Een protocol wordt gepresenteerd voor gelijktijdig metabolieten, eiwitten en lipiden extraheren uit een één bodemmonster, waardoor deelmonster bereidingstijden en multi-dienst spectrometrische analyse van monsters met een beperkte hoeveelheden inschakelen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Het MPLEx-Protocol voor Multi-dienst Analyses van bodemmonsters
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De Spectrometrie van de massa (MS)-gebaseerde geïntegreerde metaproteomic, metabolomic en lipidomic (multi-dienst) studies zijn het omzetten van ons vermogen om te begrijpen en karakteriseren van microbiële gemeenschappen in milieu en biologische systemen. Deze metingen zijn zelfs inschakelen uitgebreide analyses van de microbiële gemeenschappen complexe bodem, dat de meest zijn complexe microbiële systemen bekend tot op heden. Multi-dienst analyses hebben echter monster voorbereiding uitdagingen, aangezien afzonderlijke extracties zijn meestal nodig voor elk onderzoek van de dienst, daardoor aanzienlijk versterken de voorbereidingstijd en de hoeveelheid monster nodig. Om deze beperking, is een 3-in-1-methode voor de gelijktijdige winning van metabolieten, eiwitten en lipiden (MPLEx) uit de dezelfde bodemmonster gemaakt door aanpassing van een aanpak op basis van oplosmiddel. Dit protocol MPLEx heeft bewezen om zowel eenvoudig en robuust voor vele types van de steekproef, zelfs wanneer gebruikt voor beperkte hoeveelheden van complexe bodemmonsters. De MPLEx methode ingeschakeld ook sterk de snelle multi-dienst metingen die nodig zijn voor een beter begrip van de leden van elke microbiële Gemeenschap, tijdens het evalueren van de veranderingen die plaatsvinden op biologische en ecologische verstoringen te krijgen.
Inleiding
Evaluatie van bodem microbiële gemeenschappen heeft belangrijke implicaties voor het begrijpen van carbon fiets- en klimaat-verandering. Recente studies hebben echter gewezen op problemen, zoals het ontbreken van gesequenceerd genomen voor microbiota in verschillende bodemtypes en de onbekende functie van veel van de eiwitten opgespoord. Het resultaat van deze uitdagingen als gevolg van de bodem wordt van de meest complexe microbiële Gemeenschap bekend tot op heden1,2,3. Multi-dienst analyses, die resultaten van metagenomic, metatranscriptomic, metaproteomic, metabolomic en l....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Opmerking: Zeer natte bodems kunnen worden gelyofiliseerd voorafgaand aan de winning zonder nadeel voor de doeltreffendheid van de extractie. Natte bodem kan ook worden gebruikt maar moet worden overwogen bij toevoegen van reagentia op specifieke verhoudingen.
Opmerking: Het is aanbevolen om het gebruik van 20 g droge bodem gewicht per extractie, die moet worden verdeeld tussen twee buizen van 50 mL (maximaal 10 g bodemmonster per tube 50 mL). Extracties kunnen worden geschaald, omhoog of omlaag afhankelijk van beschikbare monster.
Opmerking: Droge bodemmonsters kunnen worden gezeefd door een 3 mm-scherm te homog....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Wanneer het MPLEx-protocol is gebruikt voor het extraheren van moleculen uit Kansas inheemse prairie bodem (een Mollisol-bodem), de drievoudige analyses resultaten opgeleverd voor 3376 peptiden, 105 lipiden en 102 polar metabolieten (alle unieke id's). Terwijl het MPLEx protocol gevestigde voor algemene extractie van lipiden en metabolieten12,13,14,15,
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het is belangrijk op te merken dat niet alle laboratoria dezelfde beschikbare apparatuur hebben zal, zodat bepaalde methoden, bijvoorbeeld de lysis stap, kunnen worden aangepast. We gebruiken hier vortexing en sonicating, maar het gebruik van een groot 50 mL kraal beater zou werken. Als een lyophilizer met een verzamelaar temperatuur staat-105 ° C niet beschikbaar is, kunnen dan monsters worden gedroogd onder een stikstof-stream. Ook bodemtypes variëren sterk en zand, silt, klei, Veen en leem (enz.) kunnen opnem.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
De auteurs bedank Nathan Johnson voor zijn hulp bij de voorbereiding van de cijfers. Dit onderzoek werd gesteund door de Pan-omics-programma dat wordt gefinancierd door het Amerikaanse Department of Energy Office van biologische en milieuonderzoek (Genomic Science Program), de Microbiomes in overgang (MinT) laboratorium gericht onderzoek ontwikkeling Initiatief op de Pacific Northwest National Laboratory, evenals de nationale instituten van gezondheid National Institute of Environmental Health Sciences (R01 ES022190) en NIH (P42 ES027704). KEBJ bedank R21 HD084788 voor financiële steun aan de ontwikkeling en validering van nieuwe multi-dienst extractie technieken. Dit....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 650498 | Opgeslagen bij -20°C!Opgelet chloroform heeft acuut potentieel gezondheidseffecten, huidirritatie en mogelijke chemische brandwonden, irritatie van het ademhalingsstelsel, kan de nieren, lever, hart aantasten. Draag geschikte beschermende brillen, kleding en handschoenen, werk in een afzuigkap. |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Opgeslagen bij -20°C!Opgelet Methanol kan irritatie van het ademhalingsstelsel, huid en ogen veroorzaken, kan de zenuwen, nieren en lever beschadigen. Draag geschikte beschermende brillen, kleding en handschoenen, werk in een afzuigkap. |
| Gezuiverd water uit Millipore | Milli-Q | Waterzuiveringssysteem. | |
| Natriumdodecylsulfaat | Sigma-Aldrich | L6026 | !Opgelet SDS veroorzaakt acute toxiciteit en is ontvlambaar. Het is een huid-, oog- en luchtwegirritant. Draag handschoenen en veiligheidsbril. |
| Bodemeiwitextractiekit | MoBio, NoviPure Soil Protein Extraction Kit, Qiagen | 30000-20 | |
| DL-dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| 1M Trizma HCL | Sigma-Aldrich | T2694 | |
| Trichloroazijnzuur | Sigma-Aldrich | T0699 | !Opgelet TCA is corrosief, giftig en kan huidbrandwonden veroorzaken. Draag handschoenen en veiligheidsbril. |
| Aceton | Sigma-Aldrich | 650501 | Opgeslagen bij -20°C!Opgelet Aceton kan irritatie van het ademhalingsstelsel en huid en ogen veroorzaken. Ontvlambare vloeistof en damp. Draag veiligheidsbril, handschoenen en een laboratoriumjas, werk in een afzuigkap. |
| Urea | Sigma-Aldrich | 208884 | !Opgelet Urea is een oog- en huidirritant, gebruik handschoenen en veiligheidsbril |
| Ammoniumbicarbonaat | Fluka | 09830 | |
| Trypsine | Promega | V528A | 20µg-vialen |
| Bicinchoninezuur eiwitbepalingskit | Pierce | 23227 | |
| Ammoniumformiaat | Sigma-Aldrich | 09735 | |
| Acetonitril | Sigma-Aldrich | 34998 | !Opgelet Acetonitril is een huid- en oogirritant. Zeer ontvlambaar. Draag handschoenen en veiligheidsbril. Werk in een afzuigkap. |
| Trifluorazijnzuur | Sigma-Aldrich | T6508 | !Opgelet TFA is uiterst gevaarlijk bij huidcontact, oogcontact, inslikken en inademing. Kan weefselschade veroorzaken, vooral op de slijmvliezen van ogen, mond en ademhalingswegen. Huidcontact kan brandwonden veroorzaken. Draag handschoenen, laboratoriumjas, veiligheidsbril en werk in een afzuigkap. |
| Methoxyaminehydrochloride | Sigma-Aldrich | 226904 | !Opgelet Methoxyaminehydrochloride veroorzaakt ernstige brandwonden en ernstige oogschade, kan bij huidcontact sensibilisatie veroorzaken. Draag veiligheidsbril, handschoenen en laboratoriumjas, werk in een afzuigkap. |
| Pyridine | Sigma-Aldrich | 270970 | !Opgelet Pyridine kan huid- en oogirritatie veroorzaken, depressie van het centrale zenuwstelsel. Damp kan een flauwe vlam veroorzaken. Draag veiligheidsbril, handschoenen en laboratoriumjas, werk in een afzuigkap. |
| N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoracetamid met 1% trimethylchlorosilaan | Sigma-Aldrich | 69478 | !Opgelet MSTFA + 1% TMCS kan huidcorrosie, ernstige oogschade en specifieke toxische effecten op organen veroorzaken. Ontvlambare vloeistof en damp. Draag veiligheidsbril, handschoenen en laboratoriumjas, werk in een afzuigkap. |
| Kaliumchloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Milli-Q waterzuiveringssysteem | Millipore | model MPGP04001 | |
| Vortex | Scientific Industries | SI-0236 | Vortex Genie 2 |
| Probe sonicator | FisherBrand | model FB505 | |
| Gekoelde centrifuge | Eppendorf | model 5810R | |
| 50mL buis zwaaiende emmer rotor | Eppendorf | A-4-44 | |
| 50mL vaste hoekrotor | Eppendorf | FA-45-6-30 | |
| Balans | OHAUS | model V22PWE150IT | |
| Serologische pipette controller | Eppendorf | 12-654-100 | |
| 10mL, 25mL glazen serologische pipetten | FisherBrand | 13-678-27F, 13-678-36D | |
| Thermomixer met Thermotop | Eppendorf | 5382000015, 5308000003 | |
| 0.9 – 2.0 mm meng roestvrij staal kralen | NextAdvance | SSB14B | |
| 0.15 mm granaatkralen | MoBio | 13122-500 | |
| Magnetische roerplaat | FisherBrand | 11-100-16SH | |
| Magnetische roerstaaf | FisherBrand | 14512130 | |
| pH-papierstrepen, pH-bereik 0–14 | FisherBrand | M95903 | |
| 15mL, 50mL conische polypropyleen centrifugeerbuis | Genesee Scientific | 21-103 21-108 | chloroform compatibel |
| 50mL vortex-aansluiting | MoBio | 13000-V1-50 | |
| IJsemmer | FisherBrand | 02-591-44 | |
| 27.25x70mm glazen flesjes | FisherBrand | 03-339-22K | |
| Breathe Easier plate membranen | Midwest Scientific | BERM-2000 | |
| Alcoholdoekjes | Diversified Biotech | BPWP-1000 | |
| Verwarmde schudincubator | Benchmark, Incu-Shaker Mini | ||
| Analoge rotisseriebuis rotator | SoCal BioMed, LLC | 82422001 |
Referenties
- Hultman, J., et al. Multi-omics of permafrost, active layer and thermokarst bog soil microbiomes. Nature. 521, 208-212 (2015).
- White, R. A. 3rd, et al. Moleculo long-read sequencing facilitates assembly and genomic binning from com....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
