Een methode is hier weergegeven voor de voorbereiding van de tong extracellulaire matrix (TEM) met efficiënte decellularization. De TEM kan worden gebruikt als functionele steigers voor de wederopbouw van een tong plaveiselcelcarcinoom (TSCC) model onder statische of stirred cultuuromstandigheden.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Fabricage van tong extracellulaire Matrix en reconstructie van tong plaveiselcelcarcinoom In Vitro
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De methoden zijn om te bouwen van een model voor effectieve en realistische voor tong squamous cell carcinoma (TSCC) in vitro, gemaakt naar producten decellularized tong extracellulaire matrix (TEM) waarmee functionele steigers voor TSCC bouw. TEM voorziet een niche in vitro celgroei, differentiatie en cel migratie. De microstructuren inheemse extracellulaire matrix (ECM) en biochemische composities bewaard in de decellularized matrix wordt voorzien dat weefsel-specifieke niches verankering van cellen. De fabricage van TEM kan worden gerealiseerd door deoxyribonuclease (DNase) spijsvertering gepaard met een ernstige van organische of anorganische voorbehandeling. Dit protocol is eenvoudig te bedienen en zorgt voor een hoog rendement voor de decellularization. De TEM toonde gunstige cytocompatibility voor TSCC cellen onder statische of stirred kweekomstandigheden, waardoor de bouw van de TSCC model. Een zelf-gemaakte bioreactor werd ook gebruikt voor de aanhoudende stirred voorwaarde voor celkweek. Gereconstrueerde TSCC met behulp van TEM toonde de kenmerken en eigenschappen die lijken op klinisch TSCC Histopathologie, het potentieel in TSCC onderzoek suggereert.
Inleiding
De tong heeft verschillende belangrijke functies, zoals deglutition, articulatie en proeverij. Dus, de verslechtering van de tong functie heeft grote impact op patiënten levenskwaliteit1. De meest voorkomende maligniteit in de mondholte is tong plaveiselcelcarcinoom (TSCC), die meestal voorkomt bij mensen die drinken van alcohol of roken van tabak2.
In de afgelopen jaren, is weinig vooruitgang geboekt in fundamenteel onderzoek op TSCC. Het gebrek aan efficiënte in vitro onderzoek modellen blijft als een van de grootste problemen. Dus, de extracellulaire matrix (ECM) blijkt te zijn van een mogelijke oplossing. Aangezien ECM een complex netwerk frame samengesteld uit onderdelen van de hoogst georganiseerde matrix is, zou Steiger materiaal met een ECM-achtige structuur en samenstelling bevoegd voor kankeronderzoek zijn. Decellularized ECM kan perfect de niche bieden voor de cellen van dezelfde oorsprong in vitro, die blijkt te zijn van het belangrijkste voordeel van ECM.
ECM kan worden bewaard met cellulaire componenten wordt verwijderd uit de weefsels door middel van de decellularization met behulp van detergentia en enzymen. Verschillende ECM componenten, met inbegrip van collageen, fibronectine en laminin in de decellularized matrix bieden een native-weefsel-achtige communicatie voor gekweekte cellen, bevordering van de overleving, proliferatie en differentiatie van de cellen3. Bovendien kan de immunogeniciteit voor transplantatie worden gereduceerd tot een minimaal niveau aan de afwezigheid van cellulaire componenten in ECM.
Tot nu toe hebben fabricage methoden voor decellularized ECM geprobeerd in verschillende weefsels en organen, zoals hart4,5,6,7, lever8,9,10 ,11, Long12,13,14,15,16,17, en nier18,19 , 20. echter geen relevant onderzoek is te vinden op soortgelijke werkzaamheden in de tong om het beste van onze kennis.
In deze studie werd decellularized tong extracellulaire matrix (TEM) zowel efficiënt en goedkoop vervaardigd door een reeks van fysieke, chemische en enzymatische behandeling. Vervolgens werd de TEM gebruikt om te recapituleren TSCC in vitro, tonen een passende simulatie voor TSCC gedrag en ontwikkeling. TEM heeft goede biocompatibiliteit, evenals de mogelijkheid om te begeleiden van de cellen naar de weefsel-specifieke niche, waarmee wordt aangegeven dat de TEM groot potentieel in TSCC onderzoek3 wellicht. Het hier getoonde protocol biedt u de keuze voor onderzoekers bestuderen op pathogenese of klinische therapieën voor TSCC.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dierlijke werk werd verricht overeenkomstig de Akte van dierenwelzijn, institutioneel richtsnoeren en goedgekeurd door institutionele Animal Care en gebruik Comité, zon Yat-sen-universiteit.
1. voorbereiding van de TEM
- Uitvoeren van muizen door cervicale dislocatie en verwijder de tongen met behulp van steriele chirurgische schaar en pincet.
- De tongen in 75% ethanol voor 3 min. onderdompelen en elke tong gestoken met een 1,5 mL Eppendorf (EP) buis met 1 mL 10 mM steriele fosfaat gebufferde oplossing (PBS).
Opmerking: De concentratie van PBS in alle van de volgende stappen is hetzelfde als de concentratie in deze stap. - Lysis van de cel door bevriezing dooi: de tongen in EP buizen bij-80 ° C gedurende 1 h bevriezen en ontdooien dan de tongen bij kamertemperatuur voor 45 min voor 3 cycli.
- Laden elke tong op een stuk van chirurgische hechtdraad met behulp van een chirurgische naald en het einde van de hechtdraad met een klein stukje van steriele zilverpapier wikkel. De bewerking uitvoeren in een 3,5 cm of 6 cm cultuur schotel met 75% ethanol onder steriele omstandigheden.
Opmerking: De juiste lengte van elk stuk van chirurgische hechtdraad is ongeveer 20 cm, en de juiste grootte van elk stukje zilverpapier is over 0.3 cm2 (1 cm × 0.3 cm). De tong moet worden geladen in de buurt van het zilverpapier. - Spoel elke tong met 3 mL steriele PBS in een 3,5 cm of 6 cm cultuur schotel voor 30 s. uitvoeren deze operatie onder steriele omstandigheden.
- De tongen met ultrazuiver water wassen: ampicilin in een wide-mouth-fles met 250 mL steriele ultrazuiver water toevoegen om een eindconcentratie van 90 µg/mL. Zet de tongen in de fles met een roer-bar. Draai de fles dop met een deel van de hechtdraad resterende buiten de fles. Deze bewerking uitvoeren onder steriele omstandigheden.
Opmerking: Maximaal 5 tongen kunnen worden gebracht in de dezelfde fles als tegenprestatie twining van de hechtdraad. Het zilverpapier is aan het einde van de hechtdraad in de fles om te voorkomen dat de tong glijden af. De tongen moeten worden geplaatst van 2 cm hoog vanaf de onderkant van de fles door het aanpassen van de lengte van de hechtdraad blijft in de fles. Deze opmerking is ook voor stappen 1.8, 1.10 1.12 en 1.16. - Zet de fles op een magneetroerder voor 12u.
- Wassen van de tongen met NaCl: ampicilin toevoegen in een wide-mouth fles met 250 mL steriele 1 M NaCl om een eindconcentratie van 90 µg/mL. Verplaats de tongen en de roer-bar in de fles. Draai de fles dop met een deel van de hechtdraad resterende buiten de fles. Deze bewerking uitvoeren onder steriele omstandigheden.
- Zet de fles op een magneetroerder gedurende 24 uur.
- Door Triton X-100 lysis van de cel: ampicilin toevoegen om een eindconcentratie van 90 µg/mL in een wide-mouth-fles met 250 mL steriele 2% Triton X-100 in PBS. Verplaats de tongen en de roer-bar in de fles. Draai de fles dop met een deel van de hechtdraad resterende buiten de fles. Deze bewerking uitvoeren onder steriele omstandigheden.
- Zet de fles op een magneetroerder gedurende 48 uur.
- Wassen tongen met CaCl2/MgCl2: ampicilin in een wide-mouth fles met 250 mL steriele 5 mM CaCl2/MgCl2 toevoegen om een eindconcentratie van 90 µg/mL. Verplaats de tongen en de roer-bar in de fles. Draai de fles dop met een deel van de hechtdraad resterende buiten de fles. Deze bewerking uitvoeren onder steriele omstandigheden.
- Zet de fles op een magneetroerder gedurende 24 uur.
- Vertering door DNase: Voeg 1 mL Henks evenwichtig zoutoplossing (HBSS) aan elke EP-buis. DNase respectievelijk in HBSS toevoegen om een eindconcentratie van 300 µM. Beweeg elke tong in elk EP-buis, met een deel van de hechtdraad buiten de buis. Deze bewerking uitvoeren onder steriele omstandigheden.
Opmerking: Zorg ervoor dat het deel van de hechtdraad die binnen de flessen in de vorige stappen blijft ook in de EP-buis in deze stap blijft, en ervoor te zorgen dat het deel van de hechtdraad dat buiten de flessen in de vorige stappen blijft ook buiten de EP buis in deze stap blijft. - Incubeer de tongen in EP buizen bij 37 ° C gedurende 24 uur.
- Wassen van de tongen met PBS: ampicilin in een wide-mouth fles met 250 mL steriele PBS toevoegen om een eindconcentratie van 90 µg/mL. Verplaats de tongen en de roer-bar in de fles. Draai de fles dop met een deel van de hechtdraad resterende buiten de fles. Deze bewerking uitvoeren onder steriele omstandigheden.
- Zet de fles op een magneetroerder gedurende 24 uur.
- Bewaren de bereid TEM in steriele PBS bij 4 ° C tot gebruik.
2. driedimensionale (3D) reconstitutie van TSCC
-
Statische TSCC modelbouw
- Zaad 1.0 x 106 afzonderlijke TSCC cellen (Cal27) in een 3,5 cm cultuur schotel. Voeg 3 mL Dulbecco van gemodificeerde Eagle's medium/F12 (DF12) met 10% foetale runderserum (FBS), 90 µg/mL ampicilin, en 90 µg/mL kanamycine.
- Cultuur de Cal27 cellen bij 37 ° C gedurende 2 à 3 dagen. Zorg ervoor dat de cellen ten minste 60 omvatten % ruimte van de onderkant van de schotel.
- TEM op de Cal27 enkelgelaagde in de cultuur-schotel laden.
- Zet de schotel in een CO2 incubator bij 37 ° C gedurende 28 dagen.
- Vernieuw het kweekmedium elke dag tijdens de cel cultuur. De CO2 -concentratie in de incubator is 5%.
-
Stirred TSCC modelbouw
-
Voorbereiding van een zelf-gemaakte stirred minibioreactor
- Haal de zuiger van een 10 mL spuit.
- Graven van een gat (doorsnede 1 cm) in de buurt van de lagere terminal van de staaf en laden van een roer-bar in het gat.
- Graven van een gat (diameter van 0,5 cm) in het midden van de fles dop van een plastic fles wide-mouth en zet de zuigerstang via het GLB.
- Snijd de helft van een tube van 50 mL centrifuge en het lassen aan de buitenkant van de fles dop.
- Hechten vishaken aan de staaf door inwikkeling van de staaf met visserij lijnen die zijn gebonden aan de vishaken.
Opmerking: Maximaal 4 vishaken kunnen worden bevestigd aan een staaf. - Autoclaaf de zelf-gemaakte complex vóór gebruik.
Opmerking: Geen autoclaaf de plastic fles wide-mouth. Gebruik een nieuwe steriele plastic wide-mouth fles terwijl het kweken van cellen.
-
Voorbereiding van een zelf-gemaakte stirred minibioreactor
-
Dynamische celkweek
- Zaad 1.0 x 106 afzonderlijke Cal27 cellen in de zelf-gemaakte minibioreactor. Voeg 150 mL DF12 medium dat 10% FBS, 90 µg/mL ampicilin en 90 µg/mL kanamycine bevat.
- TEM laden op de minibioreactor met behulp van de vishaken aangesloten op de staaf.
- Draai de dop van de fles en zet de minibioreactor op een magneetroerder. Activeer de minibioreactor bij 200 t/min in een CO2 incubator bij 37 ° C voor 7 tot 14 dagen.
Opmerking: De concentratie van CO2 in de CO2 incubator is 5%.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Dit protocol voor de bereiding van TEM ontpopt zich tot efficiënte en geschikte. De TEM toonde perfecte decellularization vergeleken met de moedertaal weefsels. De werkzaamheid van decellularization werd bevestigd door de Haematoxyline-eosine (HE) kleuring (Figuur 1A-B). De HE kleuring resultaten bleek volledige verdwijning van nucleaire kleuring in TEM (Figuur 1B). DNA inhoud kwantificering van ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Een goed gangbaar protocol voor de fabricage van decellularized ECM moet behouden de oorspronkelijke samenstelling van de ECM tijdens het verwijderen van cellulaire componenten in weefsels bijna volledig21. Ondanks momenteel gerapporteerde decellularization protocollen waarvoor perfusie door middel van de therapieën materialen te verwijderen cellulaire door convectie vervoer, mechanische agitatie goedgekeurd hier, bekend als een traditionele, eenvoudige en goedkope methode22
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs erkennen de steun van onderzoekssubsidies van nationale Natural Science Foundation van China (31371390), het programma van de staat High-Tech ontwikkelingsproject (2014AA020702) en het programma van Guangdong wetenschap en technologie (2016B030231001).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| C57-BL/6J muizen | Sun Yat-sen University Laboratory Animal Center | ||
| Ethanol | Guangzhou Chemical Reagent Factory | HB15-GR-2.5L | |
| Natriumchloride | Sangon Biotech | A501218 | |
| Kaliumchloride | Sangon Biotech | A100395 | |
| Dibasisch natriumfosfaat | Guangzhou Chemical Reagent Factory | BE14-GR-500G | |
| Monobasisch kaliumfosfaat | Sangon Biotech | A501211 | |
| 1,5 mL EP buis | Axygen | MCT-150-A | |
| Ultra-lage temperatuur vriezer | Thermo Fisher Scientific | ||
| 3,5 cm celkweekschaal | Thermo Fisher Scientific | 153066 | |
| 6 cm celkweekschaal | Greiner | 628160 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | V900502 | |
| Calciumchloride | Sigma-Aldrich | 746495 | |
| Magnesiumchloride | Sigma-Aldrich | 449164 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| Magnesiumsulfaat | Sangon Biotech | A601988 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 158968 | |
| Natriumbicarbonaat | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Ampicilline | Sigma-Aldrich | A9393 | |
| Kanamycine | Sigma-Aldrich | PHR1487 | |
| Chirurgische hechtdraad | Shanghai Jinhuan | ||
| 250 mL fles met brede hals | SHUNIU | 1407 | |
| Magnetische roerder | AS ONE | 1-4602-32 | |
| CO2 incubator | SHEL LAB | SCO5A | |
| 10 mL spuit | Hunan Pingan | ||
| 50 mL centrifugeerbuis | Greiner | 227270 | |
| Cal27 cel | Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank | Tongue plaveiselcelcarcinoom cel lijn | |
| U2OS cel | Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank | Menselijke osteosarcoomcel lijn | |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D0547 | |
| Natriumpyruvaat | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Hepes vrije zuur | BBI | A600264 | |
| FBS | Hyclone | SH30084.03 | |
| 4 °C koelkast | Haier | ||
| Waterreiniger | ELGA | ||
| Hemocytometer | BLAU | 717805 |
Referenties
- Elfring, T., Boliek, C. A., Winget, M., Paulsen, C., Seikaly, H., Rieger, J. M. The relationship between lingual and hypoglossal nerve function and quality of life in head and neck cancer. J. Oral Rehabil. 41, 133-140 (2014).
- Patel, S. C., et al. Increasing incidence of oral tongue squamous cell carcinoma in young white women, Age 18 to 44 Years. J. Clin. Oncol. 29, 1488-1494 (2011).
- Zhao, L., Huang, L., Yu, S., Zheng, J., Wang, H., Zhang, Y. Decellularized tongue tissue as an in vitro. model for studying tongue cancer and tongue regeneration. Acta Biomaterialia. 58, 122-135 (2017).
- Ng, S. L., Narayanan, K., Gao, S., Wan, A. C. Lineage restricted progenitors for the repopulation of decellularized heart. Biomaterials. 32, 7571-7580 (2011).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat. Med. 14, 213-221 (2008).
- Remlinger, N. T., Wearden, P. D., Gilbert, T. W. Procedure for decellularization of porcine heart by retrograde coronary perfusion. J. Vis. Exp. (6), e50059(2012).
- Wainwright, J. M., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart. Tissue Eng. Part C-ME. 16, 525-532 (2010).
- Baptista, P. M., Siddiqui, M. M., Lozier, G., Rodriguez, S. R., Atala, A., Soker, S. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53, 604-617 (2011).
- Shupe, T., Williams, M., Brown, A., Willenberg, B., Petersen, B. E. Method for the decellularization of intact rat liver. Organogenesis. 6, 134-136 (2010).
- Soto-Gutierrez, A., et al. A whole-organ regenerative medicine approach for liver replacement. Tissue Eng. Part C-ME. 17, 677-686 (2011).
- Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat. Med. 16, 814-820 (2010).
- Bonvillain, R. W., et al. A nonhuman primate model of lung regeneration: detergent-mediated decellularization and initial in vitro recellularization with mesenchymal stem cells. Tissue Eng. Pt A. 18, 2437-2452 (2012).
- Daly, A. B., et al. Initial binding and recellularization of decellularized mouse lung scaffolds with bone marrow-derived mesenchymal stromal cells. Tissue Eng. Pt A. 18, 1-16 (2012).
- Ott, H. C., et al. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat. Med. 16, 927-933 (2010).
- Petersen, T. H., et al. Tissue-engineered lungs for in vivo implantation. Science. 329, 538-541 (2010).
- Price, A. P., England, K. A., Matson, A. M., Blazar, B. R., Panoskaltsis-Mortari, A. Development of a decellularized lung bioreactor system for bioengineering the lung: the matrix reloaded. Tissue Eng. Pt A. 16, 2581-2591 (2010).
- Wallis, J. M., et al. Comparative assessment of detergent-based protocols for mouse lung de-cellularization and re-cellularization. Tissue Eng. Part C-ME. 18, 420-432 (2012).
- Ross, E. A., et al. Embryonic stem cells proliferate and differentiate when seeded into kidney scaffolds. J. Am. Soc. Nephrol. 20, 2338-2347 (2009).
- Song, J. J., Guyette, J. P., Gilpin, S., Gonzalez, G., Vacanti, J. P., Ott, H. C. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nat. Med. 19, 646-651 (2013).
- Sullivan, D. C., et al. Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system. Biomaterials. 33, 7756-7764 (2012).
- Soto-Gutierrez, A., Wertheim, J. A., Ott, H. C., Gilbert, T. W. Perspectives on whole-organ assembly: moving toward transplantation on demand. J. Clin. Invest. 122, 3817-3823 (2012).
- Song, J. J., Ott, H. C. Organ engineering based on decellularized matrix scaffolds. Trends Mol. Med. 17, 424-432 (2011).
- Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 27-53 (2011).
- Shamis, Y., et al. Organ-specific scaffolds for in vitro expansion, differentiation, and organization of primary lung cells. Tissue Eng. Part C-ME. 17, 861-870 (2011).
- Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. Decellularized rhesus monkey kidney as a three-dimensional scaffold for renal tissue engineering. Tissue Eng. Pt A. 16, 2207-2216 (2010).
- Cortiella, J., et al. Influence of acellular natural lung matrix on murine embryonic stem cell differentiation and tissue formation. Tissue Eng. Pt A. 16, 2565-2580 (2010).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
