Een methode om te studeren het C924T polymorfisme van het Thromboxaan A2-Receptor gen

Summary

In de huidige studie, beschrijven we een methodologie voor het analyseren van het genotype van de C924T. Het protocol bestaat uit drie fasen: DNA-extractie, versterking van de Kettingreactie van de polymerase (PCR) en een analyse van de beperking fragment length polymorphism (RFLP) op agarose gel.

Abstract

Het Thromboxaan A2-receptor (TBXA2R) gen is een lid van het G-eiwit gekoppelde superfamilie met zeven-transmembraan regio's. Het is betrokken bij de atherogenese progressie, ischemie en myocardiaal infarct. Hier presenteren we een methode voor patiënt genotypering te onderzoeken van de post-transcriptional rol van de C924T polymorfisme (rs4523) gelegen op de 3'-regio van de TBXA2 receptor gen. Deze methode is gebaseerd op DNA-extractie van volbloed, polymerase kettingreactie (PCR) versterking van het TBXA2 gene gedeelte met de C924T mutatie, en de identificatie van wild type en/of mutant genotypen met behulp van een beperking digest analyse, specifiek een beperking fragment length polymorphism (RFLP) op agarose gel. Daarnaast werden de resultaten bevestigd door het TBXA2R gen sequencing. Deze methode beschikt over verschillende potentiële voordelen, zoals hoog rendement en de snelle identificatie van het polymorfisme van de C924T door PCR en restrictie-enzym-analyse. Deze benadering biedt een voorspellende studie voor de vorming van de plaque en atherosclerose progressie door het analyseren van de patiënt genotypen voor het polymorfisme van de TBXA2R C924T. Toepassing van deze methode heeft de potentie om de proefpersonen meer gevoelig zijn voor atherotrombotische processen, in bepaalde onderwerpen in een groep met een hoog risico, aspirine-behandeld.

Introduction

TBXA2R is een lid van het G-eiwit gekoppelde superfamilie met zeven-transmembraan regio's, die zijn grote schaal uitgedrukt en gelokaliseerd op de membranen van de cel of op de intracellulaire structuren^1,2. De TBXA2R signalering traject is betrokken bij geavanceerde atherosclerotische processen³. Verhoogde expressie van de TBXA2 receptor was aangetoond tijdens de atherogenese progressie en klinische en experimentele studies toonde haar relevante rol in ischemie en myocardiaal infarct⁴. C924T, een single nucleotide polymorphism (SNP) van het TBXA2R gen, werd erkend als een functionele polymorfisme bij gezonde vrijwilligers en is gekoppeld aan klinische aandoeningen⁵. Bovendien, onze vorige studie⁶ aangetoond dat het polymorfisme van de C924T van de TBXA2R-gen is betrokken bij transcript stabiliteit; in het bijzonder, is er een toenemende instabiliteit van de mutant (TT) type afschrift met betrekking tot de wild-type (CC). Bovendien veroorzaakte verschillende prikkels zoals adenosinedifosfaat (ADP), adrenaline en collageen in verschillende concentraties een aggregatie van de bloedplaatjes minder effectief voor het mutant type (TT). Dit komt overeen met een vorming van verminderde trombose en hemostase. Dus, de instabiliteit van het afschrift van de TBXA2R en de bijbehorende vermindering van de aggregatie van de bloedplaatjes kunnen gepaard gaan met een beschermende rol voor de TBXA2R TT-genotype tegen atherothrombosis en de complicaties in risicovolle aspirine-behandelde patiënten⁶ .

Hier beschrijven we een methodologie voor de patiënt genotypering te onderzoeken van de post-transcriptional rol van C924T polymorfisme (rs4523) gelegen op de 3'-regio van de TBXA2 receptor gen. Deze methode berust op de volgende stappen: (1) DNA-extractie van volbloed, (2) PCR versterking van het TBXA2R gene gedeelte met de C924T mutatie, en (3) de identificatie van wild type en/of mutant genotypen met beperking fragment lengte polymorfisme (RFLP) op agarose gel. RFLP is een techniek die gebruik maakt van de variaties in homologe DNA-sequenties⁷. Deze toepassing werd detecteren DNA-polymorfismen, vooral SNPs, te zoeken en koppelen van biologische relevantie in genetische variaties⁸gebruikt. Het polymorfisme geanalyseerd voor de eerste keer met behulp van de RFLP-PCR bij de mens was de ABO bloed⁹. De RFLP-PCR-methode kan de analyse van genetische mutaties in homologe DNA-sequenties te evalueren van de aanwezigheid van fragmenten van verschillende lengtes na de spijsvertering van DNA met zeer specifieke beperkingsendonucleases¹⁰.

In afgelopen jaren de volgende methoden hebben gebruikt voor SNP analyse met behulp van de PCR-techniek: kruising van korte allele-specifieke oligonucleotides¹¹, allele-specifieke PCR¹², primer extensie op DNA microarrays¹³, Oligonucleotide afbinding assay¹⁴, directe DNA sequencing voor identificerende positie-specifieke enig-nucleotidepolymorfisme¹⁵, Taqman methode¹⁶, extractie () Matrix-Assisted Laser desorptie/ionisatie Time-Of-Flight MALDI-TOF) massaspectrometrie¹⁷en¹⁸van de GeneChips. Deze technieken zijn niet eenvoudig te gebruiken en voorschrijven dure apparatuur. Omgekeerd, de PCR-RFLP-methode is goedkoop, handig en eenvoudig te gebruiken, heeft een hoog rendement en snelle identificatie van de C924T polymorfisme kunt. Bovendien, bevestigd we de resultaten door het TBXA2R-gen met behulp van de methode Sanger¹⁵sequencing.

Deze benadering biedt een voorspellende studie van plaque vorming en atherosclerose progressie door het analyseren van de patiënt genotypen voor het polymorfisme van de TBXA2R C924T. Deze methode kan de proefpersonen meer vatbaar voor atherotrombotische processen, met name degenen onder met een hoog risico, aspirine-behandelde patiënten.

Protocol

Het protocol volgt de richtsnoeren van de medische ethiek Commissie voor onderzoek van de Universiteit van Chieti.

1. reagens Setup

1. De Tris-EDTA (TE) buffer (pH 8.0) voor te bereiden. Voeg 200 µL van het EDTA 0.5 M en 1 mL Tris-Cl 1 M in een bekerglas en breng met steriel water tot 100 mL. De definitieve concentratie van TE buffer: 10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA. Bewaren bij kamertemperatuur (RT).
2. 1 L van de 10 x stockoplossing elektroforese buffer (FSME) voor te bereiden. Ontbinden 108 g voor Tris Base, 55 g boorzuur en 40 mL EDTA 0.5 M (pH 8) in een bekerglas en brengen hoeveelheid 1 L met steriel water. Winkel op RT.
3. De gel laden kleurstof voor te bereiden. Los 0,25 g bromophenol blauw, 0,25 g xyleen cyanol FF, 50 g glycerol, 1 mM van EDTA (pH 8) in 60 mL gedeïoniseerd of gedistilleerd water, en breng aan een volume van 100 mL met steriel water. Bewaren bij 4 ° C (voor een paar maanden) of bij-20 ° C (al jaren)
4. 200 mL 2% agarose gel voor te bereiden. Gebruik het vers of, subsidiair, slaan gestold op RT voor tot enkele weken.
   1. Los 4 g agarose in 200 mL voor 1 x TBE buffer in een bekerglas van 600 mL. Roer met een magnetische mixer voor ongeveer 5 minuten totdat de agarose is volledig geschorst.
   2. Verwarm de oplossing van de 2% agarose in kokend-water of op een hete plaat (voor ongeveer 10 minuten, totdat de agarose volledig is opgelost). Merk op dat het bekerglas af met de agarose gel moet worden afgedekt met aluminiumfolie. Als alternatief, Verwarm de ongedekte bekerglas in een magnetron op een hoge temperatuur voor ongeveer 3-5 min.
   3. Swirl de 2% agarose oplossing om met een magnetische mixer, controleren dat de agarose volledig is opgelost.
      Opmerking: Deeltjes van agarose verschijnen als doorschijnend korrels vóór volledige ontbinding. Het mogelijk moet opwarmen deeltjes gedurende enkele minuten (ongeveer 5 – 10 min).
   4. Als een opgeslagen gedeelte van het agarose gel wordt gebruikt Verwarm het bekerglas, bedekt met aluminiumfolie, in een bad met warm water (op ongeveer 60 ° C) tot de agarose wordt ontbonden. Verwijder met een pipet van Pasteur "sporen" van gestolde agarose van het oppervlak vóór gieten.

2. DNA zuivering

1. Voer de volgende handelingen uit voordat u begint de zuivering:
   1. Het gebruik van menselijke vers volledig bloedmonsters, of ontdooien van bevroren monsters snel (voor ongeveer 2-3 min) in een waterbad (bij 37 ° C) toe te passen van een milde agitatie volbloed en vervolgens equilibreer aan RT vóór gebruik.
   2. Meng verse of ontdooide bloedmonsters omkeren de buizen meerdere malen.
2. Start de procedure van de zuivering door het volgen van de leverancier protocollen voor 100 µL van het elutievolume.
3. Kwantificeren en berekenen de zuiverheid van DNA voor het meten van de absorptie bij 260, 280 en 320 nm.
   1. Steriel water verdunnen van de monsters en kalibreren van de spectrofotometer gebruiken
   2. Toepassing van de volgende formule om te berekenen van de concentratie van DNA-monster = 50 µg/mL x (een₂₆₀ − A₃₂₀) x verdunningsfactor, en de zuiverheid van DNA = (een₂₆₀ − A₃₂₀) / (een₂₈₀ − A₃₂₀), met een aanvaardbare verhouding tussen de 1,7 en 1,9.

3. de PCR versterking van DNA-monsters

1. Bereiden 25 µL van reactiemengsel in een 0,2 mL micro-amplificatie buis, zoals aangegeven in tabel 1.
2. Verrichten van een PCR-amplificatie van de gezuiverde DNA-monsters met behulp van een geautomatiseerde thermische cycler, na het programma van de versterking in tabel 2aangegeven.
3. Aan het einde van de PCR versterking, de PCR reacties te stoppen door het verlaten van de DNA-monsters bij 4 ° C.

4. RFLP van PCR producten

1. Bereiden 22.5 µL van meester-mix oplossing voor elk monster, zodat de geselecteerde restrictie-enzym de PCR producten, verteert zoals aangegeven in tabel 3.
2. 2.5 µL van het PCR product overbrengen in een nieuwe PCR-buis voor elk monster met behulp van een pipet en filter tips.
3. 22.5 µL van spijsvertering meester-mix oplossing aan de buizen met het PCR-product van elk monster, met behulp van een pipet en filter tips toevoegen.
4. Incubeer het reactiemengsel (master-mix oplossing en PCR product) bij 37 ° C gedurende 4 uur.

5. gel elektroforese analyse van PCR-RFLP monsters

1. Vlek het agarose gel door ethidiumbromide (EtBr) bij 0,5 µg/mL toe te voegen aan de gel gedurende 10 minuten EtBr bindt aan het DNA, die kan worden gevisualiseerd onder ultraviolet (UV) licht.
   Let op: Het is belangrijk om handschoenen en andere beschermende apparaten gebruiken tijdens de afhandeling, opslag en verwijdering van EtBr, omdat het een mutagene stof met potentiële carcinogeniteit.
2. Giet de bereid agarose gel in de lade van een gel met de goed kam op zijn plaats, en wachten tot het is gestold.
3. Plaats de gestolde agarose gel in het vak van de gel (elektroforese eenheid).
4. Vul het vak gel met 1 x TBE totdat de gel is gedekt.
5. Met een pipet en filter tips, 6 µL van het versterkte digest DNA (specifiek, belasting 5 µL van elk monster en 1 µL van gel laden kleurstof) in de putten van het agarose gel te laden. Een DNA grootte markering toevoegen in een afzonderlijke, goed en in parallel met de monsters.
6. Stel de gel voor 20-30 min. bij 100 V.
7. Met een UV-transilluminator, visualiseer de gekloofd DNA-fragmenten of de onverteerd PCR producten, fragmenten te vergelijken met de DNA grootte markering, en registreren van de resultaten door fotografie na instructies van de fabrikant.
   Let op: Gebruik beschermingsinrichtingen (veiligheidsbril of een gezichtsmasker) rond UV-lichtbronnen.

Results

Het doel van deze methode is om te evalueren van het Thromboxaan A2-receptor genotype ten aanzien van het polymorfisme van de C924T. Het menselijk TBXA2R-gen bevindt zich op 19p13.3 omvat 15 kbp en bestaat uit drie exons gescheiden door twee introns. Polymorfismen van de C924T van het TBXA2R gen (van 539 bp) werd versterkt met behulp van de PCR inleidingen afgebeeld in Figuur 1, die waren goed ontworpen om aan te vullen een specifieke DNA regio maar niet een orthologous of paralogous niet-specifieke regio. Daarnaast een RFLP-analyse met behulp van een RsaI restrictie-enzym (Figuur 1) op de PCR producten werd uitgevoerd en de resultaten waren gevisualiseerd op een agarose gel, teneinde de specifieke bestudeerde SNP karakteriseren.

Op basis van de aanwezigheid van verschillende fragment lengtes na spijsvertering van DNA, is het mogelijk om te discrimineren van een patiënt genotype voor de C924T polymorfisme. In feite, zoals in Figuur 2weergegeven, de homozygosity van de grote allel (CC) wordt weergegeven, twee bands (395 en 144 bp), omdat de restrictie-enzym precies het TBXA2R gen gedeelte op de site van C924T polymorfisme snijdt. De homozygosity van de kleine allel (TT) wordt aangetoond door een enkele band (539 bp), omdat het beperkingsenzym snijden doet zich niet voor. De heterozygoot (CT)-allel toont drie bands (539, 395 en 144 bp). Zoals blijkt uit Figuur 2, is de C924T polymorfisme, gedefinieerd door RsaI spijsvertering op PCR product, bevestigd door sequentieanalyse.

Component	Volume (µL)	Eindconcentratie
10 x PCR buffer-Tween-20 (15 M MgCl2)	0,25	1.5 MgCl2 mmol/L
dNTP mix (10 mM)	1	200 ΜM
Primer (voorwaarts) (10 pmol/µM)	1	0.4 ΜM/ΜL
Primer (omgekeerde) (10 pmol/µM)	1	0.4 ΜM/ΜL
Taq polymerase (5 U/µL)	0.2	1 U/ΜL
Proeven van DNA (42 ng/µL)	1	42 ng/µL
DNase-gratis-water	20.55
Totaal	25

Tabel 1: PCR versterking setup. Een 25 µL meester-mix reactiemengsel instellen in een tube van 0,2 mL PCR te versterken van een enkele DNA-monster.

Standaardpcr
Eerste stap in activeren	5 min		95 ° C
3-staps fietsen
Denaturatie	30 s		94 ° C
Gloeien	60 s		55 ° C
Uitbreiding	60 s		72 ° C
Aantal cycli		30 cycli
Laatste uitbreiding	8 min		72 ° C

Tabel 2: PCR versterking programma. Instellen van een geautomatiseerde thermische cycler om het uitvoeren van PCR en versterken van de sjabloon DNA. PCR reacties worden gestopt door koeling bij 4 ° C.

Component	Volume (µL) (n = 1)	Volume (µL) (n = 10) *
10 x enzym buffer	2.5	27,5
Restrictie-enzym (5 U/µL)	0,5	5.5
DNase-gratis-water	19,5	214.5
Totaal	22,5	247,5

Tabel 3: Restrictie-enzym vertering van PCR producten. Een master-mix-oplossing is bereid, zodat de geselecteerde restrictie-enzym de PCR producten verteert. *: Voor het instellen van een master-mix-oplossing voor 10 monsters, voeg 10% meer, ten slotte strop 11 monsters.

Figuur 1: PCR primers en restrictie-enzym RsaI. De voorwaartse en omgekeerde inleidingen ontworpen voor het versterken van het TBXA2R gene gedeelte van 539 bp met het polymorfisme van de C924T. RsaI is de restrictie-enzym geselecteerd om te herkennen van de GTAC sites. ˅: snijden site van RsaI enzym. C(/T): C924T polymorfisme. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2: elektroforetisch patroon en DNA-sequentie analyse. (A) de C924T genotype wordt herkend door de RFLP patroon na vertering met de specifieke RsaI-enzym. (B) DNA-sequentie analyse: de resultaten verkregen door RFLP na vertering met het enzym van de beperking van de RsaI waren bevestigd met sequentieanalyse tonen de C924T polymorfisme. Dit cijfer is gewijzigd van De Iuliis et al., prostaglandines & andere bemiddelaars van het lipide-⁶. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

In de huidige studie, hebben we een methodologie waarmee patiënten genotypering te onderzoeken van de post-transcriptional rol van C924T polymorfisme (rs4523) gelegen op de 3'-regio van de TBXA2R-gen beschreven. Eerst, is deze methode gebaseerd op DNA-extractie uit volbloed. Met name bestaat dit eerste proces uit een zuivering van totale menselijke DNA genomic en mitochondriale, vanuit volbloed monsters vers of bevroren, met EDTA (citraat of heparine) behandeld. Voor korte termijn opslag van geheel bloedmonsters, bewaren bij 2-8 ° C voor maximaal 10 dagen. Voor opslag over 10 dagen, slaan monsters op 70 ° C. De geautomatiseerde zuiveringsproces bestaat uit 4 stappen: lyse, binden, wassen en elueer. Ten tweede, de methode is gebaseerd op PCR versterking van het TBXA2R gene gedeelte met de C924T mutatie. Tot slot, de identificatie van de wild type en/of de mutant genotype met behulp van een restrictie-enzym-analyse (RFLP) op agarose gel wordt uitgevoerd.

Kritische stappen in het protocol zijn de volgende: (i) In het geval dat een gedeelte van het agarose gel opgeslagen op RT wordt gebruikt, de gestolde agarose kan opnieuw opgeloste op een kokend waterbad (bij 60 ° C gedurende ongeveer 15-20 min) of in de magnetron (3-5 min) vóór het gieten. Opmerking: draai het GLB wanneer opnieuw smelten agarose in een fles. (ii), bovendien, wanneer opnieuw verwarming agarose, verdamping zal veroorzaken een toename van de concentratie ervan. Om deze reden zou het nuttig zijn om te compenseren door een kleine hoeveelheid water toe te voegen. (iii) DNA-fragmenten van minder dan 1000 bp werden onderscheiden zich door agarose gel en FSME buffer wordt aanbevolen voor de best mogelijke scheiding. (iv) wij liever met een agarose gel in plaats van een polyacrylamide-gel, omdat de voorbereiding van de laatste moeilijker is, en het duurt veel langer om in te stellen. (v) de keuze van de looptijd van de Elektroforese van het gel, is afhankelijk van de verwachte omvang van de amplificatie producten. Op basis van dit protocol, is het voldoende voor het uitvoeren van een elektroforese voor 20-30 min. bij 100 V in de 2% agarose gel, aangezien de grootte van de PCR fragmenten varieert van 100-500 bp. (vi) het is verplicht om te verkrijgen van 10 tot 50 ng van een goede kwaliteit sjabloon DNA geëxtraheerd uit menselijke specimens . Om deze reden liever we met een geautomatiseerde DNA-zuivering in plaats van een semi-automatische of handmatige. (vii) voorbereiden de reactie van de meester-mix voor PCR versterking en de oplossing van de meester-mix voor PCR producten spijsvertering, 10% meer (ter verantwoording voor verlies van vloeistof tijdens pipetteren) toe te voegen aan het volume berekend vermenigvuldigd met het aantal monsters voor het volume vereist voor een DNA-monster.

De meest voorkomende valkuil van de methode is de aanwezigheid van extra versterking producten als gevolg van een onjuiste thermische cycler programma's, de voorbereiding van een onjuiste amplificatie meester-mix of een DNA sjabloon besmetting. Bovendien, het ontbreken van PCR producten kan worden veroorzaakt door geïnactiveerd Taq polymerase of een onjuiste thermische cycler uitvoeren. Bovendien, de aanwezigheid van onverwachte fragmenten mogelijk als gevolg van PCR product verontreiniging of aan een onvolledige spijsvertering van een geïnactiveerd enzym, te weinig bedrag van restrictie-enzym volume of een te korte incubatietijd.

In de afgelopen jaren, hebben de volgende methoden gebruikt voor SNP analyse met behulp van de PCR-techniek: kruising van korte allele-specifieke oligonucleotides¹¹, allele-specifieke PCR¹², primer extensie op DNA microarrays¹³ , oligonucleotide afbinding assay¹⁴, directe het rangschikken van DNA voor het identificeren van positie-specifieke enig-nucleotidepolymorfisme¹⁵, Taqman methode¹⁶, extractie Matrix-Assisted Laser desorptie/ionisatie Time-Of-Flight (MALDI-TOF) massaspectrometrie¹⁷, en GeneChips¹⁸. Deze methoden zijn niet ideaal omdat ze niet eenvoudig te gebruiken en/of dure apparatuur nodig. Omgekeerd, de methode van de PCR-RFLP beschreven in deze studie is goedkoop, eenvoudig te gebruiken, handig, heeft een hoog rendement en snelle identificatie van de C924T polymorfisme kunt. Een beperking aan de huidige methode is dat het alleen kan worden gebruikt voor een klein aantal SNPs en voor een paar monsters aan een werkvergadering.

Voor toekomstige toepassingen, kan deze methode worden gebruikt voor voorspellende studies over plaque vorming en atherosclerose progressie door het analyseren van de patiënt genotypen voor het polymorfisme van de TBXA2R C924T. Bovendien, deze methode konden de proefpersonen meer vatbaar voor atherotrombotische processen, in het bijzonder met een hoog risico patiënten behandeld met aspirine. Ten slotte, deze methode kan worden toegepast om te bestuderen van andere polymorfismen betrokken in gepersonaliseerde geneeskunde voor bepaalde geneesmiddelen (bijvoorbeeld anticoagulantia en anti-epileptica) om te begrijpen de juiste drug dosering en de farmacologische individu en klinische respons voor elke patiënt vóór het begin van de therapie en nadelige effecten te vermijden.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
QIAsymphony SP	QIAGEN	937055
Spectrofotometer	EPPENDORF	6131-02222
UV-transilluminator	UVP	732-110
PCR buisjes	EPPENDORF	H0030121589
PCR thermische cycler	EPPENDORF	5331-03721
Pipettors en filtertips	EPPENDORF	H4910000018/42/69 EN 0030067037/10/02
Horizontaal minigel elektroforese apparaat	DIATECH PHORESIS 10	RI002-10
Dry block verwarming	TWIN INCUBATOR	DG210
QIAsymphony DNA Midi Kit	QIAGEN	931255
10x PCR buffer (meestal geleverd door de fabrikant met de Taq polymerase)	DIATECH EN TAKARA	T0100 EN R0001DM
Taq polymerase	TAKARA	R0001DM
dNTP mengsel	DIATECH  farmacogenetica	NM001	dNTP MIX 10x 100 microliter, 10 mM
PCR primers	DIATECH  farmacogenetica	\\
Beperkingsenzym RsaI	New England biolabs	R0167L
Beperkingsenzym 10x buffer	New England biolabs	R0167L
Agarosegel	Sigma	A9539	DNA fragmenten worden het best gescheiden in TBE buffer
Tris base	Sigma	T6066
Boorzuur	Sigma	B7901
0.5 M EDTA, pH 8.0	Sigma	E7889
10% (wt/vol) ammoniumpersulfaat	Sigma	E3678	vers klaargemaakt elke keer
EtBr (0.5 μg/&/uL)	Sigma	E8751
Broomfenolblauw	Sigma	B0126
Xyleen cyanold FF	Sigma	X4126
Glycerol	Sigma	G5516
DNA grootte marker	DIATECH  farmacogenetica	R1002-10	Plasmiid pBluescript II SK (+) restrict MSPI
Steriele water (geautoclaveerd)	DIATECH  farmacogenetica	\\