Methodenartikel

Isolatie en karakterisatie van cardiale mesenchymale stromale cellen uit de Bioptic monsters Endomyocardial van Arrhythmogenic cardiomyopathie patiënten

DOI:

10.3791/57263

⸱

28 februari 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Vascular Biology and Regenerative Medicine Unit, Centro Cardiologico Monzino-IRCCS, 2Department of Clinical Sciences and Community Health, Università degli Studi di Milano, 3Heart Rhythm Center, Centro Cardiologico Monzino-IRCCS

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit artikel wordt een methode om te isoleren van de cardiale mesenchymale stromale cellen uit de bioptic monsters endomyocardial van arrhythmogenic cardiomyopathie patiënten verstrekt. Hun karakterisering en het protocol bij het stimuleren van hun adipogenic differentiatie worden beschreven.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een normale volwassen hart is samengesteld uit meerdere verschillende soorten cellen, waaronder mesenchymale stromale hartcellen een overvloedige bevolking vertegenwoordigen. De isolatie van deze cellen biedt de mogelijkheid van het bestuderen van hun betrokkenheid bij hartziekten en biedt bovendien een handige oplaadbare batterij model voor het onderzoek naar biologische mechanismen.

Hier, is de methode voor de isolatie van C-MSC uit de bioptic monsters arrhythmogenic cardiomyopathie patiënten beschreven. De bemonstering van de biopsie endomyocardial wordt geleid in de rechts-ventriculaire aan het litteken gevisualiseerd door electro-anatomische toewijzing grenzende gebieden. De vertering van de biopsieën in collagenase en hun beplating op een kunststof schotel in een kweekvloeistof dat C-MSC groei wordt beschreven. De geïsoleerde cellen kunnen worden uitgebreid in cultuur voor verschillende passages. Om te bevestigen hun mesenchymale fenotype, wordt de beschrijving van de karakterisering van de immuno-phenotypical gegeven. C-MSC zijn bekwaam om te onderscheiden in verschillende celtypen, zoals adipocytes, chondrocyten en botcellen: in het kader van de ACM, gekenmerkt door adipocyte deposito's in de harten van de patiënten, de protocollen voor de differentiatie van de adipogenic van C-MSC en de karakterisering van lipide druppel accumulatie worden beschreven.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mesenchymale stromale cellen (MSC) zijn volwassen cellen met een belangrijke ondersteunende functie in vele weefsels1. Het beenmerg vertegenwoordigt de historische bron van MSC, maar zij kunnen worden geïsoleerd uit verschillende weefsels, met inbegrip van de placenta, adipeus weefsel, navelstrengbloed, lever en hart1,2.

In 2006, de International Society voor cellulaire therapie (ISCT), voor de eerste keer, de criteria hebt opgegeven minimale menselijke MSC3definiëren. In het bijzonder, moet MSC de mogelijkheid hebben zich te houden aan de kunststof. Zij uiten specifieke oppervlakte antigenen: de positiviteit voor mesenchymale markeringen van CD44, CD105, CD29 en CD90 en de negativiteit voor CD14, CD45, CD34, CD31-markeringen voor hematopoietische en endotheel karakteriseren MSC. Als gevolg van het gebrek aan expressie van HLA-DR, MSC zijn niet in staat om te activeren alloreactivity. Bovendien zijn ze Multipotente cellen met het potentieel om te differentiëren naar adipogenic, chondrocyten en osteoblast lineages1,3.

Focussen op cardiale cellulaire samenstelling, zijn mesenchymale stromale hartcellen (C-MSC) overvloedig in een normaal volwassen hart4,5. Ze spelen een cruciale rol, zowel in de normale hartfunctie en pathologische condities. Tijdje, fysiologisch, C-MSC bieden een communicatie die de structurele en functionele integriteit van het myocardium ondersteunt, in hart-en vaatziekten zijn ze geactiveerd in reactie op hart schade deelnemen aan de wondgenezing en fibrotische remodeling6 ,7.

De betrokkenheid van C-MSC in arrhythmogenic cardiomyopathie (ACM) obesitas substitutie heeft onlangs aangetoond dat8. In het bijzonder is ACM een genetische aandoening vooral veroorzaakt door mutaties in desmosomal-genen die tot myocardiale fibro-vetzuren vervanging, voornamelijk in het rechterventrikel9 leiden. Deze substitutie, zich uitstrekt van Epicard tot endocard, maakt u een niet-geleidende substraat dat lokt progressieve hartfalen en verergert ventriculaire aritmieën, die, in ernstige gevallen, tot plotselinge dood leiden kunnen. Sommariva et al. de mesenchymale oorsprong van de pre adipocytes aangetoond in ACM patiënten transplanteren hart secties aanwezig. Bovendien is C-MSC geïsoleerd van endomyocardial Biopten van ACM harten uitdrukkelijke desmosomal genen en daarom kan worden beïnvloed door hun mutaties. In het bijzonder onder adipogenic omstandigheden, ACM C-MSC accumuleren meer lipiden dan die van controle harten. Dit bewijsmateriaal leidt tot de conclusie dat de C-MSC zowel een actieve rol in de pathogenese van de ziekte hebben, en een geldige cel model vertegenwoordigen te bestuderen van ACM.

Ter vergemakkelijking van toekomstig onderzoek in dit kader of in andere hart-en vaatziekten waarvoor een cardiale biopsie wordt aangegeven, wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd voor de isolatie van C-MSC uit kleine fragmenten van endomyocardial weefsel, hun expansie, hun immuno-phenotypical karakterisering en differentiatie van de adipogenic.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze aanpak in overeenstemming is met de verklaring van Helsinki en rechts ventriculaire monsters was (07/06/2012) door "Centro Cardiologico Monzino IRCCS" ethische commissie goedgekeurd.

1. oplossingen

  1. Maken van TMES medium voor C-MSC cultuur met Iscove van bewerkt Dulbecco Medium (IMDM), aangevuld met 20% foetale boviene Serum (FBS), 10 ng/mL basis fibroblast groeifactor, 10.000 U/mL penicilline, 10.000 µg Mo/mL streptomycine en 0,02 M L-Glutamine. Filteren van het TMES medium met behulp van een 0,22 µm steriele filter eenheid en bewaren bij 4 ° C.
  2. Ter voorbereiding van collagenase oplossing, resuspendeer de collagenase NB4 mix op IMDM middellange tot het verkrijgen van een definitieve oplossing met een concentratie van 3 mg/mL. Vortex zachtjes te ontbinden van het poeder en filtreer de oplossing van de collagenase met behulp van een filter van 0,2 µm spuit. Aliquot 1 mL volume in 2 mL steriele buizen en opslag bij-20 ° C tot die nodig zijn voor gebruik.
  3. Bereiden van T. ADIPO medium te maken adipogenic medium met IMDM medium aangevuld met 10% FBS, 0.5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine (vooraf verdund in dimethylsulfoxide (DMSO) met een concentratie van 0,5 M en bewaard bij-20 ° C tot gebruik), 1 µM hydrocortison (vooraf verdund in DMSO op 100 mM en verder verdund tot 10 mM in steriel gedistilleerd water en bewaard bij-20 ° C tot gebruik) en 0.1 mM indomethacin (vooraf verdund in DMSO bij een concentratie van 0,5 M en bewaard bij-20 ° C tot gebruik). Filteren van het T. ADIPO-medium met behulp van een 0,22 µm steriele filter eenheid en bewaren bij 4 ° C.
  4. Bereiden van wassen buffer samengesteld uit fosfaat gebufferde zoutoplossing 0.0067 M PO4 (PBS), ethyleendiamine tetra azijnzuur (EDTA) 5 mM, en 5% bovien serumalbumine en bewaren bij 4 ° C.
  5. Bereiden olie rood O (ORO) werkende oplossing door ontbinding van 1% ORO poeder in 60% isopropanol, mengen voor 2 h en filteren met behulp van een 0,22 µm filter eenheid precipitaten verwijderen. Bewaar de werkoplossing bij kamertemperatuur (RT).

2. isolatie van cardiale mesenchymale stromale cellen

  1. Cardiale biopsie verzameling en verwerking
    Opmerking:     voordat u begint, zorg ervoor dat de collagenase oplossing en het TMES medium klaar.
    1. Zet de ACM endomyocardial biopsie (meestal ongeveer 5 mg van weefsel) in een steriele buis gevuld met TMES en het vervoer naar het laboratorium.
      Opmerking: ACM biopten worden verzameld in de operatiekamer electrofysiologie volgens eerdere rapporten10. Kortom, de integratie van electro-anatomische mapping en intracardiac echocardiografie in het rechterventrikel (Zie Video 1) wordt gebruikt om te sturen van de biopsie endomyocardial (Zie Video 2, fluoroscopie) schriftelijk aan de rand-zone van de zieke myocard. Gezonde controle (HC) monsters worden geleverd door een bio-weefselbank, verkregen uit de rechts-ventriculaire gratis muur van dode foetussen donoren binnen de 24 uur van de dood (overlijden door een ongeval, gezonde proefpersonen). Tijdens het vervoer en vóór dissectie, slaan de biopsie in TMES bij 4 ° C. De tijd tussen biopsie verzameling en verwerking van het weefsel (max 24 h) te beperken.
    2. Instellen van de biologische veiligheid kabinet met vereiste oplossingen voor het uitvoeren van de procedure tot de enzymatische spijsvertering.
    3. Zet de sterilisator onder de motorkap en zet het instrument 15 min vóór gebruik totdat de temperatuur 200-250 ° C. stijgt
    4. Steriliseren schaar en pincet voor 10 s. Make zeker de gesteriliseerde instrumenten zijn koud vóór gebruik. Wegwerp steriele scalpels voor te bereiden.
    5. Plaats de buizen met de biopsie in de steriele kap. Open de tube en breng de biopsie in een steriele plaat.
    6. Wassen van de biopsie rechterventrikel tweemaal met 3 mL steriele PBS. Als u nemen van een foto van de biopsie op de Microscoop wilt.
    7. Overdracht van het rechterventrikel biopsie, met behulp van steriele pincet, in een steriele 2 mL-buis met 1 mL van de oplossing van collagenase.
    8. Het monster in 0.5 - 1 mm3 stukjes gesneden met een steriele schaar.
    9. Incubeer gedurende 1,5 uur bij 37 ° C onder continu roterende agitatie.
    10. Centrifugeer het verteerd oplossing bij 400 x g gedurende 10 minuten op RT.
    11. Verwijder het supernatant en voeg 1 mL steriele PBS te wassen de pellet.
    12. Centrifugeer bij 400 x g gedurende 10 minuten op RT.
    13. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 1 mL TMES voedingsbodem.
    14. Plaat van de verkregen schorsing op steriele 60 mm Weefselkweek behandeld bord en TMES medium tot het eindvolume van 3 mL toevoegen. Incubeer de plaat in een cel cultuur incubator bij 37 ° C met 5% CO2.
      Opmerking: Een hoger volume van medium kan voorkomen dat de juiste hechting van een verteerd biopsie fragmenten.
    15. Gooi na 24 h, het medium om niet-aanhanger cellen en puin te verwijderen.
      Opmerking: Afzonderlijke gedissocieerde mesenchymale cellen kunnen hechten aan het plastic oppervlak en aanleiding geven tot klonen; ook kunnen onverteerd kleine biopsie fragmenten hechten aan de kunststof schotel en laat cel kiemen.
    16. Wassen van de plaat twee keer met 5 mL steriele PBS en voeg 3 mL verse TMES medium.
    17. Vervang het TMES medium drie keer per week tot de cellen 80% heuvels zijn.
      Opmerking: Het aantal gekoppelde cellen hangt af van de kwaliteit, de hoeveelheid weefsel, en de efficiëntie van de spijsvertering.

3. cel expansie

Opmerking: Zorg ervoor dat heb TMES medium klaar voordat u begint.

  1. Wanneer de cellen 80% confluente, overdracht de verteerd kleine bioptic monsters in een nieuwe steriele 60 mm Weefselkweek behandeld plaat en voeg 3 mL verse TMES medium.
    Opmerking: De bioptic monsters kunnen worden hergebruikt voor verdere C-MSC isolatie. Het is mogelijk deze procedure herhalen totdat er een aanzienlijk aantal geïsoleerde cellen.
  2. De gekoppelde cellen tweemaal met 3 mL steriele PBS te wassen. Voeg trypsine-EDTA-oplossing (0,5 mL voor een schotel van 60-mm) en Incubeer bij 37 ° C gedurende 3-5 minuten om mobiele-detachement.
  3. Wanneer de cellen worden losgemaakt van het oppervlak van de plaat, Voeg 0,5 mL steriele FBS inactivering van de trypsine en verzamelen van cellen in een nieuwe steriele tube van 50 mL.
  4. Wassen van de plaat twee keer met 5 mL steriele PBS de resterende cellen toevoegen aan de dezelfde buis.
  5. Centrifugeer de cellen bij 400 x g gedurende 10 minuten op RT.
  6. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 1 mL TMES voedingsbodem.
  7. Laden 10 µL van de celsuspensie in de cel tellen kamer.
    Opmerking: Als de cellen ook geconcentreerd, Verdun de eerste schorsing 1:10 in PBS en laden van 10 µL van de verdunde cellen in de cel tellen kamer.
  8. Onder de Microscoop, cellen in 3 grote pleinen en op de regels van twee van hun kant tellen en het gemiddelde aantal cellen berekenen.
    Opmerking: Voor het verkrijgen van het aantal cellen/mL, het gemiddelde van de getelde cellen wordt vermenigvuldigd met 104, de verdunningsfactor van de cel tellen kamer. Als de cellen hebben zijn verder verdund, vermenigvuldigen voor de verdunningsfactor. De verhouding tussen het aantal cellen om het zaad en de concentratie van de cel (aantal cellen/mL) komt overeen met het volume (in mL) van de eerste schorsing te worden vergulde voor de volgende stap (punt 3.9).
  9. Plaat van de resuspensie op steriel 100 mm Weefselkweek behandeld platen op een eindconcentratie van 5.000-10.000 cellen/cm2 en TMES medium tot het eindvolume van 8 mL toevoegen. Incubeer de plaat in een cel cultuur incubator.
    Opmerking: Herhaal de cel expansie procedure wanneer de cellen 70-80% heuvels zijn. Bij elke passage (P), is het aanbevolen om het cryopreserve deel van de cellen en de plaat het resterende bedrag. De cellen uit te breiden tot P3 of P4 en gebruik voor TL-activated cell sorter (FACS) analyse (punt 4) en adipogenic differentiatie (sectie 5).
  10. Centrifugeer voor cryopreservatie na detachement, de cellen bij 400 x g gedurende 10 minuten op RT.
  11. Cellen tellen als beschreven (stappen 3.7-3,8) en 1 x 106 cellen in 900 µL van steriele FBS resuspendeer. Een steriele cryo-flacon overbrengen en voeg 100 µL van steriele DMSO en mix.
  12. Snel opslaan de cryo-flesjes bevriezing verpakkingsgasssen bij-80 ° C gedurende ten minste 2 dagen en breng vervolgens de flesjes in vloeibare stikstof.

4. karakterisering van cardiale mesenchymale stromale cellen door Stroom Cytometry

Opmerking: Voordat u begint, zorg ervoor dat de cel dissociatie reagens, wasmachine buffer en de specifieke antilichamen bereid hebben.

  1. Wanneer het celaantal bereikt minstens 3 x 10 wassen6 (graaf de cellen als in 3.7-3.8 beschreven), de 100-mm plaat tweemaal met 10 mL steriele PBS.
  2. Voeg 5 mL van een cel dissociatie reagens en 7-10 min op RT dat de mobiele-detachement wachten.
  3. Wanneer de cellen worden losgemaakt van het oppervlak van de plaat, voeg toe 15 mL steriele wassen buffer en de schorsing te verzamelen in een nieuwe steriele tube van 50 mL.
  4. Wassen van de plaat twee keer met 10 mL buffer te wassen en voeg de resterende cellen aan de dezelfde buis.
  5. Centrifugeer de cellen bij 400 x g gedurende 10 minuten bij RT en resuspendeer de pellet in 1 mL buffer te wassen.
  6. Cellen tellen als beschreven (stappen 3.7-3.8), en 3 x 106 cellen overboeken naar een nieuwe steriele buis en wassen buffer aan het uiteindelijke volume van 1,5 mL toevoegen.
    Opmerking: De cel Totaal aantal en het totale volume van wassen buffer is afhankelijk van het aantal geselecteerde markeringen gebruikt bij de analyse (3 x 10-5 cellen in 100 µL voor elke FACS polystyreen buis).
  7. Verdelen van 100 µL van cellulaire suspensie in 12 verschillende FACS polystyreen buizen, en voeg het specifieke antilichaam aan de concentratie in het gegevensblad product aangegeven.
    Opmerking: Antilichamen gebruikt voor de karakterisering van het C-MSC zijn CD34, CD105, CD45, CD29, CD90, CD44, CD31, CD14 en HLA-DR (tabel 1). Het is belangrijk om te bereiden een controlemonster samengesteld uit 100 µL van de geresuspendeerde cellen gekleurd met de isotype te controleren om te controleren de specificiteit van het signaal.
  8. Incubeer de monsters gedurende 15 min. in het donker.
  9. Voeg 1 mL steriele wassen buffer aan elke buis om te stoppen met de reactie.
  10. Centrifugeer de cellen bij 400 x g gedurende 10 minuten op RT.
  11. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 250 µL van het wassen van de buffer.
  12. Ga verder met de karakterisering van het C-MSC met stroom cytometry.

5. Adipogenic differentiatie van cardiale mesenchymale stromale cellen

Opmerking: Voordat u begint, zorg ervoor dat T. ADIPO medium en ORO werkoplossing hebt voorbereid.

  1. Cultuur in T. ADIPO medium
    1. Loskoppelen en de cellen zoals beschreven in sectie 3 tellen.
    2. Plaat 3 x 105 cellen op elk putje van een steriele 6-well Weefselkweek behandeld plaat in 2 mL zuiver T. ADIPO medium.
    3. Laat C-MSC onderscheiden in T. ADIPO medium voor 72 uur of 1 week, veranderen van gemiddeld elke 2-3 dagen.
  2. Olie Red O kleuring
    Opmerking:     gebruik olie Red O (ORO) vlekken om te testen de lipide-accumulatie in C-MSC.
    1. Plaats de 6-well weefselkweek plateunder de zuurkast.
    2. Verwijder het medium van de adipogenic en wassen van de cellen tweemaal met 2 mL PBS.
    3. Toevoegen van de voldoende hoeveelheid 4% paraformaldehyde (PFA) ter dekking van elk goed. Bevestigen van de cellen gedurende 5 minuten op RT.
    4. PFA negeren en wassen van de cellen tweemaal met 2 mL PBS.
    5. Incubeer de vaste cellen met ORO werkende oplossing voor 1 h op RT, met behulp van genoeg volume ter dekking van elk goed.
      Opmerking: Houd niet de 6-well weefselkweek plaat onder de zuurkast tijdens ORO incubatie om te voorkomen dat de verdamping van de ORO werkoplossing.
    6. Verwijder alle ORO werkoplossing en wassen met 2 mL PBS 3 - 5 keer totdat de plaat is volledig gereinigd; Gooi wast. Stop de wasbeurten wanneer de PBS gebruikt duidelijk is en als je niet ziet, onder de Microscoop, aspecifieke kleuring uit de cellen.
    7. 20 opnamen bij 20 X vergroting voor elk putje met behulp van de omgekeerde weefselkweek fase contrast Microscoop.
    8. De foto's worden geopend met het programma van de verwerking van het beeld te kwantificeren van de cel ORO accumulatie.
    9. Scheid de verschillende kleurkanalen via de functie "Kanalen splitsen" om te kwantificeren van alleen de helderheid in het kanaal van 255-rood.
    10. Het aantal cellen voor elke afbeelding door het tellen van de kernen. Normaliseren de ORO signaal intensiteit op het nummer van de cel.
    11. Bereken het gemiddelde van de resultaten voor elke afbeelding van hetzelfde monster.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cardiale stromale cellen isolatie: De C-MSC los van endomyocardial biopsieën procedure is samengevat in Figuur 1.

Cardiale stromale cellen mesenchymale karakterisering: Zoals vastgesteld door de International Society voor cellulaire therapie (ISCT), bevat de minimale criteria voor het definiëren van multipotente mesenchymale stromale cellen hun immuno-fenotypische karakterisering3. In het bijzonder, om te bevestigen hun mesenchymale afstamming, worden cellen geïncubeerd met passende FITC/PE/APC-geconjugeerde antilichamen en geanalyseerd door stroom cytometry. Alle van de antilichamen die gebruikt in de C-MSC karakterisering worden weergegeven in Tabel van materialen.

Zoals geïllustreerd in Figuur 2, zijn C-MSC verkregen uit biopsieën positief voor de specifieke mesenchymale oppervlakte antigenen, CD29, CD44 en CD105. Het percentage positieve cellen CD90 is variabele, zoals gemeld eerder11. Het endotheel (CD31, CD34), monocyt/macrofaag (CD14), hematopoietische (CD45)-markeringen en grote histocompatibility complex (HLA-DR) zijn niet uitgedrukt (Figuur 2).

Cardiale mesenchymale stromale cellen adipogenic differentiatie: Om te vragen hun adipogenic differentiatie, C-MSC patiënten beïnvloed door ACM en HC verkregen moeten worden gekweekt in medium T. ADIPO (Zie oplossingen sectie). De cellen worden bijgehouden in cultuur voor 72 uur of 1 week, ter vervanging van het medium tweemaal per week.

De accumulatie van intracellulaire lipide druppeltjes blijkt uit ORO kleuring (Figuur 3). Verschillen in het vermogen, alsmede in de graad van differentiatie, waarneembaar tussen de cellen verkregen ACM en HC. Zoals blijkt uit de representatieve beelden, ACM C-MSC worden bij elkaar opgeteld meer lipide druppels dan HC C-MSC na 72 uur van cultuur in adipogenic medium (Figuur 3). Deze verschillen worden ook bijgehouden wanneer de cellen worden blootgesteld aan adipogenic differentiatie voorwaarden voor een langere periode (1 week) (Figuur 3).

figure-results-1
Video 1: Integratie van electroanatomical kaart en intracardiac echocardiografie. Endocardial unipolaire electroanatomical kaarten van het rechterventrikel (linker anterior schuine en rechts anterior schuine meningen) bij een patiënt die endomyocardial biopsie (lagere panelen ondergaat). Beperkte gebieden van laagspanning (rood/groen) zijn zichtbaar op de apex. Endomyocardial bioptic (gelabeld als cirkel) bemonstering in correspondentie aan de zieke myocard en het hart septum. Real-time intracardiac echocardiografie kunt controleren op de juiste positie van de bioptome op het doelgebied (bovenste deelvenster). Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)

figure-results-2
Video 2: fluoroscopie video rechts anterior schuine volgens. De bioptome wordt ingebracht via een lange-deflectable schede en schoof in de ventrikel. Na een zorgvuldige controle van de bioptome contact met het myocardium, zijn de kaken geopend en vervolgens stevig gesloten voor het verzamelen van het monster. Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)

figure-results-3
Figuur 1: Procedure ontwerp. Het bioptic monster van endomyocardial wordt verzameld met behulp van een bioptome katheter, een kleine Tang-vormige snijden instrument. Het gewicht van de verkregen biopsie is ongeveer 5 mg (A). Het endomyocardial bioptic monster in 0,5 - 1 mm3 fragmenten, met een steriele schaar (B), is gehakt en collagenase oplossing is toegevoegd. Het monster wordt in een incubator 37 ° C op een roterende mixer van het platform voor 1,5 h van de spijsvertering (C) geplaatst. De verteerd oplossing is gecentrifugeerd en verguld in TMES in een kunststof schotel (D). C-MSC worden verkregen dankzij hun naleving van de kunststof eigenschappen in afzonderlijke cellen of klonen, of het kiemen van kleine onverteerd bioptic fragmenten (E). C-MSC worden vervolgens gekenmerkt door stroom cytometry (F). C-MSC zijn verguld in adipogenic medium en lipide druppel accumulatie is getest door olie Red O (G) kleuring. Schaal staven geven 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-4
Figuur 2: vertegenwoordiger cyto-fluorimetrische Profiel van C-MSC. Elke histogram toont de telling van de cel versus de intensiteit van de fluorescentie in het aangegeven kanaal (PE: phycoerythrin; APC: allophycocyanin; FITC: fluoresceïne-isothyocyanate). In elke grafiek het isotype besturingselement (wit) en een steekproef geconjugeerd met de specifieke cel oppervlakte marker antilichaam (rood) weergegeven. C-MSC zijn positief voor de mesenchymale oppervlakte antigenen CD29, CD44, CD105 en gedeeltelijk voor de CD90, terwijl zij niet doen uitdrukken, CD31, CD34, CD14, CD45 en HLA-DR. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-5
Figuur 3: Adipogenic differentiatie van C-MSC. Representatieve beelden van ACM en HC C-MSC, gekweekt in adipogenic medium voor 72 uur en 1 week, gekleurd met ORO (linker foto's; n = 3). In de juiste grafieken, kwantificering van de luminantie van de 255-rood kanaal kleuring wordt gemeld: intensiteit wordt uitgedrukt in willekeurige (A.U.). ACM C-MSC accumuleren meer lipide druppels dan controles. Van de Student T-test werd gebruikt, *: p < 0.05. Schaal staven geven 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MSC en C-MSC: MSC zijn Multipotente cellen woonachtig in de stromale Fractie van verschillende volwassen weefsels, zoals het beenmerg adipeus weefsel, kraakbeen, hersenen, huid, foetale bijlagen en hart12. Verschillende onderzoeken zijn uitgevoerd om te isoleren en karakteriseren ze voor mogelijke toepassingen in fundamenteel en translationeel onderzoek12,13.

In gezonde omstandigheden, MSC zijn sluimerende, zichzelf vernieuwende op lage tarieven14. Aangezien ze worden blootgesteld aan pathologische veranderingen in het milieu, reageren ze bevorderen weefsel remodeling via directe transdifferentiatie, matrix depositie of de paracrine effect14.

De cardiale MSC (MSC-C) vertegenwoordigen een grote niet-myocyte-celpopulatie van de hart-4. Ze zijn afkomstig uit de Epicard en migreren naar het myocardium ondergaat het proces van epitheliale-naar-mesenchymale overgang15. Zij dragen bij tot de mechanische en elektrische integriteit van de cardiale structuur, zowel in fysiologische en pathologische staten, door middel van interacties met cardiomyocytes en7,16van de homeostase van de extracellulaire matrix. De functies van het brede bereik van C-MSC is echter nog steeds niet volledig begrepen. Een diepere kennis van hun rol, die zowel in fysiologische en pathologische omstandigheden kunnen worden vergemakkelijkt door in vitro studies uitgevoerd na hun isolement.

C-MSC zijn verkregen uit verschillende wijken van het menselijk hart, zoals de atriale aanhangsel2,17 en rechterventrikel18.

Onlangs, C-MSC van menselijke rechts-ventriculaire endomyocardial bioptic monsters zijn verkregen8, aan te tonen dat het weefsel van de bron zou kunnen zijn zo weinig als 3-5 mg.

Mogelijke toepassingen: De methode geschetst in dit manuscript kunt verkrijgen van cellen met een paar eenvoudige passages, zoals spijsvertering en selectie voor de naleving van het plastic, van zeer kleine hart exemplaren.

C-MSC kan een cel model, omdat ze eenvoudig zijn te versterken en te handhaven in vitro, en zijn bekwaam om te onderscheiden in cellen van mesenchymale overdrachtslijn (endotheel, osteocytes en adipocytes) worden beschouwd. Bovendien is de mogelijkheid van het verkrijgen van cellen rechtstreeks vanuit patiënten een grote in vitro -instrument voor mechanistisch onderzoek in het kader van gepersonaliseerde/precisie geneeskunde. Inderdaad, deze cellen dragen de genetische achtergrond en uiteindelijk specifieke mutaties van de donoren, en worden beïnvloed door de kenmerken van de specifieke patiënten, zoals klinische omstandigheden, leeftijd, geslacht, levensstijl en medicijnen. Bovendien, de mogelijkheid om te sorteren hen voor verschillende markeringen kan toestaan dat de studie van specifieke C-MSC deelverzamelingen19.

C-MSC bekend is dat ze actieve spelers in verschillende cardiovasculaire ziekten, meestal gekenmerkt door de nadelige remodelleren van het hart. Daarom, zij vertegenwoordigen kandidaat-streefcijfers voor de nieuwe therapeutische strategieën om tegen hart-en vaatziekten8,20te gaan.

C-MSC stam-achtige eigenschappen en hun gebrek aan significante immunogeniciteit suggereert hun mogelijke toepassing in cel-therapie voor cardiale regeneratieve geneeskunde. Inderdaad, zoals MSC uit beenmerg of andere bronnen, C-MSC kon potentieel gebruikt worden zowel in autologe en allogene instellingen, zonder de noodzaak voor matching tussen donor en ontvanger21.

Bovendien, C-MSC, afgezonderd rechtstreeks vanuit hartweefsel, hebben het voordeel van wordt geconditioneerd door de cardiale micro-omgeving en epigenetische profiel. In het kader van cardiale regeneratieve geneeskunde zou dit met name belangrijk om succesvolle resultaten te behalen.

Tot op heden, preklinische studies van regeneratieve geneeskunde geïdentificeerd nuttige therapeutische mogelijkheden in de C-MSC en hun paracrine activiteit18,22,23. Belangrijker, lopen klinische proeven, waarin de cel bron het hart is met cardiosfere-afgeleide cellen of subpopulaties van C-MSC13,24,25. Echter wat bot-merg-afgeleide MSC, kunnen verschillende protocollen nodig zijn om te verkrijgen van klinische rang C-MSC26.

C-MSC in ACM: Het gepresenteerde protocol is vooral geschikt voor de studie van pathologieën waarvoor een endocardial biopsie wordt aangegeven. ACM patiënten ondergaan bioptic procedures voor diagnostische doeleinden27. Hun myocard wordt geleidelijk vervangen door littekenweefsel, een elektrisch inerte weefsel bestaat uit adipocytes en fibrose. Om de bioptic bemonstering begeleiden naar het litteken-gebied, waar de diagnostische opbrengst maximale is, is endomyocardial toewijzing gebruikte10,28,29. De in dit protocol gebruikte monsters zijn genomen in het grensgebied van de zieke myocard.

Sommariva et al. heeft onlangs een sleutelrol voor C-MSC gedefinieerd in de pathogenese van ACM8, waaruit blijkt dat C-MSC actieve spelers in ACM hart adipogenesis, daar preadipocytes in de harten van mesenchymale oorsprong. Bovendien is C-MSC geïsoleerd met dit protocol van ACM patiënten biopsieën bleek meer neiging om zowel lipide accumulatie en adipogenesis dan controles. Om deze reden, kon deze cellen worden gebruikt ter bevestiging van sommige van de moleculaire mechanismen van ACM, bewijzen hun geschiktheid als een cel model voor mechanistisch onderzoek9.

Beperkingen en kritische stappen: Ondanks de voordelen van het verkrijgen van C-MSC rechtstreeks van patiënten (Zie de paragraaf "Mogelijke toepassingen"), wordt dit protocol onderworpen aan verschillende beperkingen.

Allereerst de cardiale bioptic procedure is invasieve en vaak vermeden als niet strikt noodzakelijk. Inderdaad, bemonstering van cardiale weefsel is zowel ethisch als technisch problematisch. Redenen voor het uitvoeren van een cardiale biopsie kunnen zijn het bereiken van een definitieve diagnose in de context van hartziekten in de differentiële diagnose, status van cardiale transplantaties volgen, of het nagaan van de aanwezigheid van een tumor hart30. Daarom kunnen alleen de patiënten die een biopsie van de endomyocardial wordt aangegeven door consensus verklaring31 worden ingeschreven voor onderzoek op C-MSC. Bovendien, de cardiale bioptic procedure kan klinische complicaties hebben, vooral in cardiomyopathic hart. Daarom elektrofysioloog van proeverijen zijn altijd voorzichtig en bioptic monsters zou zeer klein, afbreuk te doen aan het isolement van de cellen. Toekomstige experimenten kunnen dit probleem opgelost door tuning collagenase concentratie of het tijdstip van de spijsvertering.

C-MSC, tonen als alle primaire menselijke cellen, een hoge variabiliteit tussen verschillende onderwerpen in alle fenotypen. Cellen uit verschillende onderwerpen zijn namelijk niet alleen genetisch verschillende, maar ook onderworpen aan de variabele van milieu Airconditioning. In het bijzonder binnen dit experiment, wordt een hoge variabiliteit in isolatie, groei en adipogenic van celdifferentiatie waargenomen.

Kritische stappen van dit protocol moeten worden erkend. Als het bioptic monster haarvaten bevat, moeten zij worden verwijderd om te voorkomen dat de parallelle Isolatievan endotheliale cellen, die de cultuur van de C-MSC kan besmetten, en kan worden aangetoond door de FACS analyse (positiviteit voor CD31). Voor het verkrijgen van een efficiënt adipogenic differentiatie, moeten cellen zich in een actieve groeifase. Lipide accumulatie kan ook van invloed zijn de mate van samenloop.

Betekenis van de methode: Met betrekking tot de vorige methoden van isolatie van mesenchymale stromale cellen is dit de eerste keer waar de beschrijving van C-MSC aanschaf direct uit menselijke ventriculaire bioptic monsters in detail wordt voorgesteld. Hoewel deze methode wordt voorgesteld voor de verwerking van ACM patiënt monsters, geldt het mogelijk voor alle patiënten waarvoor een cardiale biopsie wordt aangegeven.

Dit protocol vormt een nuttige toepassing van vorige methoden voor de aanschaf van cellen die vereist grotere cardiale monsters32, die vaak moeilijk zijn te verzamelen.

De monsterbron vormt bovendien een interessante innovatie. Terwijl de ventriculaire biopsie wordt doorgaans uitgevoerd op de septum33, neemt dit protocol in rekening monsters van de rechts-ventriculaire gratis muur. Cellen die zijn afgeleid van de zieke het recht ventriculaire district wellicht meer representatief is voor de pathologische status van ziekten waarbij RV.

Daarnaast zijn sommige van de in dit protocol gebruikte reagentia verschillen met betrekking tot andere C-MSC isolatie en differentiatie methoden32. Bijvoorbeeld, het soort collagenase voorgesteld in dit manuscript is een mix van klasse I en klasse II collagenases met een evenwichtige verhouding van Proteolytische activiteiten. Bovendien is de spijsvertering-oplossing bestaat uit de collagenase mix opgelost in hetzelfde Basaal medium (IMDM) gebruikt voor de bereiding van C-MSC kweekmedium, waardoor geïsoleerde C-MSC aan te passen aan voorwaarden van de toekomstige groei.

Bovendien, hoewel sorteren procedures kan het standaardiseren van de partij van de cel, met behulp van de gehele bevolking van de C-MSC, geïsoleerd alleen via de eigenschap van de naleving van de kunststof van deze cellen, vormt een vereenvoudiging zonder het wijzigen van de immunophenotypic kenmerken van C-MSC. De samenstelling van T. ADIPO voorgesteld in dit manuscript kan leiden tot een differentiatie van de adipogenic, het vermijden van de metabole disregulatie geïnduceerd door andere componenten zoals insuline.

Bovendien, de voorgestelde methode van lipide accumulatie kwantificering, die is gebaseerd op de evaluatie van de ORO colorimetrische intensiteit, vindt u meer informatie over de hoeveelheid van de geaccumuleerde lipiden, als in vergelijking met methoden die alleen gebaseerd op het percentage van cellen positief hebben gereageerd op de ORO kleuring. Vaak lipide accumulatie wordt gekwantificeerd door het extraheren van de ORO opgenomen door de cellen met isopropanol en het meten van de absorptie. Echter, deze methode vereist meer passages en is onderworpen aan variabiliteit als gevolg van verdamping van isopropanol.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gefinancierd door het Italiaanse ministerie van gezondheid, Ricerca Corrente aan Centro Cardiologico Monzino-IRCCS.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
IMDMGibco by Life Technologies 12440053
Fetal Bovine Serum (FBS)Sigma-AldrichF2442
PENICILLIN STREPTOMYCINLife Technologies Italia15140122
Collagenase NB4Serva17454.02
Basic fibroblast growth factorPeprotech100-18B
L-glutammineSigma-AldrichG7513
PBSLonza17-516F
Tryple select 1X (cell dissociation reagent)Gibco12563029
EDTASigma-AldrichEDS
Trypsin-EDTA solution Sigma-AldrichT6689
Bovine Serum AlbuminSigma-AldrichA2058
3-Isobutyl-1-methylxanthineSigma-AldrichI5879
HydrocortisoneSigma-AldrichH4001
IndomethacinSigma-AldrichI7378
Oil Red OSigma-AldrichO0625
IsopropanolSigma-AldrichI9516
Paraformaldehyde (PFA) Solution 4% in PBSD.b.a. Italia S.r.l.sc-281692
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Sigma-Aldrich276855
Antibody CD14-FITC (MφP9)Becton Dickinson345784
Antibody Integrin β1 (CD29)-PE (clone MAR4)Becton Dickinson561795
Antibody PECAM-1 (CD31)- APC  (clone 9G11)R&D SystemsFAB3567A
Antibody Hematopoietic progenitor cell antigen (CD34)-APC (clone 581)Thermo Fisher Scientific CD34-581-05
Antibody H-CAM (CD44)-PE  (clone G44-26)Becton Dickinson561858
Antibody L-CA (CD45)-APC (clone HI30)Thermo Fisher ScientificMHCD4505-4
Antibody THY1 (CD90)-FITC (clone 5E10)Becton Dickinson561969
Antibody Endoglin (CD105)-APC (clone 266)Becton Dickinson562408
Antibody HLA-DR-FITC (clone L243)Becton Dickinson
347400
Gima Quick Plus sterilizerGima 35642
Bench centrifuge Sigma 3-16KSigma Centrifuges10330
Mr. Frosty Freezing ContainerThermo Fisher Scientific 5100-0001
AxioVert 200M microscope ZeissB 40-080 e 03/01
FACS GalliosBeckman Coulter 773231AF
ImageJ (image processing program)NIH
Stericup filter unitsMerck S.P.A. SCGPU05RE
Conical Tubes, 50 mLEppendorf30122178
Conical Tubes, 15 mLEppendorf30122151
Safe-Lock Tubes, 2 mLEppendorf30120094
100 mm TC-Treated Cell Culture DishCorning430167
60 mm TC-Treated Cell Culture DishCorning430166
6 well TC-Treated Multiple Well PlatesCorning3516
Polystyrene Round-Bottom Tubes, 5 mLBD Falcon352058
BRAND counting chamber BLAUBRAND Bürker-TürkSigma-AldrichBR719520

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brooke, G., et al. Therapeutic applications of mesenchymal stromal cells. Semin Cell Dev Biol. 18 (6), 846-858 (2007).
  2. Rossini, A., et al. Human cardiac and bone marrow stromal cells exhibit distinctive properties related to their origin. Cardiovasc Res. 89 (3), 650-660 (2010).
  3. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  4. Doppler, S. A., et al. Cardiac fibroblasts: more than mechanical support. J Thorac Dis. 9, Suppl 1 36-51 (2017).
  5. Moore-Morris, T., Guimaraes-Camboa, N., Yutzey, K. E., Puceat, M., Evans, S. M. Cardiac fibroblasts: from development to heart failure. J Mol Med (Berl). 93 (8), 823-830 (2015).
  6. Jugdutt, B. I. Ventricular remodeling after infarction and the extracellular collagen matrix: when is enough enough. Circulation. 108 (11), 1395-1403 (2003).
  7. Brown, R. D., Ambler, S. K., Mitchell, M. D., Long, C. S. The cardiac fibroblast: therapeutic target in myocardial remodeling and failure. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 45, 657-687 (2005).
  8. Sommariva, E., et al. Cardiac mesenchymal stromal cells are a source of adipocytes in arrhythmogenic cardiomyopathy. Eur Heart J. 37 (23), 1835-1846 (2016).
  9. Sommariva, E., Stadiotti, I., Perrucci, G. L., Tondo, C., Pompilio, G. Cell models of arrhythmogenic cardiomyopathy: advances and opportunities. Dis Model Mech. 10 (7), 823-835 (2017).
  10. Casella, M., et al. Electroanatomical mapping systems and intracardiac echo integration for guided endomyocardial biopsy. Expert Rev Med Devices. 14 (8), 609-619 (2017).
  11. Beltrami, A. P., et al. Multipotent cells can be generated in vitro from several adult human organs (heart, liver, and bone marrow). Blood. 110 (9), 3438-3446 (2007).
  12. da Silva Meirelles, L., Chagastelles, P. C., Nardi, N. B. Mesenchymal stem cells reside in virtually all post-natal organs and tissues. J Cell Sci. 119, Pt 11 2204-2213 (2006).
  13. Cencioni, C., et al. The double life of cardiac mesenchymal cells: Epimetabolic sensors and therapeutic assets for heart regeneration. Pharmacol Ther. 171, 43-55 (2017).
  14. Caplan, A. I. Mesenchymal stem cells. J Orthop Res. 9 (5), 641-650 (1991).
  15. Germani, A., Foglio, E., Capogrossi, M. C., Russo, M. A., Limana, F. Generation of cardiac progenitor cells through epicardial to mesenchymal transition. J Mol Med (Berl). 93 (7), 735-748 (2015).
  16. Souders, C. A., Bowers, S. L., Baudino, T. A. Cardiac fibroblast: the renaissance cell. Circ Res. 105 (12), 1164-1176 (2009).
  17. Di Maggio, S., et al. Non-oxidizable HMGB1 induces cardiac fibroblasts migration via CXCR4 in a CXCL12-independent manner and worsens tissue remodeling after myocardial infarction. Biochim Biophys Acta. , (2017).
  18. Czapla, J., et al. Human Cardiac Mesenchymal Stromal Cells with CD105+CD34- Phenotype Enhance the Function of Post-Infarction Heart in Mice. PLoS One. 11 (7), 0158745(2016).
  19. Gambini, E., et al. C-kit+ cardiac progenitors exhibit mesenchymal markers and preferential cardiovascular commitment. Cardiovasc Res. 89 (2), 362-373 (2010).
  20. Gourdie, R. G., Dimmeler, S., Kohl, P. Novel therapeutic strategies targeting fibroblasts and fibrosis in heart disease. Nat Rev Drug Discov. 15 (9), 620-638 (2016).
  21. Le Blanc, K., Tammik, C., Rosendahl, K., Zetterberg, E., Ringden, O. HLA expression and immunologic properties of differentiated and undifferentiated mesenchymal stem cells. Exp Hematol. 31 (10), 890-896 (2003).
  22. Detert, S., et al. The Atrial Appendage as a Suitable Source to Generate Cardiac-derived Adherent Proliferating Cells for Regenerative Cell-based Therapies. J Tissue Eng Regen Med. , (2017).
  23. Miteva, K., et al. Human cardiac-derived adherent proliferating cells reduce murine acute Coxsackievirus B3-induced myocarditis. PLoS One. 6 (12), 28513(2011).
  24. Bassetti, B., Capogrossi, M. C., Pompilio, G. Power Is Nothing Without Control: The Enduring Search for the Best Cell in Cardiac Cell Therapy at a Crossroads. Circ Res. 119 (9), 988-991 (2016).
  25. Nigro, P., et al. Cell therapy for heart disease after 15 years: Unmet expectations. Pharmacol Res. , (2017).
  26. Ikebe, C., Suzuki, K. Mesenchymal stem cells for regenerative therapy: optimization of cell preparation protocols. Biomed Res Int. 2014, 951512(2014).
  27. Marcus, F. I., et al. Diagnosis of arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy/dysplasia: proposed modification of the task force criteria. Circulation. 121 (13), 1533-1541 (2010).
  28. Pieroni, M., et al. High prevalence of myocarditis mimicking arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy differential diagnosis by electroanatomic mapping-guided endomyocardial biopsy. J Am Coll Cardiol. 53 (8), 681-689 (2009).
  29. Casella, M., et al. Feasibility of combined unipolar and bipolar voltage maps to improve sensitivity of endomyocardial biopsy. Circ Arrhythm Electrophysiol. 8 (3), 625-632 (2015).
  30. Cooper, L. T., et al. The role of endomyocardial biopsy in the management of cardiovascular disease: a scientific statement from the American Heart Association, the American College of Cardiology, and the European Society of Cardiology Endorsed by the Heart Failure Society of America and the Heart Failure Association of the European Society of Cardiology. Eur Heart J. 28 (24), 3076-3093 (2007).
  31. Leone, O., et al. 2011 consensus statement on endomyocardial biopsy from the Association for European Cardiovascular Pathology and the Society for Cardiovascular Pathology. Cardiovasc Pathol. 21 (4), 245-274 (2011).
  32. Monsanto, M. M., et al. Concurrent Isolation of 3 Distinct Cardiac Stem Cell Populations From a Single Human Heart Biopsy. Circ Res. 121 (2), 113-124 (2017).
  33. From, A. M., Maleszewski, J. J., Rihal, C. S. Current status of endomyocardial biopsy. Mayo Clin Proc. 86 (11), 1095-1102 (2011).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Endomyocardiale biopsiecollagenase digestieflowcytometrieadipogene differentiatieORO kleuringCD29 CD44 CD105expansie van celculturenaccumulatie van lipidedruppels

Gerelateerde artikelen