie van 400 µL 80% ACN/0.2% mierenzuur acid/19.8% water in de dezelfde 1,5 mL microtube.
5. Droog het eluaat door vacuüm centrifugeren (centrifugeren tarief vastgesteld op 268 x g), meestal gedurende 3 uur.
   Opmerking: Indien nodig, gedroogde eluaat monsters kunnen worden opgeslagen bevroren bij-20 ° C tot klaar om te gaan met fractionering.

3. fractionate peptiden met behulp van off line-Basic-pH en Reversed-Phase HPLC

1. Resuspendeer de per-GEACYLEERDE en Glu-C verteerd monsters (opgesteld zoals beschreven in de punten 1 en 2) in 200 µL van Buffer A (10 mM ammonium formate in water, pH 10), meng het monster gedurende 10 minuten op een vortex-mixer bij 4 ° C en centrifugeer bij 17.500 x g gedurende 10 minuten op kamer te mperature.
   Opmerking: De resulterende peptide monster is klaar om te worden off line gefractioneerde door hoge pH scheiding^19,20.
2. Het programma van de off line fractionering HPLC-methode afhankelijk van het instrument en de software die wordt gebruikt. De volgende methode is specifiek voor een binaire HPLC-pompsysteem met inbegrip van een dubbele golflengte UV-detector, een autosampler, een verzamelaar van de breuk en een C18-kolom (4.6 mm x 250 mm, 5 µm deeltjesgrootte) die pH 10 tolereert.
3. Verzamelen van 40 breuken voor 2.1 min per fractie en combineren van elke designerprijs, resulterend in vier laatste gepoolde fracties⁴. Een groter aantal gepoolde fracties kan worden gebruikt om monster complexiteit ten koste van de Spectrometrie van de massa gegevens afhaaltijd verder te reduceren.
4. Droog de gepoolde fracties in een lyophilizer, resuspendeer de monsters gedroogde peptide in 1 mL 50% ACN en 1% mierenzuur in water, en overbrengen naar een kleinere monsterrecipiënt. Droog het overgedragen monster via vacuüm centrifugeren (centrifugeren tarief vastgesteld op 268 x g), meestal gedurende 1 uur.
   Opmerking: De lage dampdruk van ammoniumnitraat formate kan bemoeilijken volledig drogen. Als grote hoeveelheden formate ammoniumzout als zout neerslag na het drogen blijven, herhaalt u de vaste fase extractie.
5. Resuspendeer de monsters in 20 µL van 0,2% mierenzuur in water met standaard mengsel van geïndexeerde retentie tijd (iRT) peptide.
   Opmerking: Monsters zijn nu klaar voor analyse door massaspectrometrie.

4. DIA analyse van gespreide Peptide monsters

1. Analyseer de monsters met behulp van een DIA LC-MS/MS methode, die kan worden aangepast volgens de massaspectrometrische instrumenten beschikbaar. De analyse werd uitgevoerd met behulp van een nano-LC 2D HPLC systeem online verbonden met een massaspectrometer voor orthogonale vierpolige time-of-flight (QqTOF).
   1. De instrument software Program zodat peptide mengsels zijn overgezet naar een C18 pre kolom chip (200 µm x 6 mm C18-CL chip, 3 µm, 300 Å) en wassen op 2 µL/min gedurende 10 minuten met het laden oplosmiddel (H₂O/0.1% mierenzuur) voor het ontzouten.
   2. Scheiden van de peptiden chromatografisch op een chip van 75 µm x 15 cm C18-CL (3 µm, 300 Å) op een debiet van 300 nL/min met een gradiënt gebruik van 2 h typische (en LC-systeem) waterige en ACN oplosmiddel buffers⁴.
   3. Het genereren van een variabele venster DIA methode, waar de ramen van de massale bereik van variabele breedte (5 tot en met 90 m/z) worden doorgegeven van de vierpolige Q1 in de cel van de botsing in incrementele stappen over het volledige massa bereik (m/z 400-1.250).
      Opmerking: De cyclustijd van 3.2 s omvat een 250 ms voorloper ion scan gevolgd door 45 ms accumulatie tijd voor elk van de 64 SWATH segmenten^21,22.
2. Identificeren van peptiden met behulp van een parallelle analyse van monsters door de DDA MS en bouw van spectrale Bibliotheken, of als alternatief, peptiden rechtstreeks vanuit DIA gegevens met behulp van de PIQED software²³, die alle technische maatregelen van de gegevensverwerking behandelt, kunnen worden geïdentificeerd identificatie en invoer in Skyline voor daaropvolgende kwantificering.

5. voorbeeld Data analyse Tutorial

1. Download de Skyline software (http://proteome.gs.washington.edu/software/skyline) en maak een PanoramaWeb account (https://panoramaweb.org).
   Opmerking: Voor gedetailleerde tutorials gebruik van Skyline met gegevens beschrijven, zie (https://skyline.ms/wiki/home/software/Skyline/page.view?name=tutorials). Andere software-algoritmen kunnen in plaats daarvan worden gebruikt voor het extraheren van lichte en zware fragment ion piek gebieden uit de DIA acquisities, zoals Open SWATH²⁴, SWATH 2.0 plugin in PeakView²⁵en Spectronaut²⁶.
   1. Skyline gegevensbestand voor de succinylated BSA representatieve resultaten (Figuur 3) van Panorama openbare downloaden: https://panoramaweb.org/labkey/JoVEsuccBSA.url. Op de webpagina van Panorama, ga naar de tabel "Gerichte MS loopt" en download het sky.zip bestand kiezen de downloadlink aan de rechterkant. Pak de gedownloade .zip-map en dubbelklik op het bestand skyline.sky te openen in de Skyline. Controleer de peptide fragment ion doel boom (linkerdeel) en de vier chromatogrammen van gedefinieerde percentages van lichte succinylation (juiste panelen).
   2. Selecteer het menu "Beeld", navigeer naar "pieken | Repliceren vergelijking". Het deelvenster van de "Peak gebieden – repliceren vergelijking" met bar grafieken zal verschijnen aan de rechterkant van het venster. In het deelvenster pieken, klik met de rechtermuisknop en selecteer "overgangen | Single", waarin het fragment ion piekoppervlakte voor het geselecteerde fragment-ion. Ten slotte met de rechtermuisknop op het deelvenster "Peak gebieden" en selecteer "bestelling | Document".
   3. In het doel boom paneel aan de linkerzijde van het venster, klik met de rechtermuisknop op de peptide "E.LCKVASLRE. T | Ratio's aan | Oneheavy", die de verhouding van lichte ion signaal over zware ion signaal, licht/zware berekent.
      Opmerking: Dit is niet hetzelfde als stoichiometrie verhouding van de bezetting van de site van Light/(Heavy+Light).
   4. Merk op dat de doel-boom nu de verhoudingen L/H aan de rechterkant van de lichte fragment ionen rapporteert.
2. Het bepalen van de "differentiatie fragment ionen", die de acylering site van belang bevatten.
   Opmerking: Zoals aangegeven in Figuur 3, met deze exacte bijvoorbeeld de onderscheidende ionen waren vastbesloten als y₇ (hoogste gerangschikt), y₈, b₃, b₄. Merk op dat de niet-differentiëren fragment ionen een verhouding van 1 in de target-boom weergeven.
   1. In het linker paneel doel structuur onder de 588.30 ++ subknooppunt van peptide E.LCKVASLRE. T, klik op de y7 differentiëren fragment ion
      K [y₇ ] – 902.49 + (rank1) [5]
      Let op de toenemende piekhoogte en gebied.
   2. In het linker paneel doel structuur onder de 588.30 ++ subknooppunt van peptide E.LCKVASLRE. T, klik op de y₅ niet-differentiëren fragment ion een [y₅ ]-575.31 + (rang 6) [1]. Let op dat de y₅ fragment ion chromatogrammen en pieken in hetzelfde bereik voor alle monsters blijven.
   3. Blader in het deelvenster doel boom via andere differentiatie (verhouding dan 1) en niet-differentiëren (ratio van 1) fragment van ionen en Let op de wijzigingen en de patronen in de piekoppervlakte bar grafiek en chromatogrammen.
   4. Bepalen van het exacte piek gebieden voor de lichte en zware paren van de onderscheidende ionen om te berekenen van de stoichiometrie (voor meer details zie ook Meyer et al. ⁴). Klik op de "View | Documentraster"en het documentraster zal opduiken. In de top links van het documentraster, klik op "x bekeken | Overgang van resultaten"om te zien van een multi-kolom tabel met fragment ion informatie, zoals Peptide Sequence, voorloper van mz, repliceren naam, enz.
   5. Het wijzigen van de indeling van het rapport aan "de spil" door nogmaals te klikken op "Views" in het documentraster en "Weergave bewerken" om het venster van de weergave aanpassen te openen. In de linkerbenedenhoek van het venster "Weergave aanpassen", Vink de "Pivot repliceren naam" en selecteer "Ok" om het venster van de weergave aanpassen te sluiten. Observeren dat nu het venster van de tabel "Document raster: overgang resultaten" heeft herschikt groeperen de naam repliceren retentietijd, gebied, achtergrond, piek rang kolommen door repliceren (1%, 10%, 50%, 100% succinylation).
   6. Voor de peptide "E.LCKVASLRE. T"in het"Document raster: overgang resultaat"tabel, vinden de kolom"Voorloper Mz", de"Fragment Ion"kolom en de kolom 1pct_light_sw1 gebied (1% succinylation). Constateren dat er twee voorloper ionen voor dit peptide, licht (voorloper van Mz van 588.30 in de eerste 8 rijen), en zware (voorloper van Mz van 590.32 in de laatste 8 rijen).
   7. In de kolom "Fragment Ion" zoeken naar twee rijen voor de y8 fragment ion overeenkomt met het licht en de voorloper van zware ionen. Opnemen vanaf dezelfde rijen in de kolom 1pct_light_sw1 gebied, de y8 gebieden voor het licht (15,820), en de zware (1,426,461).
3. Met behulp van deze gebied piekwaarden, berekenen de stoichiometrie van de succinylation, of het aandeel gewijzigd, volgens de onderstaande formule en het verkrijgen van een verhouding van de stoichiometrie van 0,01, of 1% succinylation, die overeenkomt met het aandeel van de lichte succinylation hierin gedefinieerd mengsel van:
   
4. Bereken de stoichiometrie verhouding voor 10% succinylation met behulp van de y8 onderscheidende fragment ion gebied piekwaarden van de 10pct_light_sw1 gebied kolom, 144,953 (licht) en 1,188,041 (zwaar), te verkrijgen van een verhouding van 0.10, of 10% succinylation.
5. Bereken de stoichiometrie verhouding voor 100% succinylation met behulp van de y8 onderscheidende fragment ion gebied piekwaarden van de 100pct_light_sw1 gebied kolom, 954,513 (licht) en 16,407 (zwaar), te verkrijgen van een verhouding van 0.98 of 98% succinylation.
6. Op dezelfde manier berekenen de stoichiometrie verhouding voor 1% succinylation met behulp van de b3 onderscheidende fragment ion gebied piekwaarden van de 1pct_light_sw1 gebied kolom, 55,697 (licht) en 3,149,119 (zwaar), te verkrijgen van een verhouding van 0,01, of 1% succinylation.
7. Blijven de stoichiometrie verhouding berekeningen met behulp van de formule voor alle de onderscheidende fragment ionen, zowel y en b ionen, de succinylation van lysine stoichiometrie om waarden te verkrijgen voor mengsels van 1, 10, 50 en 100% succinylation.

Resultaten

Na de data-acquisitie, onderscheidende MS2 fragment ionen werden bepaald uit de Proteolytische GEACYLEERDE peptiden, vervolgens uitgepakte ion chromatogrammen (XIC) werden verwerkt in de Skyline en bijbehorende licht en zware pieken die werden uitgevoerd Ten slotte gebruikt voor het berekenen van de bezetting van de site. Figuur 2A toont een conceptuele illustratie van hoe het XIC voorloper-ion kan verschijnen featuring zowel lichte en zware peptide-signalen, en figuur 2B presenteert een voorbeeld van het overeenkomstige fragment ion XICs met kleurcodering (rood = licht; blauw = zware ) voor het fragment ionen met de lysine acylering wijzigingen te differentiëren.

Figuur 3 toont gegevens die voortvloeien uit een experiment van de bezetting, zoals beschreven hierboven het analyseren van de vooraf gedefinieerde verhoudingen van licht/zware succinylated BSA intern gegenereerd op 1, 10, 50 of 100% en de bepaling van succinylation bezetting daarvan. DIA bezetting gegevens importeren Skyline kunt eenvoudige visualisatie van de boom van de doelgroep, weergave van peptide reeksen en fragment ionen, zowel voor de voorloper van lichte en zware ionen (figuur 3A). Gegevens uit DIA-MS voor elke gedefinieerde succinylated BSA verhouding bleek immanently de relatieve verschillen in verhouding van licht-tot-zware y₇ ion, de hoogste gerangschikte onderscheidende fragment ion van de geïdentificeerde peptide-spectra wedstrijd (aangegeven in rood, Figuur 3B). Figuur 4 geeft een overzicht van de verwerkte resultaten van de berekening voor de bezetting van MS2 die bevestigd van de succinylation percentages bezetting van input eiwit, hier uit de pre-succinylated BSA. Gemeten lysine succinylation bezetting voor 20 Proteolytische succinylated peptiden verkregen uit commerciële pre-succinylated BSA, succinylated gedefinieerde percentages (bijvoorbeeld0, 1, 10, 50 en 100%) worden weergegeven in tabel 2. Voor elk van de 20 Proteolytische BSA peptiden, de hoogste gerangschikt, differentiëren MS2 fragment ion werd gebruikt voor het berekenen van lysine succinylation (Ksucc) bezetting, als L/(L+H) in %. Over het geheel genomen de kwantificering MS2 gebaseerde bleek zeer goede nauwkeurigheid bij het bepalen van acylering bezetting zelfs bij lage stoichiometries.

Figuur 1: stoichiometrie werkstroom. (A) eiwitten driemaal met azijnzuur anhydride -d₆ tot en met acetylate van ongewijzigde lysine residuen worden geïncubeerd. Volgende, geacetyleerd eiwitten zijn met endoproteinase Glu-C, gevolgd door HPLC versplintering van de Proteolytische peptiden met behulp van basic-pH reversed-phase chromatografie verteerd. Ten slotte, peptiden zijn geanalyseerd door LC-MS DIA met variabele voorloper venster breedtes. (B) dezelfde werkstroom wordt gebruikt om te bepalen de stoichiometrie van de succinylation zoals beschreven in (A), met uitzondering van het zware acylering reagens is gewijzigd naar succinic anhydride (en) -d₄. Figuur overgenomen van Meyer et al. ⁴ (J. Am. Soc. massa Spectrom., Open Choice). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2: voorbeeld van mogelijk gegevens die zijn verkregen en de berekeningen van de stoichiometrie. (A) licht (L) en zware (H) MS1 voorloper ionen met een geacetyleerd lysine 3 massa-eenheden van elkaar verschillen. XICs worden gegenereerd voor zowel lichte als zware isotopische enveloppen die worden aangegeven in rood en blauw, respectievelijk. (B) kwantificering van de MS2 fragment ion XICs van DIA acquisities kan worden uitgevoerd met behulp van 'differentiëren' fragment van lichte en zware ionen die de acetylation site bevatten aangegeven in rood en blauw. Gemeenschappelijke fragment ionen worden weergegeven in de gestippelde zwart en bevatten niet de site van wijziging. Figuur overgenomen van Meyer et al. ⁴ (J. Am. Soc. massa Spectrom., Open Choice). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 3: Skyline visualisatie van succinylated Proteolytische BSA peptide op verschillende bezettingsgraad. (A) Skyline Target boom tonen de Proteolytische peptide LCKsuccVASLRE en de daaruit voortvloeiende fragment ionen. (B) Skyline geëxtraheerd fragment ion chromatogrammen op verschillende niveaus van succinylation bezetting. De hoogste gerangschikte onderscheidende ion, y₇, verhoogt in piekoppervlakte 1, 10, 50 en 100% correleren aan de input percentage van pre-succinylated BSA (intern gegenereerd). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 4: beoordeling van de BSA acylering stoichiometrie van pre-succinylated BSA. Vijf verschillende monsters van de BSA gedefinieerde percentages van zware wijziging (bijv., bij 0, 1, 10, 50 en 100%) werden onderworpen aan MS2 bezetting bepaling. Site bezetting voor 20 succinylated BSA peptides werden bepaald door de hoogste gerangschikte onderscheidende fragment ionen voor vijf verschillende monsters van de BSA gedefinieerde percentages van lichte wijziging (bijvoorbeeld0, 1, 10, 50 en 100%). Het vak Whisker perceel toont de verdeling van de 20 succinyl peptiden, waarden van 50% van peptiden zijn in de 'box' (25% percentiel op 75% percentiel), de bovenste friemeltje duidt de waarden van 75% percentiel tot maximaal (100%) en de lagere friemeltje duidt de waarden van 25% percentiel tot minimum (0% percentiel). (J. Am. Soc. massa Spectrom., Open Choice). Kwantificeren van metingen kan worden gevonden in tabel 2. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Tijd (minuten)	% A	% B
0,00	100	0
7.27	92	8
45.27	73	27
49,27	69	31
65.27	61	39
72.27	40	60
80,00	10	90
85,00	10	90
86,00	100	0
120,00	100	0
Debiet: 0,7 mL/min
Buffer A: 10 mM ammonium formate in water, pH 10
Buffer B: 10 mM ammonium formate in 90% ACN en 10% water, pH 10
Opmerking: De pH van beide mobiele fasen aangepast aan 10 met nette ammoniak

Tabel 1: kleurovergang voor off line basic-pH omgekeerd-fase HPLC fractionering. Kleurovergang lengte: 120 min. Buffer A: 10 mM ammonium formate in water, pH 10. Buffer B: 10 mM ammonium formate in 90% ACN en 10% water, pH 10.

L / L + H in %	L / L + H in %	L / L + H in %	L / L + H in %	L / L + H in %
Ksucc 0%	Ksucc 1%	Ksucc 10%	Ksucc 50%	Ksucc 100%
0.2	1.7	11.1	50,9	99,2
1.2	2.3	12.3	49,4	97,6
2.9	3.8	14	48,6	99,5
0,5	1.8	11.7	50,8	99,5
0.2	1.7	11.1	48.3	98,2
0.2	1.2	11	47,5	96,1
0.3	1.6	12,8	51	99,2
3.7	5.2	14,7	51,9	89,5
1.5	1.8	12,5	47.2	91,1
0.8	1.5	11.3	48.4	96,8
0.2	1.6	13,9	49.7	98.9
0.1	1.1	10,7	48.2	98,6
0.2	0.9	10.3	49,4	99,4
0,5	2.5	17.2	52,3	97,5
0.1	3.5	20,8	51	99
0.3	1.9	10,7	49.6	98,2
2	1.7	10.9	47,7	96,3
0.3	1.2	10	53	98
1.1	1.8	12.9	57,9	94,1
0.2	1.4	11.6	48,6	98,8

Tabel 2: kwantificering van gemeten BSA lysine succinylation bezetting voor 20 Proteolytische succinylated peptiden. Succinylated peptiden verkregen uit commerciële pre-succinylated BSA, succinylated gedefinieerde percentages (bijvoorbeeld0, 1, 10, 50 en 100%). Voor elk van de 20 Proteolytische BSA peptiden, de hoogste gerangschikt, differentiëren MS2 fragment ion werd gebruikt voor het berekenen van lysine succinylation (Ksucc) bezetting, als L/(L+H) in %.

Discussie

Dit protocol biedt een roman en nauwkeurige methode te kwantificeren site-specific lysine acetylation en bezetting van de succinylation die kan worden toegepast op een hele Proteoom. Deze methode is gebaseerd op meting van endogene lichte peptiden en exogene zware peptides, de laatste van die zijn gegenereerd in vitro kwantitatieve chemische acylering van eiwitten met Halfzwaar azijnzuur anhydride -d₆ of Succinic anhydride (en) -d₄ (Figuur 1). Soortgelijke methoden hebben gebruikt stabiele isotopische labeling van inheemse ongewijzigde lysine residuen en uitgevoerd site bezetting kwantificering op basis van beide voorloper alleen-ion¹² of fragment ionen van^13,14van de overnames van de DDA. Dit protocol geldt verschillende stappen tijdens de bereiding van de monsters voor acylering-efficiëntie en breidt de chemische labeling te succinylation. Verzamelen van de gegevens met behulp van DIA acquisities verkrijgt zowel MS2 fragment als voorloper ion ion intensiteiten over het gehele detecteerbare massa bereik, waardoor de fragment ion storingen. Analyse en kwantificering via Skyline en aangepaste scripts intern ontwikkeld zodat de site bezetting berekening voor peptides met meer dan één lysine residu en meer dan één acylering op één site.

Er zijn verschillende kritische stappen tijdens de fase van de bereiding van het monster van dit protocol dat dient strak gevolgd te worden. Aangezien het gehele protocol is afhankelijk van efficiënte chemische modificatie van alle lysine residuen, is deze stap van het allergrootste belang. Afgeleide anhydriden reageren met gratis amines, zodat amine-bevattende buffer of verontreinigingen moleculen in het eiwit lysate moeten worden vermeden. Ook tijdens de chemische per-acylering stap, ervoor zorgen dat de pH van het reactiemengsel terug naar pH 8 na elk van de drie incubations met zwavelzuuranhydride reagens wordt aangepast als deze reactie het mengsel verzuurt, en O-acylering kant-reacties kunnen vormen. Bovendien is verdunning van de 8 M ureum-bevattende reactiemengsel aan rond 0,8 M ureum voorafgaand aan de spijsvertering en controleren dat de pH binnen het optimale bereik ligt belangrijk voor de optimale activiteit van de endoproteinase Glu-C. Een ander belangrijk onderdeel van ons protocol is de stap van de collectie gegevens en de invoering van een DIA-workflow, die overwint inconsistenties gegevens bemonstering DDA en waarmee voor kwantificering niveau MS2 fragment ion. Een belangrijkste voordeel van de methodologie van de DIA is de daling van de storingen die doorgaans veel meer geneigd en problematisch wanneer de MS1 voorloper ion signaal te kwantificeren (zoals sommigen van de eerdere publicaties hebben gesuggereerd).

Verschillende wijzigingen aan de workflow kunnen worden gemaakt bij de voorbereiding van zeer complexe monsters. Het aantal breuken samengevoegd nadat de off line basic-pH omgekeerd-fase HPLC fractionering kan worden verlaagd om de complexiteit van de samengevoegde monsters die zal worden verworven door LC/MS. bovendien langer chromatografische verlopen kan ook lager worden gebruikt tijdens overname te voorzien in betere scheiding van de peptide. Meerdere proteasen kunnen ook, worden gebruikt om te verteren monsters te produceren van een grotere verscheidenheid van gekloofd peptiden en vergroten van de dekking van eiwit lysine residuen. Proef runs en optimalisatie kunnen worden uitgevoerd met gebruikmaking van commerciële BSA met specifieke percentages van acetylation of succinylation.

Een beperking bij dit protocol is potentieel lichte site bezetting overschatting wijten aan andere lysine wijzigingen, zoals methylering of ubiquitination, etc., op dezelfde site⁴vermist. Berekend op basis van de gebieden van de piek van lichte en zware acyl wijzigingen, L/(L+H), is de bezetting van de site gebaseerd op de veronderstelling dat het totale niveau van de wijziging op een lysine-site uit alleen endogene 'light' acylering (L bestaat) en chemisch met het label 'zwaar' acylering (H). Echter, de werkelijke totale acylering bezetting op een site in vivo eventueel andere wijzigingen dan acetylation en/of succinylation. Bovendien, de gerapporteerde isotopische zuiverheid van de aangekochte reagentia azijnzuur anhydride -d₆ (99%) en succinic anhydride (en) -d-₄ (> 98%) kan bijdragen aan een kleine overschatting van maximaal 2% (succinyl) of 1% (acetyl) van de endogene acylering niveau⁴. Samen, deze lichte overestimations toevoegen aan de moeilijkheid in het kwantificeren van sites met minder dan 1% bezetting. Grote overvloed verschillen tussen de complete chemisch GEACYLEERDE peptiden en de inheemse GEACYLEERDE peptiden ook bijdragen tot potentiële site bezetting kwantificering fouten, vooral voor lage endogene GEACYLEERDE peptiden²⁷. Een recente studie door Weinert et al. ²⁷ gevonden dat verminderde overvloed verschillen tussen volledige per-geacetyleerd peptiden de kwantificering fout^{27 verminderen kunnen}.

Stoichiometrie ondermeer verzameld met behulp van dit protocol kunnen het lokaliseren van belangrijke acylering hotspots in een bepaald eiwit en formulier hypothesen voor biologische follow-up experimenten, zoals plaats-geleide mutagenese van bepaalde gebieden van belang. Dit protocol kan onthullen ook gecombineerde effecten van lage acylering stoichiometrie sites die indirecte of subtiele invloeden op structurele eiwitstabiliteit kunnen uitoefenen en een gelokaliseerde cellulaire omgevingen. Daarnaast zou uitvoering van dit protocol voor het meten van acetylation en succinylation en andere mogelijke lysine acylering wijzigingen buiten acetylation uniek bieden inzicht in de effecten van de dynamische acylering op eiwitten onder verschillende biologische omstandigheden.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
aqueous acetic anhydride-d6	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	175641-1G	1% isotopezuiverheid
succinic anhydride-d4	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	293741	2% isotopezuiverheid
sequencing grade endoproteinase Glu-C	Roche, Indianapolis, IN, USA (door Sigma)	10791156001	1:50 protease tot substraat-eiwitverhouding (wt:wt)
Oasis HLB Solid-Phase Extraction (SPE) cartridges	Waters Corp., Milford, MA, USA	WAT 094225
HPLC acetonitrile	Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA	BJAH015-4
HPLC grade water	Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA	BJAH365-4
iodoacetamide	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	I1149-25G
dithiothreitol (DTT)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	D9779-5G
FLUKA formic acid (FA) for mass spec	Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA	C988C27	~98%
ureum	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	PI29700
runderen serum albumine (BSA)	Pierce, Rockford, IL, USA	88341
triethylammonium bicarbonate (TEAB)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	T7408-100ML
anhydrous dimethyl sulfoxide (DMSO)	Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA	43998
natriumhydroxide (NaOH)	EMDMillipore, Burlington, MA, USA	SX0590
50% hydroxylamine-oplossing in water	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	438227-50ML
LC-MS grade water	Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA	BJLC365-4
LC-MS acetonitrile	Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA	BJLC015-4
Eppendorf Themomixer Compact	Eppendorf AG, Hamburg, Duitsland	T1317-1EA
Thermo Scientific Savant SPD131DDA SpeedVac Concentrator	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	SPD131DDA-115
Waters 1525 binaire HPLC-pompsysteem	Waters Corp., Milford, MA, USA	WAT022939
Waters 2487 Dual Wavelength UV-detector	Waters Corp., Milford, MA, USA	WAT081110
Waters 717plus Autosampler	Waters Corp., Milford, MA, USA	WAT022939
Waters Fraction Collector III	Waters Corp., Milford, MA, USA	186001878
Agilent Zorbax 300Extend C18-kolom	Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, USA	770995-902
Labconco Freeze Dry System Freezone 4.5 Lyophilizer	Labconco, Kansas City MO, USA	7751000
geïndexeerd retentietijden (iRT) normalisatiepeptidestandaard	Biognosys AG, Schlieren, Zürich, Zwitserland	Ki-3002-2
Ultra Plus nano-LC 2D HPLC-systeem	Sciex LLC, Eksigent Division, Framingham, MA, USA	model# 845
orthogonaal quadrupole time-of-flight (QqTOF) TripleTOF 5600 massaspectrometer	Sciex LLC, Framingham, MA, USA	per offerte
orthogonaal quadrupole time-of-flight (QqTOF) TripleTOF 6600 massaspectrometer	Sciex LLC, Framingham, MA, USA	per offerte
C18 voorkolomchip (200 μm × 6 mm ChromXP C18-CL chip, 3 μm, 300 Å)	Sciex LLC, Framingham, MA, USA	804-00006
SWATH 2.0 plug-in voor PeakView 2.2	Sciex LLC, Framingham, MA, USA	software download Sciex
Spectronaut	Biognosys AG, Schlieren, Zürich, Zwitserland	Sw-3001
C18-CL chip (75 µm x 15 cm ChromXP, 3 µm, 300 Å)	Sciex LLC, Framingham, MA, USA	804-00001