Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Identificatie van de skeletspieren satelliet cellen met immunofluorescentie met Pax7 en Laminin antilichamen

22.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/57212

⸱

19 april 2018

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Muscle Stem Cells and Gene Regulation, National Institutes of Health, 2Office of Science and Technology, National Institute of Arthritis, Musculoskeletal and Skin Diseases (NIAMS), National Institutes of Health

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

De nauwkeurige identificatie van satelliet cellen is essentieel voor de studie van hun functies onder verschillende fysiologische en pathologische omstandigheden. Dit artikel presenteert een protocol ter identificatie van de satelliet cellen op volwassen skeletspieren secties door immunofluorescentie gebaseerde kleuring.

Samenvatting

Immunofluorescentie is een effectieve methode die helpt bij het identificeren van verschillende celtypes op weefselsecties. Om de gewenste celpopulatie te bestuderen, worden antilichamen tegen specifieke cel markeringen op weefselsecties toegepast. In volwassen skeletspieren zijn satelliet cellen (gcv) de cellen van de stam die aan spier reparatie en regeneratie bijdragen. Daarom is het belangrijk om te visualiseren en traceren van de satelliet-celpopulatie onder verschillende fysiologische omstandigheden. Rusten skeletspieren, SCs zich bevinden tussen de basale lamina en myofiber plasmamembraan. Een veelgebruikte marker voor het identificeren van SCs op de myofibers of in de cultuur van de cel is de gekoppelde vak eiwit Pax7. In dit artikel wordt een geoptimaliseerde Pax7 immunofluorescentie protocol betreffende skeletspieren secties gepresenteerd die aspecifieke kleuring en achtergrond minimaliseert. Een ander antilichaam dat een proteïne (laminin) van de basale lamina herkent is ook toegevoegd om te helpen bij het identificeren van SCs. vergelijkbaar protocollen kunnen ook worden gebruikt voor het uitvoeren van dubbele of driedubbele labelen met Pax7 en antilichamen voor extra eiwitten van belang.

Inleiding

Skeletspieren is samengesteld uit multinucleaire spiercellen, genaamd myotubes, georganiseerd in de myofibers, die kracht en bewegingen door contractie genereren. Meest skeletspieren, met uitzondering van sommige craniofaciale spieren, zijn afgeleid van een tijdelijke embryonale structuur genaamd een Somiet1. Myogenic voorlopercellen delamineren uit de epitheliale Somiet tot myoblasts. Myoblasts verder onderscheiden in myocytes die samensmelten tot myotubes multi genucleëerde myofibers vormen. Het hierboven beschreven proces heet myogenesis en wordt gekenmerkt door stoffelijk-gereglementeerde controle op de genexpressie. Myogenic precursoren express Pax3 en Pax7, terwijl myoblasts express MyoD en/of Myf5 en myocytes express myogenin en myosins2,3. Spiergroei is een proces waarin myofibers groter worden door meer myonuclei op te nemen in bestaande vezels (hyperplasie) en door een toename van de spiervezel grootte (hypertrofie)4. Tijdens de spiergroei is er een duurzame bron van myogenic cellen, die cel van de stam eigenschappen hebben dat ze kunnen onderscheiden en zelf vernieuwen. Deze cellen zijn cellen van de satelliet op basis van hun fysieke locatie tussen het sarcolemma (celmembraan van de myofiber) en de basale lamina5genoemd. SCs krachtig bijdragen aan spiergroei in de juveniele fase (de eerste 2-3 weken van de postnatale muizen), maar geven in rust volwassen spier6geworden. Opmerkelijk is, kunnen zij zitten re-geactiveerd in reactie op spier verwondingen en differentiëren in nieuwe spiercellen te herstellen van de beschadigde spier7.

De cel van de stam-eigenschappen maken de studie van SCs relevant zijn voor zowel de fundamentele spier biologie en de therapieën van spier ziekten8. Dientengevolge, kan het een gebied van intens onderzoek in de afgelopen decennia is geweest. Een enorme vooruitgang is geboekt in de ontrafeling van de genetica en de epigenetica van SCs9,10. Die betrokken zijn bij het opsporen en identificeren van SCs in situ technieken werden ontwikkeld en geoptimaliseerd langs de manier11. Immunefluorescentie kleuring kan de identificatie van SCs door het gebruik van specifieke antilichamen, met inbegrip van die voor Pax7. Echter, de schaarste en de kleine grootte van de SCs gecombineerd met een sterke auto-fluorescentie van volwassen skelet spierweefsel maken de visualisatie uitdagend. Hier beschrijven we een immunefluorescentie kleuring protocol geoptimaliseerd voor muis spierweefsel voor Pax7 en op basis van een bestaande methode voor zebrafish spier12. Bovendien is een Laminin antilichaam gemarkeerd met een aparte fluorophore aangewend om te identificeren van de basale lamina waaronder de SCs zich bevinden. Dit protocol maakt consequent de visualisatie van Pax7-positieve SCs en myogenic precursoren onder alle geteste fysiologische omstandigheden en ontwikkelingsstadia.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

In dit protocol, de anterior hind-limb spieren van volwassen muizen (2-6 maanden), tibialis anterior (TA) en extensor digitorum longus (EDL), werkten als een voorbeeld voor het uitvoeren van de immunofluorescentie kleuring op hun SCs. Alle stappen behandeling van muizen en spier weefsel dissecties zijn goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Comité (ACUC) van NIAMS/NIH.

1. het ontleden van de TA/EDL spier van de muis Hind-Limb

  1. De muis in een CO2 gevulde euthanasie kamer onder de richtlijnen van de ACUC van de NIH euthanaseren. Cervicale dislocatie uitvoeren indien nodig.
  2. Zet de muis gezicht-up op een dissectie pad (liggende). Spuiten van 70% ethanol op de huid van de buik. Een 1-2 cm opening horizontaal op het midden van de muis buikvel knipt en daarna deskin de muis door te trekken van de opening naar de voeten van de muis. Ene kant van de muis hind-limb bloot.
  3. Twee scherpe pincet gebruiken: een te houden van de pezen die de TA/EDL aan de enkel hechten, en gebruik van de andere account te breken en de fascia die betrekking hebben op de TA/EDL schuintrekken. Zodra de fascia wordt gepeld uit, gebruik het scherpe uiteinde van de verlostang om los van de TA/EDL van de tibia bot door het uitvoeren van de tip onder de TA/EDL spier te.
  4. De pezen van de enkel met een schaar afgesneden terwijl nog het houden van hen met de pincet. Trim de spier met een schaar langs de longitudinale lijn van de TA/EDL van de enkel tot de knie terwijl het opheffen van de TA/EDL vanaf de zijkant van de enkel met de pincet. Snijd de pezen van de knie-kant als u wilt loskoppelen van de hele TA/EDL van het scheenbeen.

2. Cryo-insluiting van de TA/EDL-spier

  1. Bereiden van een vloeibare stikstof bad in een container, bijv., een vloeibare stikstof Dewar kolf. Giet methylbutane in een kleine plastic bekerglas (ongeveer 20 mL) aan halfvol. Dan zet het bekerglas in het bad van de vloeibare stikstof om het te bevriezen. Na een paar minuten, controleren dat de methylbutane is bevroren.
    Opmerking: De vloeibare stikstof kan worden vervangen door een emmer van droogijs, maar de bevriezing tijd is langzamer.
  2. Leg de ontleed TA/EDL op het vlakke oppervlak van de zuiger van een kleine kunststof spuit. De TA/EDL met een paar druppels van optimale snijden temperatuur (O.C.T.) samengestelde (het bevriezing medium) volledig te dekken.
  3. Neem het bekerglas methylbutane uit de vloeibare stikstof bad en ontdooien van het oppervlak met een warm voorwerp (bv., het handvat van schaar). TA/EDL wordt snel in de gesmolten methylbutane aan module-freeze het weefsel duik de O.C.T. gedekt op de plunjer.
  4. Loskoppelen van de ingesloten weefsel van de zuiger met een tang, en zet het in een tube van 1,5 mL microcentrifuge. Plaats de buis in vloeibare stikstof te slaan tijdens het verwerken van meer monsters.
    Opmerking: Het ingesloten weefsel kan worden achtergelaten bij-80 ° C voor de lange termijn (2 jaar) of -20 ° C voor korte termijn (6 maanden).

3. de cryostaat segmenteren

  1. Voeg een druppel in het midden van een monsterhouder van een cryostaat samengestelde O.C.T.. Wacht totdat de O.C.T. compound is bijna gestold. Snel stok de ingesloten TA/EDL naar de O.C.T. compound, loodrecht met de enkel-zijde omlaag en de knie-kant omhoog.
  2. Monteren van de monsterhouder op een cryostaat, knippen het weefsel met 10 µm interval en de cryo-delen op vorst bedekt dia's met verzamelen over 4-8 secties op één dia.
  3. Droog de secties bij kamertemperatuur gedurende ten minste 3 uur om te overnachten.
    Opmerking: Hoewel de secties in de vriezer voor overnachting of langer drogen aanvaardbaar is, zal het onvermijdelijk de autofluorescence verhogen. Voor de beste resultaten, droog de secties voor 0.5 h, gaat u verder met de fixatie en kleuring stappen onmiddellijk.
  4. Verzamelen van de dia's in een dia doos en hen onmiddellijk te gebruiken, of de dia's bij-80 ° C of -20 ° C voor later gebruik opslaan.

4. bereiding van reagentia immunofluorescentie kleuring

  1. Bereiden van buffers:
    1. Bereiden van 2 L 1 x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) van 10 x PBS.
    2. Bereiden van 40 mL 4% paraformaldehyde (PFA) in 1 x PBS van 16% PFA.
    3. Bereiden van 2 L van PBST: 1 x PBS met 0,1% Triton-100.
    4. 50 mL PBST-B: PBST met 2% bovien serumalbumine (BSA) voor te bereiden.
    5. Bereiden PBST-B-G: PBST met 2% BSA en 5% normaal geit Serum 10 mL.
    6. Bereiden 1 mL van oplossing blokkeren. Verdunde AffiniPure Fab Fragment geit-antimuis IgG (H + L) (1:10) in PBST-B.
    7. 200 mL 1 x citraat buffer voor te bereiden.
      Opmerking: De omvang van de bovenstaande oplossingen zijn voldoende voor ten minste 5 dia's. Volumes moeten worden aangepast volgens het aantal dia's en de grootte van de dia-containers.
  2. Bereiden van antilichaam vlekken:
    1. Primaire antilichamen (werken concentratie): 1,2 mL voor primair antilichaam mix voorbereiden door verder verdunnen Pax7 muis monoklonaal antilichaam (IgG1) (1-5 µg/mL) + Laminin konijn polyclonal antilichaam (0.5-2 µg/mL) + MF20 muis monoklonaal antilichaam (IgG2b) (0,5-2,5 µg / mL) in PBST-B-G.
      Opmerking: MF20 muis monoklonaal antilichaam (IgG2b) is optioneel.
    2. Secundaire antilichamen (werken concentratie): 1,2 mL secundair antilichaam mix voorbereiden door verdunning van de geit-antimuis IgG1 Kruis-geadsorbeerde secundair antilichaam, Alexa Fluor 488 (0.5-2 µg/mL) + geit anti-konijn IgG (H + L) zeer cross-geadsorbeerde secundair antilichaam, Alexa Fluor Plus 555 (0.5-2 µg/mL) + geit-antimuis IgG2b Kruis-geadsorbeerde secundair antilichaam, Alexa Fluor 647 (0.5-2 µg/mL) in PBST-B-G.
      Opmerking: De Alexa Fluor 647 is optioneel.

5. immunofluorescentie kleuring stappen

  1. Hydrateren en herstellen van de cryo-delen met PFA.
    1. Een paar van de TA/EDL cryo-sectie dia's uit het vak dia verwijderen. Warm de dia's in de lade van een dia-bedrijf bij kamertemperatuur.
    2. Een vloeibare blocker pen (PAP pen) gebruiken om een gebied waarin alle cryo-secties op de dia te tekenen. Deze cirkel wordt voorkomen dat de oplossingen die stroomt van de dia wegslepen.
    3. Neem de lade naar een laboratorium zuurkast. Voeg 300-500 µL van 4% PFA op de dia binnen de omcirkelde gebied om op te lossen van de secties bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten wassen uit de PFA met 1 x PBS minstens 3 x 5 min in een dia-container.
      Let op: PFA is giftig en een gevaarlijke afvalstoffen; het moet met zorg bediend en verwijderd in een gevaarlijk afval container.
  2. Antigeen ophalen
    1. Vul een andere dia container met 200 mL ammoniumcitraat buffer.
    2. Breng de dia's in de container. De container met de dia's overbrengen in een snelkookpan de dia's in de hoge druk modus gedurende 10 minuten koken.
    3. De container met het aftappen van water voor 10 min. overdracht alle dia's naar een nieuwe container met PBST (200 mL) afkoelen, spoel de dia's met PBST voor minstens 3 x 5 min.
  3. Blokkeren
    1. Water doordrenkte kimwipes toevoegen aan het Dienblad van de dia's te maken van een vochtige omgeving om te voorkomen dat het drogen van de dia's te houden.
    2. Verplaats de dia's terug naar de lade, en 200 µL van het blokkeren van de oplossing op elke dia toe te voegen. Dek het dienblad met een GLB en laat de blokkering ontwikkelen voor 30 min.
      Opmerking: Pax7 antilichaam is een monoclonal antilichaam van muis, dus er is aspecifieke binding van muis IgG in muis spierweefsels waarmee hoge achtergrond. Met behulp van de AffiniPure Fab Fragment geit-antimuis IgG (H + L) blokkeert de muis-over-mouse aspecifieke binding.
  4. Primaire antilichamen van toepassing.
    1. Spoel de dia's met PBST eenmaal in de dia-container. Verplaats de dia's terug naar de kleuring lade.
    2. 200 µL van primair antilichaam mix toepassen op elke dia, betrekking hebben op het dienblad met een GLB en laat de reactie ontwikkelen bij kamertemperatuur gedurende 1 uur, of bij 4 ° C voor overnachting.
      Opmerking: De overnachting reactie bij 4 ° C geeft het beste resultaat, hoewel de ontwikkeling van de reactie bij kamertemperatuur bevredigende resultaten oplevert. Het antilichaam myosin MF20 kan worden toegevoegd in de mix voor het uitvoeren van een triple (Pax7, Laminin, MF20) labeling. MF20 vlekken gedifferentieerde spiervezels. Deze stap dient ook als een blokkerende stap met PBST-B-G om potentiële aspecifieke bindende van secundaire antilichamen (geit antilichamen) in de volgende stap.
  5. Toepassing van secundaire antilichamen.
    1. Wassen uit de primaire antilichamen met PBST bij kamertemperatuur minstens 3 x 5 min.
    2. 200 µL van secundair antilichaam mix toevoegen aan elke dia, en laat de reactie te ontwikkelen bij kamertemperatuur gedurende ten minste 1 uur.
      Opmerking: Gebruik voor Pax7 + Laminin, geit-antimuis IgG1 Alexa 488 en geit anti-konijn Alexa 555.
      Toevoegen voor Pax7 + Laminin + MF20, geit-antimuis IgG2b Alexa 647 in de mix.
    3. Wassen uit de secundaire antilichamen met PBST minstens 3 x 5min.
  6. DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) contra vlek en montage
    1. DAPI (1:20, 000) verdund in PBST in de dia container, bijvoorbeeld10 µL van de DAPI in 200 mL PBST.
    2. Vlek van de dia's in de DAPI container voor 3 min.
    3. Wassen de DAPI met PBST voor minstens 5 x 5 min.
    4. Monteer de dia's met montage medium. Betrekking hebben op de dia's met coverslips.
      Let op: DAPI is giftig en gevaarlijk; het moet met zorg behandeld en verwijderd in de fles van gevaarlijke afvalstoffen.

6. fluorescent microscopie

Opmerking: Het immunefluorescentie kleuring protocol gemeld boven kan SCs visualisatie met ofwel een breed-gebied TL of confocal microscoop. Het kan zijn aanvankelijk uitdagend om te identificeren van SCs. Hier zijn een paar aanbevolen stappen die van hulp worden kunnen.

  1. Gebruik de DAPI kanaal en lage vergroting doelstellingen te visualiseren van de secties op de dia's.
  2. Schakel in de vergroting van laag naar hoog. Om te zien hoe de SCs, is minimaal 20 X doelstelling vereist).
  3. Gebruik de dubbele filter kubus voor 488 (FITC) / 555 (Rhodamine) te observeren van zowel Pax7 als Laminin signalen tegelijkertijd te identificeren van SCs. Onder deze instelling heeft het signaal van de Pax7 kleuring een beter contrast met de achtergrondgeluiden.
  4. Het kanaal van FITC DAPI correct identificeren SCs snel worden afgewisseld. Alle SCs moet Pax7/DAPI-positief.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Na de bovenstaande stappen, SCs met succes kunnen worden gevisualiseerd in volwassen rust spier secties onder een fluorescente microscoop (Figuur 1). Hoewel de volwassen spierweefsel sterke auto-fluorescentie in bepaald soort vezels heeft, de heldere Alexa serie kleurstoffen de achtergrondgeluiden kunnen overwinnen en het signaal opvalt (figuur 1A, B; pijlpunten). De twee-foton confocal microscopie vangt een rela...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het bovenstaande protocol was gebaseerd op een methode van Pax7/MF20 kleuring op zebrafish skeletspieren12. De oplossingen gebruikt en het blokkeren van stappen zijn identiek of soortgelijk. De antilichamen die gebruikt zijn identiek. De aangepaste stappen waren gebaseerd op de kenmerken van de muis spierweefsel en SCs. Eerst, Laminin antilichaam werd toegevoegd in de mix om te helpen bij het visualiseren en bevestigen van de positie van SCs. Het was bijzonder nuttig om te tellen van het aantal SC...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Wij danken de NIAMS licht Imaging sectie voor het verstrekken van de microscopen en technische hulp. De MF20 en Pax7 antilichamen zijn verkregen van de Developmental Studies Hybridoma Bank onder auspiciën van de NICHD ontwikkeld en onderhouden door de afdeling biologische wetenschappen, de Universiteit van Iowa, Iowa City. Dit werk werd gesteund door de intramurale onderzoek programma van NIAMS van de National Institutes of Health.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
methylbutaneSigma-AldrichM32631
Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compoundElectron Microscopy Sciences62550-01
10x PBSGibco, Themo Fisher70011-044
16% PFATED PELLA50-00-0
Triton-100Sigma-AldrichT8787
Normal Goat SerumThermo Fisher0 1-6201
AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.115-007-003
20x Citrate BufferThermo Fisher00 500
Pax7 mono-clonale muis antilichaam (IgG1) (supernatant)Developmental Study Hybridoma BankN/A
Laminin polyklonaal konijn antilichaamSigma-AldrichL9393
MF20 mono-clonale muis antilichaam (IgG2b) (supernatant)Developmental Study Hybridoma BankN/A
Geiten anti-Muis IgG1 gekruist geabsorbeerd secundair antilichaam, Alexa Fluor 488Thermo FisherA-21121
Geiten anti-Muis IgG2b gekruist geabsorbeerd secundair antilichaam, Alexa Fluor 647Thermo FisherA-21242
Geiten anti-Konijn IgG (H+L) Hoog Gekruist Geadsorbeerd Secundair Antilichaam, Alexa Fluor Plus 555Thermo FisherA32732
Leica CM1860 cryostaat
Leica DM6000 breedveldfluorescentiemicroscoop
Leica DMR breedveldfluorescentiemicroscoop
Zeiss LSM510 confocale microscoop
Zeiss LSM780 confocale microscoop
Cuisinart elektronische snelkookpan

Referenties

  1. Buckingham, M. Gene regulatory networks and cell lineages that underlie the formation of skeletal muscle. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (23), 5830-5837 (2017).
  2. Buckingham, M., Relaix, F. PAX3 and PAX7 as upstream regulators of myogenesis. Semin Cell Dev Biol. 44, 115-125 (2015).
  3. Relaix, F., Buckingham, M. From insect eye to vertebrate muscle: redeployment of a regulatory network. Genes Dev. 13 (24), 3171-3178 (1999).
  4. Chang, N. C., Chevalier, F. P., Rudnicki, M. A. Satellite Cells in Muscular Dystrophy - Lost in Polarity. Trends Mol Med. 22 (6), 479-496 (2016).
  5. Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. J Biophys Biochem Cytol. 9, 493-495 (1961).
  6. Kuang, S., Rudnicki, M. A. The emerging biology of satellite cells and their therapeutic potential. Trends Mol Med. 14 (2), 82-91 (2008).
  7. Wang, Y. X., Rudnicki, M. A. Satellite cells, the engines of muscle repair. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (2), 127-133 (2011).
  8. Rinaldi, F., Perlingeiro, R. C. Stem cells for skeletal muscle regeneration: therapeutic potential and roadblocks. Transl Res. 163 (4), 409-417 (2014).
  9. Le Grand, F., Rudnicki, M. A. Skeletal muscle satellite cells and adult myogenesis. Curr Opin Cell Biol. 19 (6), 628-633 (2007).
  10. Giordani, L., Puri, P. L. Epigenetic control of skeletal muscle regeneration: Integrating genetic determinants and environmental changes. FEBS J. 280 (17), 4014-4025 (2013).
  11. Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nat Protoc. 10 (10), 1612-1624 (2015).
  12. Feng, X., Adiarte, E. G., Devoto, S. H. Hedgehog acts directly on the zebrafish dermomyotome to promote myogenic differentiation. Dev Biol. 300 (2), 736-746 (2006).
  13. Juan, A. H., et al. Polycomb EZH2 controls self-renewal and safeguards the transcriptional identity of skeletal muscle stem cells. Genes Dev. 25 (8), 789-794 (2011).
  14. Jackson, K. A., Snyder, D. S., Goodell, M. A. Skeletal muscle fiber-specific green autofluorescence: potential for stem cell engraftment artifacts. Stem Cells. 22 (2), 180-187 (2004).
  15. Lepper, C., Conway, S. J., Fan, C. M. Adult satellite cells and embryonic muscle progenitors have distinct genetic requirements. Nature. 460 (7255), 627-631 (2009).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Pax7 antilichaamlaminine antilichaamcryosneden van spierweefselantigeenherstelmouse on mouse blockingfluorescentiemicroscopieconfocale microscopieDAPI kleuring
Identificatie van de skeletspieren satelliet cellen met immunofluorescentie met Pax7 en Laminin antilichamen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.