Dit protocol laat de lezer om te analyseren bile salt-geïnduceerde biofilm vorming in de darmen ziekteverwekkers met behulp van een veelzijdige aanpak om vast te leggen van het dynamische karakter van het bacteriële biofilms door beoordeling van de naleving, extracellulaire stof van polymere matrix vorming, en dispersie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Bile Salt-geïnduceerde Biofilm vorming in de darmen pathogenen: technieken voor de identificatie en kwantificering
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Biofilm vorming is een dynamische, meertraps proces dat zich in bacteriën onder strenge milieu-omstandigheden of in tijden van stress voordoet. Voor zuurbestendige ziekteverwekkers, wordt een aanzienlijke stress-respons veroorzaakt gastro-intestinale onderweg en bij gal blootstelling, een normaal onderdeel van menselijke spijsvertering. Om te overwinnen de bactericide effecten van gal, vormen vele darmen ziekteverwekkers een biofilm hypothetische zodat overleven wanneer bij het transitovervoer door de dunne darm. Hier presenteren we methoden om te definiëren van biofilm vorming door naleving van de solid-phase assays evenals extracellulaire polymere stof (EPS) matrix detectie en visualisatie. Bovendien wordt biofilm dispersie beoordeling gepresenteerd waarmee de analyse van gebeurtenissen triggering release van bacteriën tijdens de infectie wordt nagebootst. Kristalviolet kleuring wordt gebruikt voor het detecteren van aanhangend bacteriën in een high-throughput 96-wells-plaat naleving assay. EPS-productie beoordeling wordt bepaald door twee tests, namelijk microscopie kleuring van de EPS-matrix en semi-kwantitatieve analyse met een polysaccharide fluorescently-geconjugeerde bindend lectine. Ten slotte wordt biofilm dispersie gemeten door middel van de graven van de kolonie en beplating. Positieve gegevens uit meerdere tests ondersteunen de karakterisatie van biofilms en kan worden gebruikt om het identificeren van biofilm bile salt-geïnduceerde vorming in andere bacteriestammen.
Inleiding
Biofilm formatie is een belangrijke bacteriële overlevingsstrategie geïnduceerde tijdens Barre milieu omstandigheden. Blootstelling aan bactericide verbindingen zoals antibiotica of veranderingen in voedingsstoffen of zuurstof beschikbaarheid induceert een gespannen staat in bacteriën die kan worden verlicht door vorming van biofilms. Een biofilm wordt gekenmerkt door bacteriële gehechtheid aan een oppervlak of andere bacteriën en wordt begeleid door de afscheiding van een matrix van de EPS-voornamelijk samengesteld uit polysacchariden1,2,3. Biofilm vorming is een dynamisch p....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. bereiding van reagentia
- Galzouten medium: resuspendeer ter voorbereiding al soja Bouillon (TSB) met 0,4% galzouten (gewicht/volume), 200 mg van galzouten in 50 mL gesteriliseerde met autoclaaf TSB. Filter steriliseren met behulp van een 0,22 µm filter. Maak wekelijks vers medium.
Opmerkingen: De galzouten routinematig gebruikt is een 1:1 mengsel van natrium cholate en natrium deoxycholate van schapen en runderen gallbladders geïsoleerd. Zoals aangetoond eerder4, was de aanwezigheid van glucose nodig voor bile salt-geïnduceerde biofilm vorming. TSB heeft toegevoegd glucose ten opzichte van Luria Bertani (LB) Bouillon; en daarom w....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
In Figuur 1, wordt biofilm vorming veroorzaakt in de meeste van de zes darmen ziekteverwekkers geteste volgende groei in media met galzouten. Een aanzienlijke toename van de aanhangend bacteriën nadat galzouten blootstelling wordt waargenomen in bijna alle stammen getest. De uitzondering is de enteroaggregative E. coli (EGA); nochtans, merken op de geïnduceerde observatie van de Δaaf mutant4. De resultaten w.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Analyse van biofilm vorming is uitdagend vanwege de dynamische aard van biofilms en de variabiliteit tussen de stammen, materialen, laboratoria en testen. Hier zijn verschillende strategieën om te bepalen van biofilm vorming in de darmen ziekteverwekkers na galzouten blootstelling met experimentele inzicht geboden ter bevordering van de reproduceerbaarheid gepresenteerd. Er zijn aanvullende overwegingen om de reproduceerbaarheid. Eerst en vooral, is het raadzaam voor het uitvoeren van ten minste drie onafhankelijke exper.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen informatieverschaffing.
Dankbetuigingen
Wij danken Rachael B. Chanin en Alejandro Llanos-Chea voor technische bijstand. Wij danken Anthony T. Maurelli, Bryan P. Hurley Alessio Fasano, Brett E. Swierczewski en Bobby Cherayil voor de spanningen in deze studie gebruikt. Dit werk werd gesteund door het nationale Instituut van allergie en besmettelijke ziekten Grant K22AI104755 (C.S.F.). De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de officiële standpunten van de National Institutes of Health.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Tryptic Soy Broth | Sigma-Aldrich | 22092-500G | |
| Crystal Violet | Sigma | C6158-50 | |
| Concanavalin-A FITC | Sigma | C7642-10mg | |
| Glucose | Sigma | G7021-1KG | |
| Bile Salts | Sigma | B8756-100G | |
| LB Agar | Sigma | L7533-1KG | |
| 14 mL culture tubes, 17 x 100 mm, plastic, sterile | Fisher | 14-959-11B | |
| Vectashield hard-set antifade with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F1635-500 | |
| Gluteraldehyde | Sigma-Aldrich | G6257 | |
| Flat-bottomed 96-well plates (clear) | TPP | 92696 | |
| Flat-bottomed 96-well plates (black) | Greiner Bio-One | 655076 | |
| Flat-bottomed 24-well plates (clear) | TPP | 92424 | |
| Glass coverslips 12mm, round | Fisher | 08-774-383 | |
| 96-well plate reader | Spectramax | ||
| Fluorescent plate reader | Biotek Synergy 2 | ||
| Confocal or Fluorescent Microscope | Nikon A1 confocal microscope | ||
| 37°C Shaking Incubator | New Brunswick Scientific Excella E25 | ||
| 37°C Plate Incubator | Thermolyne Series 5000 |
Referenties
- Joo, H. -S. S., Otto, M. Molecular basis of in vivo biofilm formation by bacterial pathogens. Chem Biol. 19 (12), 1503-1513 (2012).
- O'Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. Biofilm Formation as Microbial Development. Annu Rev Microbiol. 54 (1), 49-79 (2000).
- Donlan, R....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
