Het MPLEx-Protocol voor Multi-dienst Analyses van bodemmonsters

Summary

Een protocol wordt gepresenteerd voor gelijktijdig metabolieten, eiwitten en lipiden extraheren uit een één bodemmonster, waardoor deelmonster bereidingstijden en multi-dienst spectrometrische analyse van monsters met een beperkte hoeveelheden inschakelen.

Abstract

De Spectrometrie van de massa (MS)-gebaseerde geïntegreerde metaproteomic, metabolomic en lipidomic (multi-dienst) studies zijn het omzetten van ons vermogen om te begrijpen en karakteriseren van microbiële gemeenschappen in milieu en biologische systemen. Deze metingen zijn zelfs inschakelen uitgebreide analyses van de microbiële gemeenschappen complexe bodem, dat de meest zijn complexe microbiële systemen bekend tot op heden. Multi-dienst analyses hebben echter monster voorbereiding uitdagingen, aangezien afzonderlijke extracties zijn meestal nodig voor elk onderzoek van de dienst, daardoor aanzienlijk versterken de voorbereidingstijd en de hoeveelheid monster nodig. Om deze beperking, is een 3-in-1-methode voor de gelijktijdige winning van metabolieten, eiwitten en lipiden (MPLEx) uit de dezelfde bodemmonster gemaakt door aanpassing van een aanpak op basis van oplosmiddel. Dit protocol MPLEx heeft bewezen om zowel eenvoudig en robuust voor vele types van de steekproef, zelfs wanneer gebruikt voor beperkte hoeveelheden van complexe bodemmonsters. De MPLEx methode ingeschakeld ook sterk de snelle multi-dienst metingen die nodig zijn voor een beter begrip van de leden van elke microbiële Gemeenschap, tijdens het evalueren van de veranderingen die plaatsvinden op biologische en ecologische verstoringen te krijgen.

Introduction

Evaluatie van bodem microbiële gemeenschappen heeft belangrijke implicaties voor het begrijpen van carbon fiets- en klimaat-verandering. Recente studies hebben echter gewezen op problemen, zoals het ontbreken van gesequenceerd genomen voor microbiota in verschillende bodemtypes en de onbekende functie van veel van de eiwitten opgespoord. Het resultaat van deze uitdagingen als gevolg van de bodem wordt van de meest complexe microbiële Gemeenschap bekend tot op heden^1,2,3. Multi-dienst analyses, die resultaten van metagenomic, metatranscriptomic, metaproteomic, metabolomic en l....

Protocol

Opmerking: Zeer natte bodems kunnen worden gelyofiliseerd voorafgaand aan de winning zonder nadeel voor de doeltreffendheid van de extractie. Natte bodem kan ook worden gebruikt maar moet worden overwogen bij toevoegen van reagentia op specifieke verhoudingen.

Opmerking: Het is aanbevolen om het gebruik van 20 g droge bodem gewicht per extractie, die moet worden verdeeld tussen twee buizen van 50 mL (maximaal 10 g bodemmonster per tube 50 mL). Extracties kunnen worden geschaald, omhoog of omlaag afhankelijk van beschikbare monster.

Opmerking: Droge bodemmonsters kunnen worden gezeefd door een 3 mm-scherm te homog....

Results

Wanneer het MPLEx-protocol is gebruikt voor het extraheren van moleculen uit Kansas inheemse prairie bodem (een Mollisol-bodem), de drievoudige analyses resultaten opgeleverd voor 3376 peptiden, 105 lipiden en 102 polar metabolieten (alle unieke id's). Terwijl het MPLEx protocol gevestigde voor algemene extractie van lipiden en metabolieten^12,13,14,15,

Discussion

Het is belangrijk op te merken dat niet alle laboratoria dezelfde beschikbare apparatuur hebben zal, zodat bepaalde methoden, bijvoorbeeld de lysis stap, kunnen worden aangepast. We gebruiken hier vortexing en sonicating, maar het gebruik van een groot 50 mL kraal beater zou werken. Als een lyophilizer met een verzamelaar temperatuur staat-105 ° C niet beschikbaar is, kunnen dan monsters worden gedroogd onder een stikstof-stream. Ook bodemtypes variëren sterk en zand, silt, klei, Veen en leem (enz.) kunnen opnem.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chloroform	Sigma-Aldrich	650498	Stored at -20°C !Caution chloroform has acute potential health effects, skin irritation and possible chemical burns, irritation to the respiratory system, may affect the kidneys, liver, heart. Wear suitable protective glasses, clothing and gloves, work in a fume hood.
Methanol	Sigma-Aldrich	34860	Stored at -20°C !Caution Methanol may cause respiratory tract, skin and eye irritation, may damage the nerves, kidneys and liver. Wear suitable protective glasses, clothing and gloves, work in a fume hood.
Purified water from Millipore	Milli-Q		Water purification system.
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	L6026	!Caution SDS causes acute toxicity and is flammable. It is a skin, eye and airway irritant. Wear gloves and safety glasses.
Soil protein extraction kit	MoBio, NoviPure Soil Protein Extraction Kit, Qiagen	30000-20
DL-dithiothreitol	Sigma-Aldrich	43815
1M Trizma HCL	Sigma-Aldrich	T2694
Trichloroacetic acid	Sigma-Aldrich	T0699	!Caution TCA is caustic, toxic and may cause skin burns. Wear gloves and safety glasses.
Acetone	Sigma-Aldrich	650501	Stored at -20°C !Caution Acetone may cause respiratory tract and skin and eye irritation. Flammable liquid and vapor. Wear safety glasses gloves and a lab coat, work in a fume hood.
Urea	Sigma-Aldrich	208884	!Caution Urea is an eye and skin irritant, use gloves and safety glasses
Ammonium bicarbonate	Fluka	09830
Trypsin	Promega	V528A	20µg vials
Bicinchoninic acid protein assay kit	Pierce	23227
Ammonium Formate	Sigma-Aldrich	09735
Acetonitrile	Sigma-Aldrich	34998	!Caution Acetonitrile is a skin and eye irritant. Highly flammable. Wear gloves and safety glasses. Work in a fume hood.
Trifluoroacetic acid	Sigma-Aldrich	T6508	!Caution TFA is extremely hazardous in case of skin contact, eye contact, ingestion and inhalation. May produce tissue damage particularly on mucous membranes of eyes, mouth and respiratory tract. Skin contact may produce burns. Wear gloves, lab coat, safety glasses and work in a fume hood.
Methoxyamine hydrochloride	Sigma-Aldrich	226904	!Caution Methoxyamine hydrochloride causes severe burns and serious damage to eyes, may cause sensitization by skin contact. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood.
Pyridine	Sigma-Aldrich	270970	!Caution Pyridine can cause skin and eye irritation, central nervous system depression. Vapor may cause flash fire. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood.
N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide with 1% trimethylchlorosilane	Sigma-Aldrich	69478	!Caution MSTFA + 1% TMCS can cause skin corrosion, serious eye damage and specific target organ toxicity. Flammable liquid and vapor. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood.
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9541
Milli-Q water purification system	Millipore		model MPGP04001
Vortex	Scientific Industries	SI-0236	Vortex Genie 2
Probe sonicator	FisherBrand		model FB505
Refrigerated centrifuge	Eppendorf		model 5810R
50mL tube swinging bucket rotor	Eppendorf	A-4-44
50mL fixed angle rotor	Eppendorf	FA-45-6-30
Balance	OHAUS		model V22PWE150IT
Serological pipette controller	Eppendorf	12-654-100
10mL, 25mL glass serological pipettes	FisherBrand	13-678-27F, 13-678-36D
Thermomixer with Thermotop	Eppendorf	5382000015, 5308000003
0.9 – 2.0 mm blend stainless steel beads	NextAdvance	SSB14B
0.15 mm garnet beads	MoBio	13122-500
Magnetic stir plate	FisherBrand	11-100-16SH
Magnetic stir bar	FisherBrand	14512130
pH paper strips, pH range 0–14	FisherBrand	M95903
15mL, 50mL conical polypropylene centrifuge tube	Genesee Scientific	21-103 21-108	chloroform compatible
50mL vortex attachment	MoBio	13000-V1-50
Ice bucket	FisherBrand	02-591-44
27.25x70mm glass vials	FisherBrand	03-339-22K
Breathe Easier plate membranes	Midwest Scientific	BERM-2000
Alcohol wipes	Diversified Biotech	BPWP-1000
Heater shaker incubator	Benchmark, Incu-Shaker Mini
Analog rotisserie tube rotator	SoCal BioMed, LLC	82422001
Filter-Aided-Sample-Prep kit	FASP; Expedeon	44250
Microplate reader	Biotek, EPOCH
-20 Degree Celsius Freezer	Fisher	13986149
-80 Degree Celsius Freezer	Stirling Ultracold	SU78OUE
Q-Exactive ion trap mass spectrometer	Thermo Scientific
Agilent 7890A gas chromatograph coupled with a single quadrupole 5975C mass spectrometer	Agilent Technologies, Inc.
LTQ-Orbitrap Velo	Thermo Scientific
Waters NanoEquityTM UPLC system	Millford, MA
250mL media bottle	FisherBrand	1395-250
Waters vial	Waters	186002805
Glass MS sample vial and inserts	MicroSolv	9502S-WCV, 9502S-02ND
Glass HPLC vial and snap caps	MicroSolv	9512C-0DCV, 9502C-10C-B
HPLC 96-well plate	Agilent	5042-6454
Large glass vial 27.25x70mm	FisherBrand	03-339-22K
Lyophilizer	Labconco	7934021
Polished stainless steel flat head spatula	Spoonula; FisherBrand	14-375-10
Kim wipes	Kimberly-Clark	34721
XBridge C18, 250x4.6 mm, 5 μM with 4.6x20 mm guard column	Waters	186003117, 186003064
Agilent 1100 series HPLC system	Agilent Technologies	G1380-90000
1.7mL centrifuge tube	Sorenson	11700
Hamilton Glass Syringes, 5mL, 50µL and 250µL	Hamilton	81517, 80975, 81175
Pasteur Pipettes	FisherBrand	13-678-20A
Pasteur Pipette Bulbs	Sigma-Aldrich	Z111597
Bath Sonicator	Branson 1800 Ultrasonic Cleaner
Vacuum Centrifuge	Labconco Centrivap Acid-Resistant Concentrator System
MicroSpin Columns, C18 Silica	The Nest Group	SEM SS18V