Specifieke en nauwkeurige detectie van de Citrus vergroening Pathogen Candidatus liberibacter spp. gebruikend conventionele PCR op Citrus blad weefselsteekproeven

Samenvatting

Citrus "vergroening" is een bijzonder destructieve ziekte die citrusvruchten wereldwijd. Hier gepresenteerd is een eenvoudige methode om met behulp van PCR en genomic DNA-extractie van citrus blad weefsel voor de nauwkeurige en precieze identificatie van het pathogeen citrus vergroening, Candidatus liberibacter spp.

Samenvatting

Citrus "greening", ook bekend als huanglongbing, is een destructieve citrus ziekte teistert citrus bedrijven wereldwijd. Deze ziekte veroorzaakt asymmetrische geel blad patroon, ader vergeling, naald-of bladverlies, root verval en uiteindelijk de dood van de citrus plant. Wanneer septisch, de citrus planten groei hebben onvolgroeide en produceren bloemen buiten het seizoen. Deze bloemen opbrengst zelden fruit, en die kleine, bittere, onregelmatig gevormde citrusvruchten die opbrengst zijn niet wenselijk. Deze ziekte wordt verspreid door de Aziatische citrus psyllid, Diaphorina citri, en door het enten van geïnfecteerde citrus weefsel. Het pathogene agens heeft een lange en variabele incubatietijd binnen de citrus plant — soms jaren voordat de symptomen verschijnen. Pogingen om deze pathogenen in vitro cultuur zijn mislukt, mogelijk vanwege de lage en ongelijke concentratie van het pathogene agens binnen citrus weefsel besmet, of omdat het moeilijk is om te repliceren de milieu dat bevorderlijk is voor groei van voorwaarden het pathogene agens oplevert. Het is erg moeilijk om de ziekte identificeren voordat het heeft verspreid, als gevolg van de lange incubatietijd en onderzoekers onvermogen om de cultuur van het pathogene agens oplevert. Dientengevolge, blijkt de ziekte alleen na plotseling citrus akkerbouwer de gehele oogst te vernietigen. Hier gepresenteerd is een methode voor de detectie van het nauwkeurig en specifiek voor de citrus vergroening pathogen, Candidatus liberibacter spp. met behulp van een genomic DNA-extractie kit en PCR. Deze methode is eenvoudig, efficiënt, kosteneffectief en aanpasbaar voor kwantitatieve analyse. Deze methode kan worden aangepast voor gebruik op elke citrus weefsel; het is echter mogelijk beperkt door de hoeveelheid pathogen in het weefsel aanwezig. Echter zal deze methode toelaten citrus boeren eerder identificeren van besmette citrus planten, en beteugelen van de verspreiding van deze destructieve ziekte voordat het verder kan verspreiden.

Inleiding

Citrus "greening", ook bekend als huanglongbing, heeft geleid tot een aanzienlijk verlies van citrusbomen. Één vertegenwoordiger geval is Florida, waar de ziekte is voorspelde een 70% daling in de productie van Florida oranje dozen van 244 miljoen dozen in het seizoen 1997-1998 te bezorgen 70 miljoen dozen vanaf het seizoen 2016-2017¹. Meer dan 90% van citrusbomen in Florida zijn geïnfecteerde², en geschat wordt dat de Florida citrus industrie ongeveer een miljard dollar per jaar als gevolg van citrus ziekten verliest, waarin citrus "vergroening" een belangrijke rol-^{3 speelt}. Citrus groener wordt verspreid voornamelijk door de invasieve Aziatische citrus psyllid Diaphorina citri, maar kan ook worden verspreid door enting van geïnfecteerd weefsel. De ziekte veroorzaakt geelverkleuring van de aderen, asymmetrische geel blad patroon, voortijdig naald-of bladverlies, takje zullen verdwijnen, root verval en dood van de plant. Belangrijk is dat veroorzaakt de ziekte de citrus plant produceren bloemen buiten het seizoen, die zelden fruit produceren. Het fruit dat wordt geproduceerd door geïnfecteerde citrus planten zijn onvolwassen, groen en bittere proeven⁴.

Het doel van deze methode is om nauwkeurig en precies identificeren de motile bacterie Candidatus liberibacter spp., de verwekker van citrus vergroening, wonen in het floëem van besmette citrusbomen⁵. Genomic DNA wordt geëxtraheerd uit het hele blad weefsel, waarin de levende bacteriën. Deze uitgepakte genomic DNA wordt gebruikt als een sjabloon voor conventionele PCR, waar oligonucleotides aanvulling op van de bacterie 16S rDNA volgorde worden gebruikt om te versterken deze volgorde. Oligonucleotides complementair aan een citrus FBOX -gen worden gebruikt als een versterking van de interne controle. We kozen voor deze methode, omdat het heeft bewezen succesvol te zijn in vorige onderzoek⁶.

Deze methode heeft het duidelijk voordeel dat ze kunnen worden uitgevoerd in een normaal uitgeruste biochemie-lab, eenvoudig en relatief goedkoop. Daarnaast blijft de PCR de nauwkeurigste en meest nauwkeurige methode voor het opsporen van deze pathogenen, als gevolg van de moeilijkheid van het kweken van deze ziekteverwekker⁷, en het pathogene agens van vermogen om te overleven en te reproduceren voor jaren binnen een asymptomatische host⁸. Veel verschillende specialiteit PCR testen zijn gebruikt om met succes het detecteren van deze pathogene agens oplevert; conventionele PCR blijft echter de eenvoudigste bepaling voor de accurate en specifieke detectie, vooral binnen de asymptomatische hosts⁸.

Protocol

1. Isoleer Genomic DNA uit weefsel van de Plant met behulp van een Genomic extractie Kit

1. Citrus blad weefsel verkrijgen door te snijden een hele vers blad van een citrus boom met behulp van schone schaar, en plaats het blad in een schone plastic sandwich zak.
   Opmerking: De zak met het weefsel blad moet worden geplaatst in een koelkast 4 ° C of op ijs in een geïsoleerde container zo spoedig mogelijk na het verzamelen te voorkomen van bederf.
2. Voeg een kleine hoeveelheid vloeibare stikstof om te relaxen een mortier en een stamper. Terwijl ze zijn koelen, gebruik schaar te knippen uit een klein stukje blad weefsel, ongeveer 1 vierkante inch in grootte. Plaats het gesneden weefsel in de mortel direct om het te bevriezen. Voeg meer vloeibare stikstof, indien nodig.
   Opmerking: Geïsoleerde handschoenen moeten altijd gedragen worden tijdens het verwerken van vloeibare stikstof.
3. Snel de plant weefsel vermalen tot een fijn poeder met behulp van de mortel. Blijven slijpen totdat de vloeibare stikstof volledig verdampt, en een fijn groene poeder blijft.
4. Kort een metalen spatel in vloeibare stikstof voor 10-15 s chill en schep de grond weefsel binnen de mortel in een 1,5 mL microcentrifuge buis, met behulp van de spatel.
5. Voeg 600 µL van kernen Lysis van de oplossing (Zie Tabel van materialen) met behulp van een 1000 µL Pipetteer en vortex het monster voor 1-3 s, vervolgens broeden in een waterbad van 65 ° C gedurende 15 minuten.
6. 3 µL van RNase oplossing aan de lysate met behulp van een pipet 10µL toevoegen, omkeren van de buis 2 - 5 keer te mengen, Incubeer bij 37 ° C in een kabinet incubator voor 15 min.
   Opmerking: Laat het mengsel afkoelen tot kamertemperatuur voordat u verdergaat.
7. 200 µL van eiwit neerslag oplossing, vortex op hoge snelheid voor 20 s en centrifuge voor 3 min op 13.000 x g vormen een stevige pellet toevoegen. Terwijl het monster wordt gecentrifugeerd, 600 µL van kamertemperatuur isopropanol aan een verse 1,5 mL microcentrifuge buis toevoegen.
8. Met behulp van een pipet 1000 µL, verwijder voorzichtig de bovendrijvende vloeistof uit het gecentrifugeerde monster, over te dragen aan de microcentrifuge-tube van verse 1,5 mL met isopropanol. De pellet kan nu worden verwijderd.
   Opmerking: Vermijd verontreiniging van het supernatans dat met eiwit door het verlaten van een minuscule hoeveelheid supernatant boven de pellet.
9. Omkeren van de buis, tot het DNA zichtbaar als een massa van de draad-achtige strengen wordt en centrifugeer bij 13.000 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur.
10. De bovendrijvende vloeistof decanteren, 600 µL van 70% ethanol toevoegen aan de pellet, omkeren van de buis meerdere malen te wassen van het DNA, en centrifugeer bij 13.000 x g voor 1 min.
11. Zorgvuldig gecombineerd de ethanol, waardoor de losse DNA pellet, open en omkeren van de buis, rustend op absorberend papier. Lucht droog bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
12. Voeg 100 µL van DNA rehydratie oplossing aan de gedroogde DNA pellet en Incubeer het DNA in een waterbad van 65 ° C gedurende 1 uur, tijdens het mixen periodiek door te tikken op de buis.
13. Plaats 1 µL van het gezuiverde water op een microcuvette, en plaatst u deze in een spectrofotometer moet worden gebruikt als een leeg. Bereken de concentratie van DNA aanwezig door 1 µL van het monster op de microcuvette te plaatsen en invoegen in de spectrofotometer. DNA-concentratie (ng/µL) kan worden berekend als (een₂₆₀- een₃₂₀) × verdunning factor × 50 ng/µL.
    Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. Het monster kan worden achtergelaten bij 4 ° C.

2. uitvoeren van PCR op Genomic DNA-monsters

1. Combineren van 10 µL 2 x PCR Master Mix (Zie tabel van materialen), 1 µL voorste primer (10 pM/µL), 1 µL reverse primer (10 pM/µL) (Zie tabel 2 voor primer sequenties), 100 ng van genomic DNA uit het monster geëxtraheerd en gezuiverd water (maximaal 20 µL eindvolume) een 50 µL PCR buis, flick te mengen, en kort centrifuge.
2. De PCR-buis invoegen de thermocycler en dienovereenkomstig worden uitgevoerd (Zie tabel 1).
   Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. Indien nodig slaan monster bij 4 ° C, nadat de reactie voltooid is.

3. het versterkte DNA in een Agarose Gel electrophorese

1. Weeg 0.4 g agarose poeder en samen met 1 x TAE buffer toevoegen aan een schoon 200 mL conische kolf, vullen van maximaal 50 mL.
2. Magnetron op hoog voor 1.5 min, schudden elke 30 s, tot agarose is volledig opgelost.
   Opmerking: Geïsoleerde handschoenen moeten gedragen worden tijdens het verwerken van vloeibare agarose Voorkom brandwonden.
3. 2.5 µL van 10 mg/mL ethidiumbromide toevoegen aan de vloeibare agarose hermetisch en schud om te mixen, dan giet het vloeibare agarose gel in een mal niveau gel. Snel invoegen standaard 12-tooth gel kammen na het gieten.
4. Laat de gel gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur afkoelen, dan verwijderen van de gel kammen, en plaats de gel in een niveau gel doos gevuld met 1 x TAE buffer.
5. Met behulp van een micropipet, laad het totale versterkte DNA-monsters in putten. Voeg toe 5 µL van DNA ladder (Zie Tabel van materialen) in een aparte put uit uw monsters.
6. Electrophorese de monsters gedurende 35 min. bij een constant 90 V, dan verwijderen van de gel en plaats in een UV-transilluminator.
7. Fotograferen en analyseren van de gel "banding" patroon tijdens het gebruik van UV transillumination op 302 nm.

Resultaten

Een positief resultaat levert een duidelijke band overeenkomt met 500 bp voor Candidatus Liberibacter asiaticus Las606/Lss⁶, en/of een duidelijke band overeenkomt met 700 bp voor Laa2/Laj5, een insert in de 16S ribosomal β operon⁹. De versterking van de interne controle band moet ook worden opgegeven bij 400 bp. Deze band komt overeen met de versterking van de citrus FBOX gene^10<...

Discussie

Het is van cruciaal belang dat alle maatregelen worden gevolgd als u precies wilt bereiken van optimale proefomstandigheden. Hele blad weefsel werd gebruikt tijdens deze demonstratie; het protocol kan echter worden gewijzigd theoretisch tot elk soort weefsel van de plant. Eerder, hebben de onderzoekers genomic DNA geëxtraheerd uit blad ader weefsel, in plaats van hele blad weefsel, en bereikt soortgelijke resultaten¹¹. Indien de band die overeenkomt met de citrus FBOX -gen niet verschijnt...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Wizard Genomic DNA Purification Kit	Promega	A1120	Bron van Nuclei Lysis, RNase, Protein Precipitatie en DNA Rehydratie oplossingen
Liquid nitrogen	Air Products	N/A
Mastercycler pro met bedieningspaneel	Eppendorf	6321000019
1250 W Microgolfoven	Panasonic	N/A
5424 tafeltop centrifuge	Eppendorf	05-403-93
Isotemp 215 digitale waterbad	Fisher scientific	15-462-15Q
Metalen spatel	Sigma-Aldrich	Z283274
Morser en stamper	Sigma-Aldrich	Z247464
LSE Vortex Mixer	Corning	6775
2-propanol	Sigma-Aldrich	I9516
Steriele 10 μL tips	TipOne	1161-3730
Steriele 200 μL tips	TipOne	1163-1730
Steriele 1250 μL tips	TipOne	1161-1750
Variabel Volume Pipettor Kit	VWR	75788-460
Ethidiumbromide	Sigma-Aldrich	E1510
Agarose	IBI Scientific	IB70041
EDTA	Thermo Fisher Scientific	17892
Azijnzuur	Fisher Chemical	A38-212
Tris base	Sigma-Aldrich	10708976001
μcuvet	Eppendorf	6138000018
Stapelbaar gietbakje en kammen	Carolina	213655
PowerPac Basic voeding	Bio-Rad	1645050
Mini-Sub Cell GT Systeem	Bio-Rad	1704487EDU
Biospectrometer basic	Eppendorf	6135000009
0.2 mL PCR buizen	Fisher scientific	AB-0620
1.5 mL microcentrifuge buizen	Thermo Fisher Scientific	3439
2X Taq Green PCR Master Mix	Promega	M7122
Forward Primer	Thermo Fisher Scientific	N/A
Reverse Primer	Thermo Fisher Scientific	N/A
Water, PCR kwaliteit	Sigma-Aldrich	3315953001
Gel Doc XR+	Bio-Rad	1708195
1 KB+ DNA ladder	Thermo Fisher Scientific	10787018