Method Article

Formaldehyde-bijgewoonde isolatie van regelgevende elementen maatregel chromatine toegankelijkheid in zoogdiercellen

DOI:

10.3791/57272

⸱

April 2nd, 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Oncohematology and Genetics. Institute of Biomedicine of Seville (IBiS), University Hospital Virgen del Rocío, 2Institute of Biochemistry, Medical Faculty, Friedrichstrasse 24, Member of the German Center for Lung Research, Justus-Liebig-University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De plasticiteit van nucleaire het platform wordt beheerd door dynamische Epigenetische mechanismen, met inbegrip van niet-coderende RNAs, DNA methylering, nucleosoom herpositionering evenals Histon samenstelling en wijziging. Hier beschrijven we een Formaldehyde-Assisted isolatie van regelgevende elementen (FAIRE)-protocol, waarmee de bepaling van de chromatine toegankelijkheid in een reproduceerbare, goedkope en eenvoudige wijze.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Passende genexpressie in reactie op de extracellulaire signalen, dat wil zeggen, weefsel - en geslacht-specifieke gen transcriptie, is kritisch afhankelijk van zeer gedefinieerde Staten van chromatine organisatie. De dynamische architectuur van de nucleus wordt beheerd door meerdere mechanismen en vormen de transcriptionele uitvoer-programma's. Het is daarom belangrijk om te bepalen van locus-specifieke chromatine toegankelijkheid op een betrouwbare manier die bij voorkeur onafhankelijk is van antistoffen, die een potentieel storende bron van experimentele variabiliteit worden kunnen. Chromatine toegankelijkheid kan worden gemeten door verschillende methoden, met inbegrip van de bepaling van de Formaldehyde-Assisted isolatie van regelgevende elementen (FAIRE), waarmee de vaststelling van algemene chromatine toegankelijkheid in een relatief laag aantal cellen. Hier beschrijven we een FAIRE-protocol waarmee snel, eenvoudig en betrouwbaar identificatie van genomic regio's met een laag eiwitgehalte bezetting. Bij deze methode wordt is het DNA covalent gebonden aan de eiwitten van de chromatine formaldehyde gebruikt als een agent crosslinking en geschoren tot kleine stukjes. De gratis DNA wordt daarna verrijkt met behulp van fenol: chloroform extractie. De verhouding van gratis DNA wordt bepaald door de kwantitatieve polymerase-kettingreactie (qPCR) of DNA sequencing (DNA-seq) in vergelijking met een controlemonster vertegenwoordigen van de totale DNA. De regio's met een lossere structuur van de chromatine zijn verrijkt met de gratis monster DNA, waardoor de identificatie van genomic regio's met een lagere compressie van de chromatine.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De genomic DNA van eukaryotische cellen is strak verpakt in nucleosomes, die moet worden verwijderd of vernieuwd zodat de interactie van andere proteïnen met het DNA. De transcriptionele activering van een gen meestal leidt tot een meer open de configuratie van de nucleosomal structuur, met name in de + 1 nucleosoom1, transcriptie vergemakkelijken door RNA-polymerase. Bovendien ondergaan regelgevende gebieden zoals initiatiefnemers en versterkers, dynamische veranderingen in hun chromatine toegankelijkheid van de interactie met de chromatine modifiers of transcriptie factoren2toestaan. Verschillende benaderingen zijn ontwikkeld om te identificeren deze nucleosoom-vrije gebieden. Deze omvatten de gevoeligheid voor nucleasen zoals DNase ik3 of micrococcal nuclease4, die alleen toegang heeft tot het DNA wanneer het niet strak rond nucleosomes verpakt is. Andere methoden voor de identificatie van de open chromatine of gratis DNA omvatten de transposase-gemedieerde integratie van retrotransposable elementen (Assay voor Transposase-toegankelijk chromatine, ATAC)5, of het gebruik van de immunoprecipitation (ChIP) van de chromatine antilichamen tegen histonen. De FAIRE methode is niet gebaseerd op de capaciteit van een enzym te bereiken van DNA of de binding van een antilichaam aan een specifieke proteïne, maar in plaats daarvan berust op de zuivering van nucleosoom-vrije regio's door een fenol: chloroform extractie6,7. Bij deze methode wordt het DNA covalent gebonden is aan eiwitten van de chromatine het crosslinking agent formaldehyde en daarna is schuingetrokken om kleine stukjes met het ultrasoonapparaat. Opeengepakte chromatine regio's hebben overvloedige DNA/proteïne crosslinks, terwijl DNA regio's met geen of weinig nucleosomes weinig of geen kruisverwijzende DNA/eiwitcomplexen zal hebben. De extractie van een fenol: chloroform kunt zuivering van de niet-kruisverwijzende gratis DNA in de waterige fase, terwijl de DNA kruisverwijzende aan eiwitten is gevangen in de biologische fenol fase of waterige-organische interfase samen met de eiwitten. De kwantificering van deze gratis DNA in vergelijking met een referentie van totale DNA-monster maakt de identificatie van de chromatine vrije regio's. De FAIRE-methode kan worden gebruikt voor de karakterisering van individuele genomic gebieden zoals hier beschreven, maar is ook geschikt voor de identificatie van genoom-brede chromatine toegankelijkheid wanneer gekoppeld aan diepe sequencing zoals beschreven in verschillende modellen8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. resultaten van FAIRE-seq en andere methoden zoals ATAC-seq14grotendeels overlappen. De FAIRE-methode is een zeer robuust, goedkoop en gemakkelijk uit te voeren methode om te identificeren nucleosoom-vrije regio's. In tegenstelling tot andere methoden, het vereist geen proefprojecten om te bepalen van het passende niveau van de spijsvertering als vereist voor nucleasen (DNase-seq, MNase-seq) of transposases (ATAC-seq) en besproken in detail in een recente review15. De enige parameters aan te passen zijn de ultrasoonapparaat voorwaarden en in sommige gevallen de fixatie-tijd. Dit witboek beschrijft een eenvoudige protocol die is schematisch weergegeven in Figuur 1 en dat hoeft geen speciale apparatuur dan een ultrasoonapparaat. Het protocol kan worden uitgevoerd in een redelijk korte tijd en FAIRE maakt een gemakkelijke en betrouwbare methode voor het testen van chromatine toegankelijkheid in een aantal verschillende soorten cellen variërend van longkanker cellen11 tot primaire cellen verkregen muis levers16.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. dag 1: De cultuur van de cel

  1. Cultuur van de cellen die moeten worden geanalyseerd om de gewenste hoeveelheid. Cel kweekomstandigheden en media zijn afhankelijk van de celtypes onderzochte.
    Opmerking: In principe een eukaryote cel is vatbaar voor een analyse van de chromatine toegankelijkheid door FAIRE. Voor dit experiment, 4 x 106 HEK-293T cellen worden overgeënt in een enkele 10 cm schotel in DMEM medium aangevuld met 10% (v/v) FBS en 1% (m/v) penicilline/streptomycine, en bij 5% CO2 en 37 ° C gedurende 24 uur de cellen tot 70-80% samenvloeiing geïncubeerd (~ 8 x 10 6 cellen per schotel).

2. dag 2: Formaldehyde Crosslinking en cel oogsten

Let op: Formaldehyde is zeer giftig en moet altijd worden gebruikt onder een zuurkast. Draag beschermende kleding (handschoenen en laboratoriumjas). Gooi het afval op de juiste manier.

  1. Formaldehyde rechtstreeks toevoegen aan het kweekmedium cel in een zuurkast te bereiken een eindconcentratie van 1% (v/v) (270 µL van 37% (v/v) formaldehyde tot 10 mL van de cel kweekmedium). Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (20-25 ° C) en doodde de platen handmatig elke 2 min.
    Opmerking: Het crosslinking tijd kan worden aangepast volgens het celtype. Voor de meerderheid van cellijnen is 10 min van crosslinking voldoende. Voor weefsels, zou langere incubations moeten toestaan dat de vastlegging van alle cellen.
  2. Glycine toevoegen om een eindconcentratie van 0,125 M om quench de formaldehyde (Voeg 500 µL van een 2,5 M glycine voorraad aan 10 mL gestolde voedingsbodem). Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en doodde elke 2 min.
  3. Wassen van de cellen 3 x met ijs koud PBS (8 g/L NaCl, KCl, 1,44 g/L Na2HPO4 · 2 H2O, 0,24 g/L KH2PO4, 0,2 g/L pas pH aan met de HCl of NaOH 7.4). Gecombineerd het medium en wassen rechtstreeks in de cel cultuur schotel of kolf door 10 mL PBS toe te voegen. Herhaal deze stap tweemaal wordt heel voorzichtig zijn in het geval van losjes Adherente cellen zoals HEK-293T. Voeg PBS zorgvuldig naar de kant van de schotel teneinde detachement van de cellen.
  4. Na de derde wash, resuspendeer de cel in 1 mL ijs koud PBS en transfer naar een 1,5 mL reactiebuis op ijs. Gebruik een cel schraper loskoppelen van de cellen wanneer dat nodig is.
    Opmerking: Bij het starten met een beperkte materiaal, gebruik lage DNA-bindende buizen monster om verlies te vermijden tijdens de procedure.
  5. Centrifugeer gedurende 5 min bij 300 x g bij 4 ° C in een gekoelde tafelblad centrifuge. Verwijder het supernatant door zorgvuldig aspirating het.

3. cel Lysis en versnippering van de chromatine

  1. Resuspendeer de cel pellet in 1 mL lysisbuffermengsel FAIRE (1% (m/v), 10 mM EDTA, 50 mM Tris HCl pH 8.1, 10 µg/mL leupeptin, 10 µg/mL aprotinin, 2 mM PMSF) en resuspendeer de cellen door zorgvuldig pipetteren op en neer meerdere malen. Incubeer gedurende 20 min op ijs. Bewaar de monsters bij-80 ° C bij deze stap indien nodig.
  2. Bewerk ultrasone trillingen ten de kruisverwijzende DNA wilt schuintrekken het aan een gemiddelde grootte van 200-300 bp. De specifieke instellingen van de ultrasoonapparaat moeten worden bepaald voor elke bron van monsters en het apparaat gebruikte ultrasoonapparaat. In ieder geval zorgen dat het DNA efficiënt is schuingetrokken. Een optimalisatie stap voor DNA schuintrekken is beschreven bij stap 5.14. Koel de monsters op ijs tijdens ultrasoonapparaat om te voorkomen dat de verwarming van het monster.
  3. Centrifugeer het monster voor de 15 min en 13.000 x g bij 4 ° C.
  4. Het supernatant overbrengen in een nieuwe reactiebuis. De monsters in 100 µL aliquots verdelen. Bewaar de monsters bij-80 ° C, indien nodig.
    Opmerking: Het protocol kan worden onderbroken op dit punt.

4. de-crosslinking van besturingselement DNA

  1. Neem een 100 µL aliquoot uit stap 3.4 om te keren de dwarslijn en moet worden gebruikt als een verwijzing voor totale DNA. Voeg 10 µL van RNase-A (10 mg/mL) en incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C.
  2. Voeg 10 µL van proteïnase K (20 mg/mL). Gebruik een programmeerbare thermo-blok om te broeden voor 4 uur bij 37 ° C en vervolgens voor 6 h bij 65 ° C tot het klieven van de eiwitten en om te keren de crosslinks. Ten slotte, houd de monsters bij 4 ° C, totdat het protocol wordt hervat en gaat u verder met stap 5.
    Opmerking: Andere FAIRE protocollen gebruik chromatine monsters uit cellen die niet kruisverwijzende als referentie hebben, dus de afschaffing van de noodzaak voor de-crosslinking11. Het feit dat deze monsters zijn niet kruisverwijzende kan leiden tot verschillen in de efficiëntie ultrasoonapparaat of DNA stabiliteit, daarom is het gebruik van totale DNA-referentiemonsters die hebben ondergaan dezelfde procedure als de analysemonsters nauwkeuriger.

5. dag 3: Fenol: Chloroform zuivering van DNA

  1. Neem het niet-de-kruisverwijzende aliquoot uit stap 3.4. Voeg 10 µL van RNase-A (10 mg/mL) en incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C.
  2. Neem de niet-de-kruisverwijzende aliquoot formulier stap 5.1 en de de-kruisverwijzende monster uit stap 4.2 en gaan in parallel. H2O om te bereiken een eindvolume van 300 µL toevoegen.
  3. Voeg 300 µL van fenol: chloroform: Isoamylalcohol (25:24:1) in een zuurkast en vortex krachtig.
    Let op: Fenol is bijtende en giftige en moet altijd worden gebruikt onder een zuurkast. Draag beschermende kleding (handschoenen en laboratoriumjas), zorg ervoor dat de reactie buizen zijn gesloten, en het afval op de juiste wijze te vervreemden.
  4. Centrifugeer gedurende 10 min bij 13.000 x g bij 4 ° C.
  5. Zorgvuldig overbrengen 280 µL van de bovenste waterfase een nieuwe reactiebuis. Zorg ervoor dat niet alle puin van de interfase die ook eiwitten bevat nemen. Gooi de resterende lagere fase als organisch oplosmiddel afval.
  6. Herhaal stap 5.3 naar 5.5 en 270 µL van de bovenste waterfase zorgvuldig overbrengen in een nieuwe reactiebuis.
  7. Voeg 270 µL van chloroform in een zuurkast en vortex krachtig.
    Opmerking: Deze stap wordt gebruikt voor het elimineren van alle resterende fenol uit het monster.
  8. Centrifugeer gedurende 10 min bij 13.000 x g bij 4 ° C.
  9. Zorgvuldig overbrengen 250 µL van de bovenste waterfase een nieuwe reactiebuis, niet om te dragen alle puin van de interfase verzorgen. Gooi het resterende monster als organisch oplosmiddel afval.
  10. Voeg 25 µL van 5 M NaCl en 250 µL van isopropanol. Voeg 5 µL van glycogeen (20 mg/mL) als de drager van het DNA. Meng goed door het omkeren van de buizen en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer gedurende 10 min bij 13.000 x g bij 4 ° C te precipiteren van het DNA.
  11. Wassen van de DNA-pellet met 400 µL ethanol 70% (v/v). Centrifugeer gedurende 10 min bij 13.000 x g bij 4 ° C.
  12. Het supernatant zorgvuldig gecombineerd en laat de pellet gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur drogen. Resuspendeer in 100 µL TE buffer (10 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA).
  13. Incubeer de niet-de-kruisverwijzende gratis DNA-monster gedurende 4 uur bij 65 ° C tot het verwijderen van crosslinks tussen DNA. Opslaan van de monsters bij-20 ° C.
  14. Kwantificeren van de hoeveelheid DNA met een spectrofotometer en uitvoeren van een aliquoot deel om te controleren van de grootte van het fragment op een agarose gel van 2% (g/v). Aanpassen van de shearing tijd en intensiteiten, afhankelijk van de resultaten van de analyse van de grootte van het DNA door agarose gel electroforese, om het verkrijgen van een gemiddelde grootte van 200-300 bp.

6. bepaling van gratis Versus totale DNA door kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR)

  1. De verhouding van nucleosoom-gratis DNA (in de volgende gratis DNA hierna) versus totaal DNA wordt bepaald door qRT-PCR17,18. Monsters kunnen ook kwantitatief worden geanalyseerd door de microarray kruising of diepe volgorde van genoom-brede bepalingen.
  2. Ontwerp qPCR inleidingen voor de regio's worden getest en voor positieve en negatieve controles.
    Opmerking: Geschikt positieve controles zijn gelegen in de promotor van actief getranscribeerde huishouding genen zoals ACTB, GAPDH, TPI1 of TUBA1A van de inleidingen (codering β-actine, GAPDH, TPI of α-tubuline). Passende negatieve controles worden aangetroffen in de heterochromatin regio's of gene woestijnen. Andere geschikte negatieve controles kunnen worden ontworpen in genomic gebieden grenzend aan de dynamisch gereglementeerde locus onderzochte aan besturingselement voor lokale kopie nummer verschillen (tabel 1).
  3. Verdun de DNA-monsters om een eindconcentratie van 10 ng/µL met TE buffer en de verdunningsfactor rekening houden met de voor de definitieve berekeningen (zie stap 6.5).
  4. Instellen van een reactie van de qPCR in triplicates in een 96-wells-plaat, met de volgende reactie mix per putje: sjabloon DNA: 20 ng (2 µL), voorwaartse primer 200 nM (0.4 µL van een voorraad 5 µM), omgekeerde primer 200 nM (0.4 µL van een voorraad 5 µM) , een commerciële gebruiksklare reactie mix met groene kleurstof (5 µL van een voorraad 2 x), en H2O 10 µL.
  5. Lopen in een real-time qPCR apparaat, met behulp van de modus absolute kwantificering en bepalen de Ct van de monsters met de verschillende primerparen. De verhouding van terugwinning van gratis DNA aan DNA van de totale voor elke primer met de volgende formule, rekening houdend met de verdunningsfactoren uit stap 6.3 berekenen:
    figure-protocol-1
    Representatieve resultaten en de berekening van een voorbeeld zijn gegeven in tabel 2.
  6. Normaliseren ter compensatie van verschillen tussen monsters, de positieve controle herstel verhouding:
    figure-protocol-2

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We hebben de FAIRE methode gebruikt voor het meten van verschillen in de toegankelijkheid van de chromatine van MHC klasse II genen in HEK293T cellen als gepubliceerde19. MHC klasse II coderen genen worden uitgedrukt in antigeen presentatie van cellen (APCs), hetzij constitutively of naar aanleiding van cytokine signalering van20. De expressie van genen die MHCII wordt gedreven door een activator complex dat aan specifieke DNA-elementen bindt, aangeduid als XY-dozen, gelegen in de promotor en versterkers van deze genen21,22. Dit wordt weerspiegeld op het niveau van de chromatine, zoals geopenbaard door onze FAIRE analyse van geselecteerde gebieden in de MHC klasse II genen HLA-DPB1 en HLA-DMA. Deze experimenten is gebleken dat chromatine open op de regio's omvat van de vakken XY terwijl het compacter in de gene organen (Figuur 2 is).

Als voorbeeld voor de berekeningen in dit bijzonder experiment, wij de totale verdunde DNA-monster 10 keer (verdunningsfactor 10), en de gratis DNA-monster was niet verdund (verdunningsfactor 1) voor de qRT-PCR. De Cts verkregen voor de verschillende regio's getest en de berekeningen te verkrijgen van de definitieve nuttige toepassing ratio's en relatieve herstel ratio's staan in tabel 2. Deze relatieve herstel verhoudingen werden verkregen met behulp van de ACTB-promotor als positieve controle. Merk op dat deze berekeningen voor een van de duplo's gebruikt zijn voor het genereren van de resultaten die worden weergegeven in Figuur 2.

In een andere context, werd chromatine toegankelijkheid getest in een model voor afleidbare genexpressie. In dit geval, werden snelle veranderingen van chromatine verdichting in reactie op de pro-inflammatoire stimulans tumor necrose factor (TNF) gemeten. HeLa cellen werden verlaten onbehandeld of gestimuleerd met TNF gedurende 1 uur, gevolgd door FAIRE voor het meten van de chromatine compressie op de promotor regio controlerende uitdrukking van het gen codering van de TNF-responsieve cytokine Interleukine 8 (IL8). Deze resultaten toonde een sterk gestegen chromatine toegankelijkheid op de promotor van de IL8 van TNF-gestimuleerd cellen (Figuur 3). De toegankelijkheid op de promotor van IL-8 na TNF stimulatie is zelfs hoger dan die in de promotor van de ACTB toont een dramatische chromatine remodeling in dit regelgevend gebied gevonden. Als de verhouding van de nuttige toepassing verkregen in dit geval hoger is dan dat verkregen in de regio gebruikt als positieve controle (ACTB promotor is) is de relatieve herstel ratio hoger dan een.

figure-results-1
Figuur 1: de FAIRE werkstroom. Cellen zijn kruisverwijzende rechtstreeks in de kolf van de cultuur van de cel of de schotel door toevoeging van formaldehyde (A). Na het blussen van de formaldehyde, zijn de cellen drie keer gewassen met ijs koud PBS (B), en overgedragen aan een reactiebuis waar ze zijn geresuspendeerde in FAIRE lysis-buffermengsel en sonicated als u wilt schuintrekken van het DNA (C). Een aliquoot gedeelte van het uitgepakte chromatine is de-kruisverwijzende door verhitting bij 65 ° C, om de totale DNA verwijzing (D), en daarna de gratis DNA wordt geëxtraheerd met behulp van fenol: chloroform zowel uit de kruisverwijzende en de de-kruisverwijzende aliquots (E). Tot slot, het DNA wordt gekwantificeerd, en de verhouding tussen vrije vs. totaal die DNA is berekend (F). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-2
Figuur 2: bepaling van de chromatine toegankelijkheid in de MHC klasse II gene cluster in HEK293T cellen. HEK293T cellen werden geanalyseerd door FAIRE. De verhouding tussen vrije versus totale DNA (dwz., de verhouding tussen de relatieve herstel) werd bepaald voor de promotor van het ACTB gen als een positieve controle, een heterochromatin gebied op Chr. 12 als negatieve controle, en de regelgevende gebieden en gene organen van de MHC klasse II genen HLA-DMA en HLA-DPB1. Het bovenste gedeelte ziet u een schematische weergave van de locus en de posities van de inleidingen. Foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviaties uit twee biologische replicatieonderzoeken gemeten in triplicates. De figuur is van een gepubliceerd verslag19bewerkt. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-3
Figuur 3: veranderingen in DNA toegankelijkheid op de promotor van de IL8 in reactie op TNF behandeling. HeLa cellen werden gestimuleerd met TNF (20 ng/mL) voor 1 h en geanalyseerd door FAIRE. De verhouding tussen gratis versus totaal DNA werd bepaald voor de promotor van ACTB (positieve controle), een heterochromatin gebied op Chr. 12 (negatieve controle) en de promotor van de IL8. Foutbalken vertegenwoordigen standaardfouten van de gemiddelde (SEM) uit drie biologische replicatieonderzoeken gemeten in duplicaten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-4
Figuur 4: optimalisatie van de voorwaarden ultrasoonapparaat. Chromatine geëxtraheerd uit cellen van de 293T was sonified met behulp van een gerichte ultrasoonapparaat met passende buizen (Tabel van materialen). De chromatine was sonicated voor de aangegeven tijd met meerdere kopieën van 30 s met de volgende instellingen: piekvermogen 150, plicht factor 15, cycli per burst 500, gevolgd door 30 s: piekvermogen 2.5, plicht factor 15, cycli per burst 500. De resulterende chromatine was de-kruisverwijzende, gezuiverd door fenol: chloroform extractie en geladen in een 2% agarose gel. Een-ethidiumbromide gekleurd gel is weergegeven, en worden de posities van het molecuulgewicht markers in bp. In dit experiment, was de optimale chromatine grootte (200-300 bp) behaalde na 20 min van ultrasoonapparaat. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

PrimerVolgorde
ACTB-promotor-FAAAGGCAACTTTCGGAACGG
ACTB-promotor-RTTCCTCAATCTCGCTCTCGC
Chr. 12 negatieve control + FATGGTTGCCACTGGGGATCT
Chr. 12 negatieve controle-RTGCCAAAGCCTAGGGGAAGA
HLA-DMA-XY-vak-FCATCAGTCACTGGGGAGACG
HLA-DMA-XY-vak-RGCTTCCCAGCCCAGTTACAT
HLA-DMA-5'-FGGAGAGAACAATCTCCGCTTCA
HLA-DMA-5'-RAGCTGCTATGTGTGGTTGGT
HLA-DMA-3'-FTGGGGACCTAGTTAGGGAGC
HLA-DMA-3'-RAGATCCATGGGAGGAGGCTT
HLA-DPB1-XY-vak-FGTCCAATCCCAGGGTCACAG
HLA-DPB1-XY-vak-RTGAAAAGAGCTGCAGTCAGGA
HLA-DPB1-5'-FGCGTGTTCATGTCTGCATCC
HLA-DPB1-5'-RTGATCCTCAGAGCCTGGACA
HLA-DPB1-3'-FCCAGCCTAGGGTGAATGTTT
HLA-DPB1-3'-RGCCTGGGTAGAAATCCGTCA
IL8 Promotor-FGTGATGACTCAGGTTTGCCCT
IL8 Promotor-RCTTATGGAGTGCTCCGGTGG

Tabel 1: Inleidingen voor de qPCR.

figure-results-5
Tabel 2: voorbeeld berekeningen van FAIRE relatieve herstel verhoudingen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FAIRE is een robuuste en goedkope methode waardoor de identificatie van nucleosoom-vrije regio's. Het is gebaseerd op het beginsel dat DNA nucleosomes gewikkeld kruisverwijzende aan de histonen gemakkelijk kan zijn. De extractie van een fenol: chloroform wordt gebruikt voor het scheiden van de niet-kruisverwijzende en de fragmenten van DNA eiwit-vrij van het eiwit-gebonden DNA, die is gevonden in de lagere fenol-fase en tot op zekere hoogte in de interfase (Figuur 1). Daarom zijn de nucleosoom-vrije gebieden oververtegenwoordigd in de Fractie van gratis DNA in de waterige fase. Een aantal publicaties beschrijven gedetailleerde protocollen van de FAIRE methode23,24,25,26, die als aanvulling op de hier beschreven procedure kan worden geraadpleegd.

Gelijkaardig aan andere methoden gebruikt om te bepalen van de structuur van de chromatine, de FAIRE methode ook kritisch afhankelijk optimale afknippen van het DNA. Als de fragmenten te lang zijn, zal elke nucleosoom-gebied worden gemaskeerd door de aangrenzende chromatine-gebonden DNA. Als de fragmenten te klein zijn, wordt de detectie door qPCR of diepe sequencing zeer moeilijk. Om deze reden, het ultrasoonapparaat van DNA is een cruciale parameter die moet worden gecontroleerd en geoptimaliseerd om het verkrijgen van fragmenten rond 200-300 bp lengte, die 1-2 nucleosomes (Figuur 4).

Een andere parameter die kan invloed hebben op het uiteindelijke resultaat is het crosslinking van het monster. Hoewel de hier beschreven fixatie-procedure voor de meeste cellijnen geldt, de onderzoeker zorgvuldig moet beoordelen deze stap voor de bijzondere steekproef in onderzoek, met name bij het gebruik van weefsels, waar langere fixatie tijden wellicht nodig zijn om de formaldehyde te bereiken van de cellen in het weefsel van alle monster.

In tegenstelling tot andere methoden, zoals DNase I of micrococcal nuclease overgevoeligheid, ChIP, of ATAC, FAIRE niet afhankelijk is van een enzymatische activiteit of specifieke antilichamen, en daarom hoeft niet titratie of optimalisatie van de omstandigheden. Dit maakt FAIRE een ideale methode voor het meten van de chromatine toegankelijkheid voor labs met weinig ervaring op het gebied van de chromatine. Daarnaast proefprojecten bent alleen nodig om de shearing stap van DNA en het crosslinking tijd, te optimaliseren wanneer dat nodig is.

De methode werd oorspronkelijk ontwikkeld in gist6, maar het is ook uitgebreid tot zoogdiercellen. Het DNA met de FAIRE methode gezuiverd kan worden gebruikt voor diepe sequencing, waardoor de genoom-brede karakterisering van de chromatine-status. Dit heeft al bewezen nuttig in een aantal studies8,9,10,11,12,13,19,27, 28.

Resultaten van FAIRE-seq experimenten tonen een grote overlap met resultaten van andere methoden zoals DNase-seq14, hoewel sommige verschillen ontstaan. Dit is te wijten aan methodologische verschillen zoals bijvoorbeeld relaxed of gerenoveerd nucleosomes kunnen nog steeds een belemmering vormen voor het splijten door DNase ik, terwijl deze DNA regio's zou minder vatbaar voor het produceren van de DNA/proteïne crosslinks en dus zou worden bepaald als nucleosoom-vrij regio's met FAIRE9. Ook de aanwezigheid van niet-Histon eiwitten zoals RNA-polymerase of lezer eiwitten voor epigenetische merken kan ertoe leiden dat DNA/proteïne crosslinks en dus zou worden opgevat als regio's eiwit-verpakt in FAIRE experimenten. Deze beperkingen zijn die inherent zijn aan elke methode die wordt gebruikt voor de bepaling van de chromatine staat, dus de noodzaak om het gebruik van een combinatie van verschillende methoden te verkrijgen een volledig inzicht te verhogen.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs bedank Tilman Borggrefe (Universiteit van Giessen) voor het vriendelijk delen het ultrasoonapparaat apparaat. Het werk van M.L.S. wordt ondersteund door subsidies van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (1417/8-3 van de SCHM), SFB/TRR81, SFB1021, SFB1213, de Excellence cardiopulmonale clustersysteem (ECCPS, UITM 147/2), de Deutsche Krebshilfe (111447) en het IMPRS-HLR-programma van de Max-Planck-Gesellschaft.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol 25:24:1Carl RothA156.1
Glycogen, 20 mg/mlThermo FisherR0561
ABsolute QPCR Mix, SYBR-Green, RoxThermo FisherAB1162B
Proteinase K, 20 mg/mlThermo FisherEO0491
RNase A, 10 mg/mlThermo FisherEN0531
LeupeptinSigmaL8511
AprotininSigmaA1603
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)Sigma78830
milliTUBE 1 ml AFA FiberCovaris520130
Holder milliTUBE 1mlCovaris500371
Covaris S220 Focused-ultrasonicatorCovaris
StepOnePlus Real-Time PCR SystemApplied Biosistems4376600

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Determinants of nucleosome positioning. Nat. Struct. Mol. Biol. 20 (3), 267-273 (2013).">Struhl, K., Segal, E. Determinants of nucleosome positioning. Nat. Struct. Mol. Biol. 20 (3), 267-273 (2013).
  2. Modification of enhancer chromatin: what, how, and why? Mol. Cell. 49 (5), 825-837 (2013).">Calo, E., Wysocka, J. Modification of enhancer chromatin: what, how, and why? Mol. Cell. 49 (5), 825-837 (2013).
  3. The 5' ends of Drosophila heat shock genes in chromatin are hypersensitive to DNase I. Nature. 286 (5776), 854-860 (1980).">Wu, C. The 5' ends of Drosophila heat shock genes in chromatin are hypersensitive to DNase I. Nature. 286 (5776), 854-860 (1980).
  4. Genome-scale identification of nucleosome positions in S. cerevisiae. Science. 309 (5734), 626-630 (2005).">Yuan, G. C., et al. Genome-scale identification of nucleosome positions in S. cerevisiae. Science. 309 (5734), 626-630 (2005).
  5. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nat. Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).">Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nat. Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
  6. Genomewide demarcation of RNA polymerase II transcription units revealed by physical fractionation of chromatin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100 (11), 6364-6369 (2003).">Nagy, P. L., Cleary, M. L., Brown, P. O., Lieb, J. D. Genomewide demarcation of RNA polymerase II transcription units revealed by physical fractionation of chromatin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100 (11), 6364-6369 (2003).
  7. Formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. , (2009).">Nagy, P. L., Price, D. H. Formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. , (2009).
  8. CpG domains downstream of TSSs promote high levels of gene expression. Nucleic Acids Res. , 1-14 (2014).">Krinner, S., et al. CpG domains downstream of TSSs promote high levels of gene expression. Nucleic Acids Res. , 1-14 (2014).
  9. Widespread Chromatin Accessibility at Repetitive Elements Links Stem Cells with Human Cancer. Cell Rep. 17 (6), 1607-1620 (2016).">Gomez, N. C., et al. Widespread Chromatin Accessibility at Repetitive Elements Links Stem Cells with Human Cancer. Cell Rep. 17 (6), 1607-1620 (2016).
  10. A map of open chromatin in human pancreatic islets. Nat. Genet. 42 (3), 255-259 (2010).">Gaulton, K. J., et al. A map of open chromatin in human pancreatic islets. Nat. Genet. 42 (3), 255-259 (2010).
  11. FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin. Genome Res. 17 (6), 877-885 (2007).">Giresi, P. G., Kim, J., McDaniell, R. M., Iyer, V. R., Lieb, J. D. FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin. Genome Res. 17 (6), 877-885 (2007).
  12. FOXA1 is a key determinant of estrogen receptor function and endocrine response. Nat. Genet. 43 (1), 27-33 (2011).">Hurtado, A., Holmes, K. A., Ross-Innes, C. S., Schmidt, D., Carroll, J. S. FOXA1 is a key determinant of estrogen receptor function and endocrine response. Nat. Genet. 43 (1), 27-33 (2011).
  13. Systematic protein location mapping reveals five principal chromatin types in Drosophila cells. Cell. 143 (2), 212-224 (2010).">Filion, G. J., et al. Systematic protein location mapping reveals five principal chromatin types in Drosophila cells. Cell. 143 (2), 212-224 (2010).
  14. Discovery of transcription factors and regulatory regions driving in vivo tumor development by ATAC-seq and FAIRE-seq open chromatin profiling. PLoS Genet. 11 (2), e1004994(2015).">Davie, K., et al. Discovery of transcription factors and regulatory regions driving in vivo tumor development by ATAC-seq and FAIRE-seq open chromatin profiling. PLoS Genet. 11 (2), e1004994(2015).
  15. Identifying and mitigating bias in next-generation sequencing methods for chromatin biology. Nat. Rev. Genet. 15 (11), 709-721 (2014).">Meyer, C. A., Liu, X. S. Identifying and mitigating bias in next-generation sequencing methods for chromatin biology. Nat. Rev. Genet. 15 (11), 709-721 (2014).
  16. Chromatin variation associated with liver metabolism is mediated by transposable elements. Epigenetics Chromatin. 9 (1), 28(2016).">Du, J., et al. Chromatin variation associated with liver metabolism is mediated by transposable elements. Epigenetics Chromatin. 9 (1), 28(2016).
  17. Real-Time PCR: Advanced Technologies and Applications. Crop Sci. 54 (1), 455(2014).">Skinner, D. Z. Real-Time PCR: Advanced Technologies and Applications. Crop Sci. 54 (1), 455(2014).
  18. Good Practice Guide for the Application of Quantitative PCR (qPCR). Natl. Meas. Syst. , 50(2013).">Nolan, T., Huggett, J., Sanchez, E. Good Practice Guide for the Application of Quantitative PCR (qPCR). Natl. Meas. Syst. , 50(2013).
  19. The CCR4-NOT complex contributes to repression of Major Histocompatibility Complex class II transcription. Sci. Rep. 7 (1), 3547(2017).">Rodríguez-Gil, A., et al. The CCR4-NOT complex contributes to repression of Major Histocompatibility Complex class II transcription. Sci. Rep. 7 (1), 3547(2017).
  20. Regulation of MHC class II expression by interferon-gamma mediated by the transactivator gene CIITA. Science. 265 (5168), 106-109 (1994).">Steimle, V., Siegrist, C. A., Mottet, A., Lisowska-Grospierre, B., Mach, B. Regulation of MHC class II expression by interferon-gamma mediated by the transactivator gene CIITA. Science. 265 (5168), 106-109 (1994).
  21. Regulation of major histocompatibility complex class II genes. Curr. Opin. Immunol. 23 (1), 81-87 (2011).">Choi, N. M., Majumder, P., Boss, J. M. Regulation of major histocompatibility complex class II genes. Curr. Opin. Immunol. 23 (1), 81-87 (2011).
  22. Genetic control of MHC class II expression. Cell. 109 Suppl, S21-S33 (2002).">Ting, J. P. -Y., Trowsdale, J. Genetic control of MHC class II expression. Cell. 109 Suppl, S21-S33 (2002).
  23. Mapping open chromatin with formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements. Methods Mol. Biol. 791, 287-296 (2011).">Nammo, T., Rodríguez-Seguí, S. A., Ferrer, J. Mapping open chromatin with formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements. Methods Mol. Biol. 791, 287-296 (2011).
  24. Using formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE) to isolate active regulatory DNA. Nat. Protoc. 7 (2), 256-267 (2012).">Simon, J. M., Giresi, P. G., Davis, I. J., Lieb, J. D. Using formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE) to isolate active regulatory DNA. Nat. Protoc. 7 (2), 256-267 (2012).
  25. A detailed protocol for formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE). Curr. Protoc. Mol. Biol. , Chapter 21, Unit21.26 (2013).">Simon, J. M., Giresi, P. G., Davis, I. J., Lieb, J. D. A detailed protocol for formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE). Curr. Protoc. Mol. Biol. , Chapter 21, Unit21.26 (2013).
  26. Isolation of active regulatory elements from eukaryotic chromatin using FAIRE (Formaldehyde Assisted Isolation of Regulatory Elements). Methods. 48 (3), 233-239 (2009).">Giresi, P. G., Lieb, J. D. Isolation of active regulatory elements from eukaryotic chromatin using FAIRE (Formaldehyde Assisted Isolation of Regulatory Elements). Methods. 48 (3), 233-239 (2009).
  27. Prediction of Chromatin Accessibility in Gene-Regulatory Regions from Transcriptomics Data. Sci. Rep. 7 (1), 4660(2017).">Jung, S., Angarica, V. E., Andrade-Navarro, M. A., Buckley, N. J., Del Sol, A. Prediction of Chromatin Accessibility in Gene-Regulatory Regions from Transcriptomics Data. Sci. Rep. 7 (1), 4660(2017).
  28. Accurate inference of transcription factor binding from DNA sequence and chromatin accessibility data. Genome Res. 21 (3), 447-455 (2011).">Pique-Regi, R., et al. Accurate inference of transcription factor binding from DNA sequence and chromatin accessibility data. Genome Res. 21 (3), 447-455 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Chromatin AccessibilityFAIRE AssayFormaldehyde CrosslinkingDNA FragmentationPhenol Chloroform ExtractionQuantitative PCRDNA SequencingSonication ProtocolCell LysisGel Electrophoresis

Related Articles