Method Article

Visualisatie van cellulaire elektrische activiteit in de zebravis vroege embryo's en tumoren

DOI:

10.3791/57330

⸱

April 25th, 2018

 , 
1Department of Comparative Pathobiology, Purdue University, 2Purdue University Center for Cancer Research, Purdue Institute for Inflammation, Immunology and Infectious Diseases (PI4D), Purdue Institute for Integrative Neuroscience (PIIN), Purdue University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier, laten we het proces van het creëren van een cellulaire elektrische spanning verslaggever zebrafish lijn om te visualiseren van embryonale ontwikkeling, beweging, en vis tumor cellen in vivo.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bioelectriciteit, endogene elektrische signalering gemedieerd door ionenkanalen en pompen gelegen op de celmembraan, speelt belangrijke rol in het signaleren van processen van prikkelbaar neuronale en motorische cellen en vele andere biologische processen, zoals embryonale Developmental patronen. Er is echter behoefte aan een in vivo elektrische Activiteitencontrole in gewervelde embryogenese. De voorschotten van genetisch gecodeerde fluorescerende spanningsindicatoren (GEVIs) hebben het mogelijk gemaakt te bieden een oplossing voor deze uitdaging. Hier beschrijven we hoe maak je een transgene voltage indicator zebrafish met behulp van de gevestigde voltage-indicator, ASAP1 (versnelde Sensor van actie Potentials 1), als voorbeeld. De Tol2 kit en een promotor van de alomtegenwoordige zebrafish, ubi, werden gekozen in deze studie. We leggen ook de processen van Gateway site-specific klonen, Tol2 transposon gebaseerde zebrafish Transgenese en de procedure voor beginnende vis embryo's en vis tumoren met behulp van reguliere epifluorescerende microscopen. Met behulp van deze vis lijn, vonden wij dat er veranderingen van cellulaire elektrische spanning tijdens de embryogenese van zebravis en vis larvale beweging. Bovendien werd naar voren gebracht dat in een paar zebrafish maligne perifere zenuw schede tumoren, de tumor cellen waren over het algemeen gepolariseerde ten opzichte van het omliggende normale weefsel.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bioelectriciteit verwijst naar het endogene elektrische signalering gemedieerd door ionenkanalen en pompen, gelegen op de celmembraan1. Ionische exchanges over de cellulaire membraan, en de gekoppelde elektrische potentiële en huidige wijzigingen, zijn essentieel voor de signalering van processen van prikkelbaar neuronale en motorische cellen. Bovendien, hebben bioelectriciteit en ion verlopen allerlei andere belangrijke biologische functies zoals energieopslag, biosynthese en transport metaboliet. Bioelectrische signalen werd ook ontdekt als een regulator van embryonale patroonformatie, zoals lichaam assen, de celcyclus en cel differentiatie

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De zebravis zijn gehuisvest in een AAALAC-goedgekeurd dier faciliteit, en alle experimenten werden uitgevoerd volgens de protocollen die zijn goedgekeurd door de Purdue Animal Care en gebruik Comité (PACUC).

1. Tol2 Transposon plasmide Construct voorbereiding

Opmerking: Tol2, een transposon die werd ontdekt in medaka, vis is wijd gebruikt in de zebravis onderzoek Gemeenschap8,9. Het is met succes aangenomen om de site-specifieke recombinatie gebaseerde klonen gatewaysysteem en bekend als de Tol2 kit10. De Tol2 kit voorziet in een han....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In een succesvolle injectie, meer dan 50% geïnjecteerd vis embryo's verschijnt een zekere mate van groene fluorescentie in de lichaamscellen, maar de meeste van hen zullen positief door Tol2 transposon accijnzen assay (Figuur 2). Na 2-4 generaties van uitgaande kruis met wildtype vis (totdat de fluorescerende vis 50 procent, de verwachte Mendelian verhouding tot), werden de transgene vis gebruikt voor de beeldvorming experiment om bij te houden van de celmemb.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hoewel de cellulaire en weefsel niveau elektrische activiteiten tijdens de embryonale ontwikkeling en ziekten bij de mens lang geleden ontdekt waren, nog de in vivo dynamische elektrische veranderingen en hun biologische rollen grotendeels onbekend. Een van de grootste uitdagingen is het visualiseren en kwantificeren van de elektrische veranderingen. Patch-clamp-technologie is een doorbraak voor het bijhouden van afzonderlijke cellen, maar de toepassing ervan op gewervelde embryo's is beperkt, omdat ze samengest.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het onderzoekswerk gemeld in deze publicatie werd gesteund door de National Institute of General Medical Sciences van de National Institutes of Health onder de Award nummer R35GM124913, Purdue University PI4D incentive programma en PVM interne concurrerende Basisonderzoek fondsen programma. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de officiële standpunten van de financiering agenten. Wij danken Koichi Kawakami voor de Tol2 constructie, Michael Lin voor constructie voor de ASAP1 en Leonard Zon voor de ubi -promotor bouwen via Addgene.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
14mL cell culture tubesVWR60818-725E.Coli culture
Agarose electrophoresis tankThermo ScientificOwl B2DNA eletrophoresis
Agarose RAAmrescoN605-500GFor making the injection gels
Attb1-ASAP1-F primerIDT DNAGGGGACAAGTTTGTACAAAAAA
GCAGGCTTCACCATGGAGACGA
CTGTGAGGTATGAACA		ASAP1 coding region amplification for subcloning
Attb2-ASAP1-R primerIDT DNAGGGGACCACTTTGTACAAGAAA
GCTGGGTCTTAGGTTACCACTTC
AAGTTGTTTCTTCTGTGAAGCCA		ASAP1 coding region amplification for subcloning
Bright field dissection scopeNikonSMZ 745Dechorionation, microinjection, mounting
Color cameraZeissAxioCam MRcFish embryo image recording
Concave slideVWR48336-001For holding fish embryos during imaging process
Disposable transfer pipette 3.4 mlThermo Scientific13-711-9AMFish embryos and water transfer
Endonuclease enzyme, Not INEBR0189LFor linearizing plasmid DNA
Epifuorescent compound scopeZeissAxio Imager.A2Fish embryo imaging
Epifuorescent stereo dissection scopeZeissStereo Discovery.V12Fish embryo imaging
Fluorescent light sourceLumen dynamicsX-cite seris 120Light source for fluorescence microscopes
Forceps #5WPI500342Dechorionation and needle breaking
Gateway BP Clonase II Enzyme mixThermo Scientific11789020Gateway BP recombination cloning
Gateway LR Clonase II Plus enzymeThermo Scientific12538120Gateway LR recombination cloning
Gel DNA Recovery KitZymo ResearchD4002DNA gel purification
Loading tipEppendorf930001007For loading injection solution into capilary needles
Methylcellulose (1600cPs)Alfa Aesar43146Fish embryo mounting
Methylene blueSigma-AldrichM9140Suppresses fungal outbreaks in Petri dishes
Microinjection moldAdaptive Science ToolsTU-1To prepare agaorse mold tray for holding fish embryos during injection
MicroinjectorWPIPneumatic Picopump PV820Microinjection injector
Micro-manipulatorWPIMicroinjector MM3301RMicroinjection operation
Micropipette pullerSutter instrumentP-1000For preparing capillary needle
Mineral oilAmrescoJ217-500mlFor calibrating injection volume
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription KitThermo ScientificAM1340mRNA in vitro transcription
Monocolor cameraZeissAxioCam MRmFish embryo image recording
Plasmid Miniprep KitZymo ResearchD4020Prepare small amount of plasmid DNA
Plastic Petri dishesVWR25384-088For holding fish or fish embryos during imaging process
RNA Clean & Concentrator-5Zymo ResearchR1015mRNA cleaning after in vitro transcription
SpectrophotometerThermo ScientificNanoDrop 2000For measuring DNA and RNA concentrations
Stage MicrometerAm ScopeMR100Microinjection volume calibration
ThermocyclerBio-RadT100DNA amplification for gene cloning
Thin wall glass capillariesWPITW100F-4Raw glass for making cappilary needle
Tol2-exL1 primerIDT DNAGCACAACACCAGAAATGCCCTCTol2 excise assay
Tol2-exR primerIDT DNAACCCTCACTAAAGGGAACAAAAGTol2 excise assay
TOP10 Chemically Competent E. coliThermo ScientificC404006Used for transformation during gene cloning
Tricaine mesylateSigma-AldrichA5040For anesthetizing fish or fish embryos
UV trans-illuminator 302nmUVPM-20VDNA visualization
Water bathThermo Scientific2853For transformation process of gene cloning

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Levin, M. Molecular bioelectricity: how endogenous voltage potentials control cell behavior and instruct pattern regulation in vivo. Molecular Biology of the Cell. 25 (24), 3835-3850 (2014).
  2. Storace, D., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Transgenic ZebrafishCellular Electrical ActivityGenetically Encoded Voltage IndicatorsASAP1 ReporterTol2 TransposonGateway CloningMicroinjection TechniqueEpifluorescence MicroscopyMembrane Potential ChangesMalignant Peripheral Nerve Sheath Tumors

Related Articles