Een methode is hier weergegeven voor de voorbereiding van de tong extracellulaire matrix (TEM) met efficiënte decellularization. De TEM kan worden gebruikt als functionele steigers voor de wederopbouw van een tong plaveiselcelcarcinoom (TSCC) model onder statische of stirred cultuuromstandigheden.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Fabricage van tong extracellulaire Matrix en reconstructie van tong plaveiselcelcarcinoom In Vitro
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De methoden zijn om te bouwen van een model voor effectieve en realistische voor tong squamous cell carcinoma (TSCC) in vitro, gemaakt naar producten decellularized tong extracellulaire matrix (TEM) waarmee functionele steigers voor TSCC bouw. TEM voorziet een niche in vitro celgroei, differentiatie en cel migratie. De microstructuren inheemse extracellulaire matrix (ECM) en biochemische composities bewaard in de decellularized matrix wordt voorzien dat weefsel-specifieke niches verankering van cellen. De fabricage van TEM kan worden gerealiseerd door deoxyribonuclease (DNase) spijsvertering gepaard met een ernstige van organische of anorganische voorbehandeling. Dit protocol is eenvoudig te bedienen en zorgt voor een hoog rendement voor de decellularization. De TEM toonde gunstige cytocompatibility voor TSCC cellen onder statische of stirred kweekomstandigheden, waardoor de bouw van de TSCC model. Een zelf-gemaakte bioreactor werd ook gebruikt voor de aanhoudende stirred voorwaarde voor celkweek. Gereconstrueerde TSCC met behulp van TEM toonde de kenmerken en eigenschappen die lijken op klinisch TSCC Histopathologie, het potentieel in TSCC onderzoek suggereert.
Inleiding
De tong heeft verschillende belangrijke functies, zoals deglutition, articulatie en proeverij. Dus, de verslechtering van de tong functie heeft grote impact op patiënten levenskwaliteit1. De meest voorkomende maligniteit in de mondholte is tong plaveiselcelcarcinoom (TSCC), die meestal voorkomt bij mensen die drinken van alcohol of roken van tabak2.
In de afgelopen jaren, is weinig vooruitgang geboekt in fundamenteel onderzoek op TSCC. Het gebrek aan efficiënte in vitro onderzoek modellen blijft als een van de grootste problemen. Dus, de extracellulaire matrix (ECM) blijkt te zijn van....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dierlijke werk werd verricht overeenkomstig de Akte van dierenwelzijn, institutioneel richtsnoeren en goedgekeurd door institutionele Animal Care en gebruik Comité, zon Yat-sen-universiteit.
1. voorbereiding van de TEM
- Uitvoeren van muizen door cervicale dislocatie en verwijder de tongen met behulp van steriele chirurgische schaar en pincet.
- De tongen in 75% ethanol voor 3 min. onderdompelen en elke tong gestoken met een 1,5 mL Eppendorf (EP) buis met 1 mL 10 mM steriele fosfaat gebufferde oplossing (PBS).
Opmerking: De concentratie van PBS in alle van de volgende stappen is hetzelfde als de concentratie in deze ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Dit protocol voor de bereiding van TEM ontpopt zich tot efficiënte en geschikte. De TEM toonde perfecte decellularization vergeleken met de moedertaal weefsels. De werkzaamheid van decellularization werd bevestigd door de Haematoxyline-eosine (HE) kleuring (Figuur 1A-B). De HE kleuring resultaten bleek volledige verdwijning van nucleaire kleuring in TEM (Figuur 1B). DNA inhoud kwantificering van .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Een goed gangbaar protocol voor de fabricage van decellularized ECM moet behouden de oorspronkelijke samenstelling van de ECM tijdens het verwijderen van cellulaire componenten in weefsels bijna volledig21. Ondanks momenteel gerapporteerde decellularization protocollen waarvoor perfusie door middel van de therapieën materialen te verwijderen cellulaire door convectie vervoer, mechanische agitatie goedgekeurd hier, bekend als een traditionele, eenvoudige en goedkope methode22
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs erkennen de steun van onderzoekssubsidies van nationale Natural Science Foundation van China (31371390), het programma van de staat High-Tech ontwikkelingsproject (2014AA020702) en het programma van Guangdong wetenschap en technologie (2016B030231001).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| C57-BL/6J muizen | Sun Yat-sen University Laboratory Animal Center | ||
| Ethanol | Guangzhou Chemical Reagent Factory | HB15-GR-2.5L | |
| Natriumchloride | Sangon Biotech | A501218 | |
| Kaliumchloride | Sangon Biotech | A100395 | |
| Dibasisch natriumfosfaat | Guangzhou Chemical Reagent Factory | BE14-GR-500G | |
| Monobasisch kaliumfosfaat | Sangon Biotech | A501211 | |
| 1,5 mL EP buis | Axygen | MCT-150-A | |
| Ultra-lage temperatuur vriezer | Thermo Fisher Scientific | ||
| 3,5 cm celkweekschaal | Thermo Fisher Scientific | 153066 | |
| 6 cm celkweekschaal | Greiner | 628160 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | V900502 | |
| Calciumchloride | Sigma-Aldrich | 746495 | |
| Magnesiumchloride | Sigma-Aldrich | 449164 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| Magnesiumsulfaat | Sangon Biotech | A601988 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 158968 | |
| Natriumbicarbonaat | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Ampicilline | Sigma-Aldrich | A9393 | |
| Kanamycine | Sigma-Aldrich | PHR1487 | |
| Chirurgische hechtdraad | Shanghai Jinhuan | ||
| 250 mL fles met brede hals | SHUNIU | 1407 | |
| Magnetische roerder | AS ONE | 1-4602-32 | |
| CO2 incubator | SHEL LAB | SCO5A | |
| 10 mL spuit | Hunan Pingan | ||
| 50 mL centrifugeerbuis | Greiner | 227270 | |
| Cal27 cel | Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank | Tongue plaveiselcelcarcinoom cel lijn | |
| U2OS cel | Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank | Menselijke osteosarcoomcel lijn | |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D0547 | |
| Natriumpyruvaat | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Hepes vrije zuur | BBI | A600264 | |
| FBS | Hyclone | SH30084.03 | |
| 4 °C koelkast | Haier | ||
| Waterreiniger | ELGA | ||
| Hemocytometer | BLAU | 717805 |
Referenties
- Elfring, T., Boliek, C. A., Winget, M., Paulsen, C., Seikaly, H., Rieger, J. M. The relationship between lingual and hypoglossal nerve function and quality of life in head and neck cancer. J. Oral Rehabil. 41, 133-140 (2014).
- Patel, S. C., et al.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
