Visualisatie van cellulaire elektrische activiteit in de zebravis vroege embryo's en tumoren

Summary

Hier, laten we het proces van het creëren van een cellulaire elektrische spanning verslaggever zebrafish lijn om te visualiseren van embryonale ontwikkeling, beweging, en vis tumor cellen in vivo.

Abstract

Bioelectriciteit, endogene elektrische signalering gemedieerd door ionenkanalen en pompen gelegen op de celmembraan, speelt belangrijke rol in het signaleren van processen van prikkelbaar neuronale en motorische cellen en vele andere biologische processen, zoals embryonale Developmental patronen. Er is echter behoefte aan een in vivo elektrische Activiteitencontrole in gewervelde embryogenese. De voorschotten van genetisch gecodeerde fluorescerende spanningsindicatoren (GEVIs) hebben het mogelijk gemaakt te bieden een oplossing voor deze uitdaging. Hier beschrijven we hoe maak je een transgene voltage indicator zebrafish met behulp van de gevestigde voltage-indicator, ASAP1 (versnelde Sensor van actie Potentials 1), als voorbeeld. De Tol2 kit en een promotor van de alomtegenwoordige zebrafish, ubi, werden gekozen in deze studie. We leggen ook de processen van Gateway site-specific klonen, Tol2 transposon gebaseerde zebrafish Transgenese en de procedure voor beginnende vis embryo's en vis tumoren met behulp van reguliere epifluorescerende microscopen. Met behulp van deze vis lijn, vonden wij dat er veranderingen van cellulaire elektrische spanning tijdens de embryogenese van zebravis en vis larvale beweging. Bovendien werd naar voren gebracht dat in een paar zebrafish maligne perifere zenuw schede tumoren, de tumor cellen waren over het algemeen gepolariseerde ten opzichte van het omliggende normale weefsel.

Introduction

Bioelectriciteit verwijst naar het endogene elektrische signalering gemedieerd door ionenkanalen en pompen, gelegen op de celmembraan¹. Ionische exchanges over de cellulaire membraan, en de gekoppelde elektrische potentiële en huidige wijzigingen, zijn essentieel voor de signalering van processen van prikkelbaar neuronale en motorische cellen. Bovendien, hebben bioelectriciteit en ion verlopen allerlei andere belangrijke biologische functies zoals energieopslag, biosynthese en transport metaboliet. Bioelectrische signalen werd ook ontdekt als een regulator van embryonale patroonformatie, zoals lichaam assen, de celcyclus en cel differentiatie¹. Het is dus cruciaal voor het begrip van vele aangeboren ziekten bij de mens die uit de verkeerde regulering van dit type van signalering voortvloeien. Hoewel patch-clamp wijd verbeid gebruikt is voor het opnemen van de afzonderlijke cellen, is het nog steeds verre van ideaal voor de gelijktijdige bewaking van meerdere cellen tijdens de embryonale ontwikkeling in vivo. Spanning gevoelige kleine moleculen zijn bovendien ook niet ideaal voor in vivo toepassingen als gevolg van hun specifieke kenmerken, gevoeligheden en toxicities.

De oprichting van een verscheidenheid van genetisch gecodeerd fluorescerende spanning indicatoren (GEVIs) biedt een nieuw mechanisme om deze kwestie te overwinnen, en zorgt voor gemakkelijke toepassing te bestuderen van de embryonale ontwikkeling, hoewel zij oorspronkelijk waren bedoeld voor het toezicht op neurale cellen^2,3. Een van de momenteel beschikbare GEVIs is de versnelde Sensor van actie Potentials 1 (ASAP1)⁴. Het is samengesteld uit een extracellulaire lus van een spanning-sensing domein van spanning gevoelige fosfatase en een circulair permuted groen fluorescent proteïne. Daarom, ASAP1 kunt visualisatie van cellulaire elektrische potentiële veranderingen (polarisatie: heldergroen; depolarisatie: donkergroen). ASAP1 heeft 2 ms op-en-off kinetiek en subthreshold potentiële verandering⁴kunt bijhouden. Dus, deze genetische tool zorgt voor een nieuw niveau van werkzaamheid in real-time bioelectrische bewaking in levende cellen. Verder begrip van de rol van bioelectriciteit in de embryonale ontwikkeling en vele menselijke ziekten, zoals kanker, zal nieuwe licht werpen op de onderliggende mechanismen, die is van cruciaal belang voor de behandeling van de ziekte en preventie.

Zebravis hebben bewezen een krachtige diermodel ontwikkelingsbiologie en menselijke ziekten waaronder kanker^5,6te gaan studeren. Zij 70% orthologous genen delen met mensen, en ze hebben soortgelijke gewervelde biologie⁷. Zebravis bieden relatief gemakkelijk te onderhouden, de grootte van een grote koppeling van eieren, hanteerbare genetica, gemakkelijk Transgenese en transparante externe embryonale ontwikkeling, waardoor ze een superieur systeem voor in vivo imaging^5,6. Met een grote bron van mutant vis lijnen al aanwezig en een volledig gesequenceerd genoom zorgt zebravis voor een relatief onbeperkt scala aan wetenschappelijke ontdekking.

Om te onderzoeken de in vivo real-time elektrische activiteit van cellen, profiteren we van de zebravis modelsysteem en ASAP1. In deze paper, we beschrijven hoe de fluorescerende spanning biosensor ASAP1 geïntegreerd in het genoom van de zebravis met behulp van Tol2 transposon Transgenese en visualiseren van cellulaire elektrische activiteit tijdens de embryonale ontwikkeling, vis larvale beweging, en in levende tumor .

Protocol

De zebravis zijn gehuisvest in een AAALAC-goedgekeurd dier faciliteit, en alle experimenten werden uitgevoerd volgens de protocollen die zijn goedgekeurd door de Purdue Animal Care en gebruik Comité (PACUC).

1. Tol2 Transposon plasmide Construct voorbereiding

Opmerking: Tol2, een transposon die werd ontdekt in medaka, vis is wijd gebruikt in de zebravis onderzoek Gemeenschap^8,9. Het is met succes aangenomen om de site-specifieke recombinatie gebaseerde klonen gatewaysysteem en bekend als de Tol2 kit¹⁰. De Tol2 kit voorziet in een handige methode voor het maken van aangepaste expressie constructies, terwijl het ook het verhogen van de efficiëntie van Transgenese. Dus was het geen gemakkelijke beslissing om te profiteren van dit systeem, en maak een alomtegenwoordige ASAP1 expressie zebrafish regel met behulp van een gevalideerde ubiquitin promotor te rijden ASAP1¹¹.

1. Creëren van een constructie midden vermelding ASAP1: pDONR221-ASAP1
   1. Verwerven genetisch gecodeerde voltage sensor ASAP1 constructie voor de pcDNA3.1/Puro-CAG-ASAP1 (plasmide #52519), van Addgene. Om te vullen de ASAP1 codering regio, ingesteld een PCR met behulp van de aangepaste inleidingen (attB1-ASAP1F en attB2-ASAP1R) geflankeerd door attB sequenties aan het einde 5' van de inleidingen (Figuur 1). Phusion DNA-polymerase werd gekozen voor zijn hoge efficiëntie en PCR voorwaarden werden geoptimaliseerd op basis van de eerder gepubliceerde protocol¹².
   2. De 50 µL PCR producten in een 1% TAE gel met behulp van een regelmatige precisiepipet met 200 µL tips laden en uitvoeren van elektroforese op 160 V in een horizontale gel bak voor ongeveer 30 min.
   3. Controleer de gel onder een UV-transilluminator (353 nm), accijnzen uit de gewenste band met behulp van een mes/scalpel onder een UV-transilluminator als de eerder gepubliceerde^13,14, en zet het DNA met gel monster in een schone 1,5 mL microcentrifuge buis.
   4. Reiniging van het gel voor de ASAP1 PCR producten uitvoeren. Herstellen van het DNA in de verwijderde gel met behulp van een commerciële DNA gel zuivering kit volgens instructies van de fabrikant, en elueer de DNA in 20 µL van water. 1 µL als een monster nemen en de concentratie van de DNA met een spectrofotometer meet. De instructies van de software met behulp van water als een blancocontrole¹⁵stromen.
   5. Neem 100 ng van PCR product gezuiverd en meng het met 150 ng van pDONR221 plasmide in 10 µL van TE buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA pH 8,0)¹⁶. Voeg 2 µL van BP Clonase II in de reactie en de reactie bij kamertemperatuur 's nachts uit te broeden.
   6. Op de tweede dag, voeg 1 µL van proteïnase K in de reactie en de reactie bij 37 ° C gedurende 30 minuten uit te broeden.
   7. Transformatie uitvoeren Breng de reactie en meng het met 50 µL van Top10 bevoegde E. coli cellen en Incubeer de cellen op het ijs gedurende 30 minuten. Dan, breng de reactiebuis in een waterbad van 42 ° C voor 1 min. onmiddellijk verwijderen van de buis en incubeer op ijs gedurende 2 minuten. Vervolgens zet de buis in een shaker 37 ° C en het Incubeer gedurende 1 uur.
   8. Neem de buis en plaat van de cellen op een bord kanamycine LB. Volgende, Incubeer de plaat 's nachts (16-18 h) bij 37 ° C.
   9. Kies eenpersoons- en goed gescheiden kolonies en enten ze in 14 mL cel cultuur buizen met 3 mL van LB medium. Cultuur ze 's nachts bij 37 ° C in een shaker met een rotatiesnelheid van 250 rpm (rotatie per minuut).
   10. Uitvoeren van miniprep met behulp van een commerciële miniprep kit na de instructie handleiding¹⁷.
   11. Volgnummer 3-4 plasmiden met Sanger klonen rangschikken identificeren van positieve pDONR221-ASAP1 met behulp van M13F en M13R sequencing inleidingen.
2. Maken van de constructie van de Tol2 voor microinjection: pDestTol2 -ubi-ASAP1
   1. Kies dat de volgorde gecontroleerd pDONR221-ASAP1 kloon en maatregel zijn DNA-concentratie met een spectrofotometer volgende de instructie van de software met behulp van water als een blanco controle¹⁵.
   2. Neem 100 µg voor pDONR221-ASAP1 en meng het met 100 µg Tol2 kit 5-end plasmide (pENTR5'_ubi, Addgene #27320), 100 µg p3E-polyA (Tol2 kit #302) en 150 µg voor pDestTol2pA2 (Tol2 kit #394). Totale volume aan 8 µL aanpassen met behulp van TE buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) in een microcentrifuge van 1,5 mL tube en meng goed door een 2-5 s korte vortex. Dan, voeg 2 µL van LR Clonase II plus, en de reactie bij kamertemperatuur 's nachts uit te broeden.
   3. Op de tweede dag, voeg 1 µL van proteïnase K in de reactie met behulp van een precisiepipet µL 10, en de reactie bij 37 ° C gedurende 30 minuten uit te broeden.
   4. Het uitvoeren van transformatie en identificeren van positieve klonen zoals hierboven (stappen 1.1.7-11) beschreven.
   5. Maatregel de DNA-concentratie van sequencing gecontroleerd pDestTol2-ubi-ASAP1 kloon (figuur 1B) met behulp van een spectrofotometer¹⁵. De concentratie is meestal rond de 200ng/µL.

2. Tol2 Transposase mRNA en injectie oplossing voorbereiden

1. Streak E. coli glycerol voorraad van pCS2FA-transposase plasmide (Tol2 kit #396) op een bord LB (met 100 µg/mL ampicilline) met een gesteriliseerde inoculatie-lus. Incubeer de plaat bij 37 ° C in een broedstoof 's nachts. De volgende dag, kies een één kolonie en het in 3 mL LB (100 µg/mL ampicilline) met behulp van een gesteriliseerde 10 µL pipette uiteinde worden geënt. Cultuur het 's nachts bij 37 ° C in een shaker met een rotatiesnelheid van 250 rpm.
2. Miniprep op de cultuur van de E. coli met behulp van een commerciële miniprep kit na haar handleiding uitvoeren. Elueer plasmide DNA in 30-50 µL van TE buffer door 1 minuut centrifuge op 14.000 rpm en de concentratie ervan DNA meten met een spectrofotometer.
3. Linearize 1-2 µg plasmide met niet ik endonuclease en te zuiveren van het DNA met een DNA reinigingsset niet ik de handleiding na vertering. Elueer de DNA in 5 µL van water door centrifugatie bij 14.000 omwentelingen per minuut gedurende 1 minuut. De verwachte concentratie is ongeveer 200-300 ng/µL.
4. In vitro transcriptie uitvoeren met Not ik gelineariseerde pCS2FA-transposase als een DNA-sjabloon met behulp van een commerciële SP6 transcriptie kit.
5. Zodra de reactie wordt gebeëindigd, zuiveren Tol2 transposase mRNA met behulp van een commerciële RNA reiniging kit na instructies van de fabrikant. Tenslotte Elueer mRNA in 20 µL van de RNAase-vrij van het water en de concentratie van RNA in een spectrofotometer meten. De verwachte concentratie is ongeveer 1-3 µg / µL. monsters kunnen worden opgeslagen in een vriezer-80 ° C, indien nodig.
6. Bereid de oplossing van microinjection door het mengen van 20 ng/µL pDestTol2 -ubi-ASAP1 en Tol2 transposase mRNA (100 ng/µL) in een microcentrifuge-buis door pipetteren. Ter voorkoming van aantasting van de nucleic zuur veroorzaakt door herhaalde ontdooien en refreezing, aliquoot 6 µL per buis en opslaan in een vriezer-80 ° C voor toekomstig gebruik.

3. microinjection

1. Instellen van 4-6 fokken tanks met ten minste 2 reutjes en 2 teefjes de middag vóór injectie. Deze vis moet niet worden gevoed in de middag. Deze stap zal verminderen de hoeveelheid visafval en Bespaar tijd om ze schoon uit de volgende ochtend, terwijl ook het helpen voor het opwekken van een reactie van de fokkerij.
2. De volgende ochtend Verwijder de oplossing bereid injectie (pDestTol2 -ubi-ASAP1 construct en Tol2 mRNA) uit de diepvries-80 ° C, en plaats deze op het ijs.
3. Trek de scheidingslijnen in de vis fokken van tanks en laat de vis om te paren. In het algemeen, leggen vis eieren binnen 20-30 minuten na het uittrekken van de scheidslijn. Als niet, 1-2 uur langer wachten. Sommige vissen kunnen niet het leggen van eieren helemaal. In dit geval, herhaal dit experiment voor vis embryo's worden verzameld.
4. Terwijl we wachten, zorg ervoor dat er naalden bereid met de tip gebroken onder een hoek maken een afgeschuinde rand met een tang, of door te breken op een delicate taak wisser.
   1. Haal de naalden van capillaire glas op een trekker van de micropipet met de volgende parameters: warmte 545; Trek 60; snelheid 80; tijd 250; Druk 500. Breken de naald met pincet onder een dissectie scope (met oog-delige liniaal voor diameter schatting) door de verlostang op een hoek van ongeveer 45 °. Gewenste naald diameters kunnen variabele afhankelijk van de instellingen van de microinjector, maar kleinere diameter is de voorkeur voor het verminderen van embryo sterfte.
5. Zodra de vis hebben eieren gelegd, verzamelen ze in een 10-cm diameter petrischaal en breng ze naar de dissectie reikwijdte. Verwijder alle abnormale embryo's en vissen afval.
6. Pipetteer de bevruchte embryo's in de bereide 3% agarose injectie schimmel. Verwijder overtollig water om te helpen bewaren van de embryo's op plaats.
7. Zodra alle rijen gevuld zijn met levensvatbare embryo's, moet u deze ordenen zodat de afzonderlijke cellen alle geconfronteerd met de dezelfde richting van de naald, die ongeveer een hoek van 45° horizontaal is. Dit zal gemakkelijker injectie veel later.
8. Terwijl het dragen van handschoenen, gebruik een Pipetteer 20 µL laden uiteinde en 5 µL van de voorbereide constructie verwijderen uit de buis op ijs.
9. Breng zorgvuldig de tip in de back-end van het gebroken capillair helemaal naar waar het begint te tapper, over het krijgen van het reagens zo dicht mogelijk bij de tip. Als er nog luchtbellen, schud de naald, ervoor zorgend om de tip niet te breken.
10. Plaats de naald direct in de microinjection naald houder en draai voorzichtig vast totdat de naald op zijn plaats blijft. Aanpassen van de hoek tot ongeveer 45°.
11. Zodra de naald is opgesteld en aangesloten, zet de Membraanreservoir Microscoop en gas. Commerciële CO₂ tanks zijn over het algemeen goed voor dit doel. Het geïnjecteerde volume wordt afgesteld door de holding en uitwerpen druk: geschatte 0.5 psi voor bedrijf en 30 psi voor uitwerpen. Moet u controleren dat de oplossing komt uit bij het indrukken van het pedaal.
12. Gebruik een micrometer fase met een daling van minerale olie, pas het volume en de stroom van de oplossing voor ~ 150 µm in diameter (ongeveer 2 nL). Zorg ervoor dat de tegendruk een kleine hoeveelheid druppelen laat uit van de naald. Als er niet genoeg tegendruk, zal capillair actie veroorzaken vloeistof om te gaan van de naald en vernietigen de mRNA.
13. Zodra de naald is gekalibreerd, beginnen de constructie injecteren in een enkele cel van de bevruchte embryo's.
    Opmerking: Dit gaat een grote hoeveelheid van de praktijk, geduld en finesse, als gevolg van de celmembraan wordt hard te doorboren. Het is belangrijk om te injecteren de oplossing in de cel, niet de dooier, voor het genereren van transgene zebrafish. Dit is anders dan morfolino injectie. Het maakt niet uit welke kant de naald treedt de cel zolang de constructie gaat in de cel. De Transgenese heeft een zeer laag tarief van succes als geïnjecteerd in de dooier in plaats van de cel. Eencellige fase injectie is ook belangrijk, of somatische chimera vis zal worden gecreëerd. Dit zal verminderen de kans op de transgenic gaan in de geslachtscellen.
14. De rand van de inkeping gel gebruiken om een steun die houdt van het embryo in plaats en kan de naald druk uitoefenen zonder te verplaatsen van het embryo. Zodra de punt van de naald in een enkele cel is, druk op de pedaal om de gewenste hoeveelheid oplossing vrij te geven. Herhaal dit proces voor alle van de embryo's.
15. Wanneer voltooid, overdracht van de geïnjecteerde embryo's in een gelabelde schotel door ze te spoelen uit de agarose inkeping met vis systeem water en een wegwerp 3,4 mL overdracht pipet. De embryo's worden opgeslagen in een incubator 28,5 ° C te laten ontwikkelen. Controleer terug gedurende de dag verwijderen dode vissen embryo's en vervang water met 0,1% methyleenblauw in water van de vis.
16. Ongeveer 6-8 uur na de injectie, nemen 10 individuele geïnjecteerd vissen van embryo's en bereiden van genomic DNA van hen met behulp van de Hotshot methode¹⁸.
17. De volgende ochtend, gebruik een dissectie Microscoop met een lichtbron van fluorescentie uitzoeken van de embryo's GFP in de weefsels van de niet-dooier tonen. Deze vis embryo's moeten de ingespoten construct bevatten.
18. Tol2 accijnzen test om te controleren de transposon activiteit zoals eerder beschreven¹⁹uit te voeren. Als de verwijderde plasmide kan worden opgespoord, houden de ingespoten vissen van embryo's en hen te verhogen. Als geen verwijderde plasmide kan worden opgespoord, herhaalt u de Tol2 mRNA-synthese en microinjection proces tot het bereiken van de positieve resultaten van de bepaling van de accijnzen Tol2.

4. vaststellen van de transgene ASAP1 vis, GS (ubi: ASAP1)

1. Verhogen de ingespoten vis (F₀ generatie) naar volwassenheid, zoals eerder is beschreven in de zebravis boek²⁰. Dit duurt meestal ongeveer 4 maanden.
2. Neem een enkele volwassen F₀ vis en het Kruis met een honkslag tegenover geslacht wildtype vis. Het verzamelen van vis embryo's na fokken later op de dag. Houd de verzamelde vis embryo's in de incubator 28,5 ° C in vis water met 0,1% methyleenblauw.
3. Op de derde dag, neem contact op de vis embryo's onder een Microscoop fluorescerende dissectie met een GFP-filter. Groene vis embryo's, uitzoeken, als die er zijn, en hen te verhogen naar volwassenheid als F₁ generatie transgene vis, GS (ubi: ASAP1).
   Opmerking: Mendelian verhouding wordt niet verwacht aangezien de meeste van de ouderlijke F₀ vis germinale genetische Chimaera.
4. Kruis één F₁ volwassen vis met wildtype vis en vis embryo's te verzamelen. Groene vis embryo's uitzoeken en ze naar volwassenheid als F₂ generatie vis te verhogen.
   Opmerking: Groen en niet-groene vis embryo's moeten zijn dicht bij 1:1 als er een enkele transgenic.
5. Elektrische potentiële om wijzigingen te bekijken in de tumor als maligne perifere zenuw schede tumoren (MPNST), kruis de F₂ generatie GS (ubi: ASAP1) vis met rpl35^hi258/wt vis. Het is bekend dat zichtbare tumoren beginnen te vinden in de 6-8 maand oud volwassenen^21,22.

5. beeldvorming

1. Beeld van de zebravis embryo's, meerdere F₂ generatie oprichter vis en kruis hen met wildtype vis in enkele letterparen. Vis embryo's verzamelen op verschillende gewenste ontwikkelingsstadia volgens de zebravis enscenering gids²³.
2. Voor de vroege stadia van vis embryo's, schil en chorions van de embryo's zorgvuldig met behulp van een paar pincet onder het toepassingsgebied van een dissectie in een 10-cm diameter petrischaal met vis systeem water verwijderen.
3. Pipetteer een paar vis embryo's op een concaved glasplaatje met 3% methylcellulose met behulp van een precisiepipet 3,4 mL wegwerp overdracht. Aanpassen van de embryo's naar de gewenste posities te bekijken van de cellulaire GFP activiteit met behulp van een naald onder een fluorescente dissectie-scope.
4. Voor de bewegende fasen van vis gebruiken embryo's (ouder dan 12 Somiet stadium), 0.05% tricaïne mesylaat om te anesthetize de vis embryo's voordat u ze overbrengt op dia's. Kort, vis embryo's waren ontstaan in 0.05% tricaïne mesylaat in vis water totdat ze gestopt met zwemmen en verlies lichaam evenwicht. Ook het toevoegen van een daling van 0,05% tricaïne mesylaat met de methylcellulose op de dia.
5. Voor minder dan 12 Somiet stadium vis embryo's, gebruik een epi-fluorescentie samengestelde microscoop met een compatibele camera en software voor beeldbewerking. Voor ouder dan 12 Somiet stadium vis-embryo's, gebruikt u een fluorescentie dissectie Microscoop.
6. Beeld van de tumor cel spanning, eerst het identificeren van de vis met MPNST tumoren. Dan anesthetize de vis met 0,05% tricaïne mesylaat. Voor hele mount imaging, zet u de vis in een 10-cm diameter petrischaal. Als u wilt weergeven van de cel van de elektrische activiteit van tumor, kunnen uit na hele mount imaging vis tumoren worden ontleed.

Results

In een succesvolle injectie, meer dan 50% geïnjecteerd vis embryo's verschijnt een zekere mate van groene fluorescentie in de lichaamscellen, maar de meeste van hen zullen positief door Tol2 transposon accijnzen assay (Figuur 2). Na 2-4 generaties van uitgaande kruis met wildtype vis (totdat de fluorescerende vis 50 procent, de verwachte Mendelian verhouding tot), werden de transgene vis gebruikt voor de beeldvorming experiment om bij te houden van de celmemb...

Discussion

Hoewel de cellulaire en weefsel niveau elektrische activiteiten tijdens de embryonale ontwikkeling en ziekten bij de mens lang geleden ontdekt waren, nog de in vivo dynamische elektrische veranderingen en hun biologische rollen grotendeels onbekend. Een van de grootste uitdagingen is het visualiseren en kwantificeren van de elektrische veranderingen. Patch-clamp-technologie is een doorbraak voor het bijhouden van afzonderlijke cellen, maar de toepassing ervan op gewervelde embryo's is beperkt, omdat ze samengest...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
14mL cell culture tubes	VWR	60818-725	E.Coli culture
Agarose electrophoresis tank	Thermo Scientific	Owl B2	DNA eletrophoresis
Agarose RA	Amresco	N605-500G	Voor het maken van de injectie gels
Attb1-ASAP1-F primer	IDT DNA	GGGGACAAGTTTGTACAAAAAA GCAGGCTTCACCATGGAGACGA CTGTGAGGTATGAACA	ASAP1 coderingsgebied versterking voor subcloning
Attb2-ASAP1-R primer	IDT DNA	GGGGACCACTTTGTACAAGAAA GCTGGGTCTTAGGTTACCACTTC AAGTTGTTTCTTCTGTGAAGCCA	ASAP1 coderingsgebied versterking voor subcloning
Bright field dissection scope	Nikon	SMZ 745	Dechorionation, micro-injectie, montage
Color camera	Zeiss	AxioCam MRc	Vis embryo beeldopname
Concave slide	VWR	48336-001	Voor het vasthouden van vis embryo's tijdens het beeldvormingsproces
Disposable transfer pipette 3.4 ml	Thermo Scientific	13-711-9AM	Vis embryo's en wateroverdracht
Endonuclease enzyme, Not I	NEB	R0189L	Voor het lineariseren van plasmide DNA
Epifuorescent compound scope	Zeiss	Axio Imager.A2	Vis embryo beeldvorming
Epifuorescent stereo dissection scope	Zeiss	Stereo Discovery.V12	Vis embryo beeldvorming
Fluorescent light source	Lumen dynamics	X-cite seris 120	Lichtbron voor fluorescentie microscopen
Forceps #5	WPI	500342	Dechorionation en naald breken
Gateway BP Clonase II Enzyme mix	Thermo Scientific	11789020	Gateway BP recombinatie kloning
Gateway LR Clonase II Plus enzyme	Thermo Scientific	12538120	Gateway LR recombinatie kloning
Gel DNA Recovery Kit	Zymo Research	D4002	DNA gel zuivering
Loading tip	Eppendorf	930001007	Voor het laden van injectie oplossing in capillaire naalden
Methylcellulose (1600cPs)	Alfa Aesar	43146	Vis embryo montage
Methylene blue	Sigma-Aldrich	M9140	Drukt schimmeluitbraken in petrischalen tegen
Microinjection mold	Adaptive Science Tools	TU-1	Om een agarose mal lade voor het vasthouden van vis embryo's tijdens injectie voor te bereiden
Microinjector	WPI	Pneumatic Picopump PV820	Micro-injectie injector
Micro-manipulator	WPI	Microinjector MM3301R	Micro-injectie operatie
Micropipette puller	Sutter instrument	P-1000	Voor het bereiden van capillaire naald
Mineral oil	Amresco	J217-500ml	Voor het kalibreren van injectie volume
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit	Thermo Scientific	AM1340	mRNA in vitro transcriptie
Monocolor camera	Zeiss	AxioCam MRm	Vis embryo beeldopname
Plasmid Miniprep Kit	Zymo Research	D4020	Kleine hoeveelheid plasmide DNA voorbereiden
Plastic Petri dishes	VWR	25384-088	Voor het vasthouden van vis of vis embryo's tijdens het beeldvormingsproces
RNA Clean & Concentrator-5	Zymo Research	R1015	mRNA schoonmaken na in vitro transcriptie
Spectrophotometer	Thermo Scientific	NanoDrop 2000	Voor het meten van DNA en RNA concentraties
Stage Micrometer	Am Scope	MR100	Micro-injectie volume kalibratie
Thermocycler	Bio-Rad	T100	DNA versterking voor gen klonering
Thin wall glass capillaries	WPI	TW100F-4	Ruwe glas voor het maken van capillaire naald
Tol2-exL1 primer	IDT DNA	GCACAACACCAGAAATGCCCTC	Tol2 excisie assay
Tol2-exR primer	IDT DNA	ACCCTCACTAAAGGGAACAAAAG	Tol2 excisie assay
TOP10 Chemically Competent E. coli	Thermo Scientific	C404006	Gebruikt voor transformatie tijdens gen klonering
Tricaine mesylate	Sigma-Aldrich	A5040	Voor het anesthetiseren van vis of vis embryo's
UV trans-illuminator 302nm	UVP	M-20V	DNA visualisatie
Water bath	Thermo Scientific	2853	Voor het transformatieproces van gen klonering