Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Isolatie van cerebrale haarvaten van verse menselijk hersenweefsel

12.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/57346

⸱

12 september 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Sanders-Brown Center on Aging, Department of Pharmacology and Nutritional Sciences, University of Kentucky, 2Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of Kentucky, 3Department of Neuroscience, University of Kentucky

In dit artikel

Samenvatting

Geïsoleerde hersenen haarvaten van menselijk hersenweefsel kunnen worden gebruikt als een preklinische model om te studeren barrièrefunctie fysiologische en pathofysiologische omstandigheden. Hier presenteren we een geoptimaliseerde protocol om te isoleren van de hersenen haarvaten van verse menselijk hersenweefsel.

Samenvatting

Inzicht in functie van de bloed - hersenbarrière fysiologische en pathofysiologische omstandigheden is cruciaal voor de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën die de belofte houdt verbeteren hersenen drug, verbetering van de bescherming van de hersenen, en behandelen van hersenen stoornissen. Echter, het bestuderen van de menselijke bloed - hersen barrière-functie is uitdagend. Dus, is er een cruciale behoefte aan passende modellen. In dit verband vertegenwoordigen hersenen haarvaten geïsoleerd van menselijk hersenweefsel een uniek instrument om te studeren barrièrefunctie als dicht bij de mens in vivo situatie mogelijk. Hier beschrijven we een geoptimaliseerde protocol om te isoleren van de haarvaten van menselijk hersenweefsel op een hoog rendement en met constante kwaliteit en zuiverheid. Haarvaten zijn geïsoleerd uit verse menselijk hersenweefsel met mechanische homogenisering, dichtheid-verloop centrifugeren en filtratie. Na het isolement, kunnen de haarvaten van het menselijk brein worden gebruikt voor diverse toepassingen waaronder lekkage testen, levende cel imaging en immuun-gebaseerd testen aan studie eiwit expressie en functie, enzymactiviteit of intracellulaire signalering. Geïsoleerde menselijke hersenen haarvaten zijn een uniek model voor het ophelderen van de regulering van de functie van menselijk bloed - hersenbarrière. Dit model kan inzicht verwerven in het centrale zenuwstelsel (CNS) pathogenese, die bij de ontwikkeling van therapeutische strategieën helpen zal voor de behandeling van aandoeningen van de CNS.

Inleiding

De bloed - hersen-barrière is een strak gecontroleerde interface tussen het bloed en de hersenen die bepaalt wat er in en uit de hersenen komt. Anatomisch, endotheliale cellen componeren van de bloed - hersenbarrière en vormt een complexe, voortdurende capillaire netwerk. Fysiologisch, levert dit capillaire netwerk de hersenen met zuurstof en voedingsstoffen terwijl tegelijkertijd verwijdering van kooldioxide en afvalstoffen stofwisselingsproducten. Nog belangrijker is, ondersteunt bewijs dat de wijzigingen in de barrière aan vele ziekten bijdragen, waaronder de ziekte van Alzheimer, epilepsie en beroerte1,2,3,4,5 , 6 , 7. hersenen endotheliale cellen ook als een belemmering voor de behandeling dienen door het blokkeren van opname van de drug in de hersenen, bv., chemotherapie van glioblastoma multiforme na tumor resectie8,9, 10. In dit verband geïsoleerde menselijke hersenen haarvaten vertegenwoordigen een unieke ex vivo bloed - hersenbarrière model dat sterk lijkt op barrière eigenschappen in vivo, die het mogelijk voor de studie van de barrièrefunctie en dysfunctie in gezondheid maakt en ziekte. In dit artikel geven wij een protocol om te isoleren van de haarvaten van de hersenen van menselijke hersenen op een constant hoog capillaire kwaliteit en opbrengst om te bestuderen van de bloed - hersenbarrière.

In 1969, Siakotos et al. 11 waren de eersten die het verslag van het isolement van de haarvaten van de hersenen van runderen en menselijk hersenweefsel met behulp van dichtheid kleurovergang centrifugeren en glazen kraal kolom scheiding. Later, Goldstein et al. Deze methode verbeterd 12 door het toevoegen van meerdere filtratie stappen om te verminderen van de hoeveelheid weefsel te bestuderen van de haarvaten van de hersenen van ratten, geïsoleerd met behoud van de metabole activiteit van glucose vervoer nodig. Sindsdien onderzoekers geoptimaliseerd de capillaire isolatie procedure talloze malen, verbetering van de methode en de hersenen capillaire model met elke iteratie13,14,15. Bijvoorbeeld, Pardridge et al. 16 boviene haarvaten met behulp van enzymatische spijsvertering in plaats van mechanische homogenisering geïsoleerd, en dan vervolgens doorgegeven een capillaire schorsing door een 210 µm mesh filter en een glazen kraal kolom. Deze wijzigingen de trypan blauwe uitsluiting vlek van geïsoleerde hersenen haarvaten verbeterd en dus verhoogd endothelial cel levensvatbaarheid. In de vroege jaren 1990, Dallaire et al. 17 geïsoleerd runderen en rat haarvaten, die waren duidelijk van neuronale besmetting en onderhouden metabole activiteit of alkalische fosfatase en Gamma-glutamyl transferase (γ-GTase). In 2000, Miller et al. 18, gebruikt geïsoleerde rat en varkens hersenen haarvaten in combinatie met confocale microscopie te tonen van de accumulatie van vervoer substraten in het lumen van de haarvaten. Vervolgens ons laboratorium doorgegaan met het optimaliseren van de hersenen capillaire isolatie procedure en wij hebben vastgesteld dat vervoer testen om te bepalen van P-glycoproteïne (P-gp)19,20,21, borstkanker weerstand eiwit (BCRP)22,23, en meerdere drugweerstand eiwit 2 (Mrp2)24 vervoersactiviteit. In 2004 publiceerden we twee verslagen waar we gewend geïsoleerde rat hersenen haarvaten verschillende signaalroutes onderzoeken. In Hartz et al. 21, vonden we dat de peptide endothelin-1 snel en omkeerbaar verminderd P-gp vervoer functie in de haarvaten van de hersenen door te handelen via de endothelin receptor B (ETB) receptor, stikstofoxide synthase (NOS) en proteïne kinase C, (PKC). In Bauer et al. 19, we toonden expressie van de nucleaire receptor pregnane X receptor (PXR) en toonde PXR-modulatie van P-gp expressie en vervoer functie in de haarvaten van de hersenen. In experimenten met transgene gehumaniseerd PXR muizen, we uitgebreid deze lijn van onderzoek en toonde in vivo aanscherping van het blok door upregulating P-gp via hPXR activering25. In 2010, Hartz et al. 26 gebruikt deze aanpak om te herstellen van P-gp eiwit expressie en vervoer van activiteit in transgene menselijke amyloïde precursor proteïne (hAPP) muizen die overexpress hAPP. Bovendien verminderd herstellen van P-gp in hAPP muizen aanzienlijk bèta amyloid (Aβ)40en Aβ42hersenen niveaus.

Naast het studeren signaalroutes, kunnen geïsoleerde hersenen haarvaten worden gebruikt voor het bepalen van de veranderingen in de capillaire permeabiliteit die wij capillaire lekkage noemen. In het bijzonder wordt de bepaling van de lekkage Texas Red gebruikt ter beoordeling van de lekkage van de fluorescente kleurstof Texas Red van de capillaire lumen in de tijd en deze gegevens worden vervolgens gebruikt voor het analyseren van lekkage tarieven. Verhoogde capillaire lekkage tarieven in vergelijking met die van controle haarvaten geven wijzigingen in de fysieke integriteit van de bloed - hersen barrière-2. Dit is waardevol, want er talrijke ziekte staten gekoppeld barrière ontwrichting, BV zijn., epilepsie, multiple sclerose, ziekte van Alzheimer en traumatische hersenen letsel27,28,29, 30. Andere groepen hebben ook gebruikt voor geïsoleerde haarvaten te onderscheiden signaalroutes die eiwit expressie en vervoersactiviteit van proteïnen31,32,33,34regelen, 35,,36,,37. Tot slot, wij zijn blijven om het optimaliseren van deze methode voor de isolatie van menselijke hersenen haarvaten en onlangs, toonden wij verhoogde P-gp expressie op het menselijke bloed - hersenbarrière bij patiënten met epilepsie in vergelijking met inbeslagneming-gratis controle individuen38 . Samen genomen, tonen deze ontwikkelingen dat geïsoleerde hersenen haarvaten als een veelzijdig model om te studeren barrièrefunctie kunnen dienen.

Verschillende in vivo, ex vivoen in vitro de bloed - hersen barrière-modellen zijn gebruikt in basisonderzoek en industriële drug screening, hoofdzakelijk met het doel van de tests van de drug levering aan de hersenen39,40,41 ,42,43,44. Naast geïsoleerde ex vivo de haarvaten van de hersenen omvatten actuele modellen van de bloed - hersenbarrière in silico modellen, in vitro de cultuur van de cel van geïsoleerde capillaire endothelial hersencellen of vereeuwigd cellijnen uit verschillende soorten, in vitro cultuur van menselijke pluripotente stamcellen (hPSC) dat onderscheid in hersenen capillaire endotheliale cellen en microfluidic modellen op een chip.

In silico modellen zijn het meest gebruikt in Geneesmiddelenontwikkeling voor het selecteren van drugkandidaten op basis van het voorspelde absorptie, distributie, metabolisme en uitscheiding (ADME) eigenschappen. Methoden zoals kwantitatieve structuur-eigenschap relatie (QSPR) en kwantitatieve structuur-activiteit relatie (QSAR) modellen zijn populaire methoden in high-throughput screening van bibliotheken gebruikt om te voorspellen hersenen penetratie van drugkandidaten 45 , 46. deze modellen zijn nuttig voor scherm moleculen voor barrière penetratie eigenschappen.

Betz et al. 47 opgericht monolayers van gekweekte capillaire endothelial hersencellen als een in vitro -systeem van het bloed - hersen barrière-model. In vitro cel cultuur modellen met behulp van vers weefsel of vereeuwigd endothelial cellijnen zoals menselijke cerebrale microvessel endotheliale cellen (hCMECs) kunnen een ander high-throughput screening hulpmiddel voor hersenen penetratie of mechanistische studies. Echter, hersenen capillaire endothelial cel cultuur modellen ontbreken de fysiologische schuifspanning van de bloedstroom in de capillaire lumen, zijn beperkt in het algemeen biologische complexiteit en ondergaan veranderingen in expressie en lokalisatie van belangrijke barrière onderdelen zoals tight junction eiwitten kanalen oppervlakte receptoren, vervoerders, enzymen en ion48,49,50. Omgekeerd, endotheel monolayers afgeleid van hPSCs, hebben lage sacharose permeabiliteit in vergelijking met hCMEC/D3 culturen en gepolariseerde expressie van sommige vervoerders van de bloed - hersen barrière, celadhesie-moleculen en strakke kruispunten51, bevatten 52. echter deze cellen ook onderhevig is aan veranderende eigenschappen in de cultuur, en het systeem moet worden gevalideerd voor haar recapitulatie van in vivo barrière eigenschappen52.

Nieuwere tendensen in de bloed - hersenbarrière onderzoek omvatten met behulp van 3D weefselkweek systemen tot kunstmatige haarvaten, met behulp van de orgel-op-spaander technologie voor het genereren van microfluidic apparaten, of met behulp van de holle vezel technologie53, 54 , 55. kunstmatige haarvaten, hebben echter aanzienlijk grotere diameters (100 – 200 µm) dan hersenen haarvaten (3-7 µm). Vandaar, de shear krachten in vitro doen niet volledig lijken op de in vivo situatie. Dit wordt behandeld in "blood-brain-barrier-on-a-chip" microfluidic apparaten, waar kunstmatige membranen formulier "bloed" en "brein" compartimenten en vloeistoffen door deze apparaten genereren microfluidic shear krachten worden gepompt. Ook zijn mede culturen van endotheliale cellen in verschillende combinaties met astrocyten en vasculaire zachte spiercellen ook gebruikt met de holle vezel technologie te herscheppen Rheologische parameters aanwezig onder in vivo voorwaarden56 , 57 , 58. het is echter onduidelijk hoe goed dit model dat andere eigenschappen van de bloed - hersenbarrière zoals vervoer, metabolisme, signalering en anderen weerspiegelt. Deze kunstmatige capillair en chip modellen zijn geschikt voor high-throughput screening van drugs, maar de cellen die worden gebruikt voor het genereren van deze modellen kunnen ook worden gewijzigd tijdens de cultuur.

Bevroren en vaste hersenen segmenten of primaire hersenen capillaire endothelial celculturen zijn extra modellen die kunnen worden gebruikt voorhet bestuderen van de menselijke microvasculature5,59,60,,61. Bijvoorbeeld, immunohistochemistry van vaste hersenweefsel wordt gebruikt om te bepalen eiwit lokalisatie en expressie in gezonde vergeleken met zieke weefsel.

Naast weefsel segmenten en de in vitro -modellen kunnen zoals hierboven beschreven, vers geïsoleerde hersenen haarvaten worden gebruikt om het bestuderen van de bloed - hersenbarrière functie. Beperkingen van dit geïsoleerde capillaire model omvatten de moeilijkheid om op te halen van de verse menselijk hersenweefsel, afwezigheid van neuronen, astrocyten en een relatief tijdrovend isolatie-proces. Een voordeel van het geïsoleerde hersenen capillaire model is dat dit model veel overeenkomsten vertoont met de situatie in vivo en daarom kan worden gebruikt voor het karakteriseren van de barrièrefunctie en dysfunctie. Nog belangrijker is, kan het ook worden gebruikt om te onderscheiden van signalering mechanismen met behulp van een veelheid aan tests en moleculaire technieken3,19,62,,63.

Ons laboratorium heeft toegang tot beide verse en diepgevroren menselijk hersenweefsel door het centrum van Sanders-Brown op veroudering (IRB #B15-2602-M)64. In dit verband lijkschouwingen volgen een standaardprotocol, hersenen worden verkregen < 4 h, en alle procedures in overeenstemming zijn met de NIH Biospecimen richtsnoeren voor beste praktijken65. Deze unieke toegang krijgen tot menselijk hersenweefsel, wij opgericht en een protocol om te isoleren van de hersenen haarvaten van menselijk hersenweefsel die in een hoog rendement van intact, haalbare menselijke hersenen haarvaten resulteert geoptimaliseerd. Twee gemeenschappelijke eindpunten van belang zijn de eiwituitdrukking en activiteit te bepalen. In dit verband hebben wij en anderen verschillende tests die kunnen worden gebruikt met geïsoleerde hersenen haarvaten aan studie eiwit expressie en activiteitenniveaus vastgesteld. Deze testen omvatten westelijke bevlekken, eenvoudige Western assay, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), omgekeerde transcriptie polymerasekettingreactie (RT-PCR), kwantitatieve polymerase-kettingreactie (qPCR), zymography, vervoer activiteit testen, en capillaire lekkage testen. Deze tests kunnen onderzoekers te bestuderen veranderingen in functie als barrière in menselijke pathologische voorwaarden, trajecten waaraan eiwit expressie en activiteit te bepalen, en identificeren van farmacologische doelstellingen voor de behandeling van de bloed - hersen barrière gekoppeld ziekten.

Genomen samen, vers geïsoleerde hersenen haarvaten kunnen dienen als een robuuste en reproduceerbare model van de bloed - hersenbarrière. Vooral, kan dit model worden gecombineerd met veel verschillende testen om te bepalen van een breed scala van eindpunten te bestuderen barrièrefunctie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De informatie hieronder is gebaseerd op de huidige veiligheids- en wettelijke normen aan de Universiteit van Kentucky, Lexington, KY, Verenigde Staten. Als voorzorgsmaatregel inzake veiligheid, verwijzen naar de biologische veiligheidsprogramma van de instelling en de meest recente verordeningen en aanbevelingen voor het werken met menselijk weefsel.

Let op: Menselijk weefsel kan ook een bron van bloed overgedragen ziekteverwekkers, met inbegrip van het humaan immunodeficiëntie virus (HIV), hepatitis B-virus (HBV), hepatitis C-virus (HCV) en anderen. Werken met menselijk weefsel brengt het risico van infectie door bloed overgebrachte ziekteverwekkers. Bepaalde overwegingen regelgevings- en veiligheid zijn dus noodzakelijk bij het werken met menselijk weefsel te beschermen van laboratoriumpersoneel. Werken met menselijk weefsel in de VS vereist een niveau 2-laboratorium van bioveiligheid, alsmede voorzorgsmaatregelen betreffende veiligheid en opleiding overeenkomstig NIH sectie IV-B-7, OSHA Act van 1970-component 5(a)(1) en van de gebruiker institutionele biologische veiligheidsprogramma. In het algemeen, moet institutionele bioveiligheid Comité en/of institutionele Review Board goedkeuring worden verkregen voorafgaand aan een onderzoek waarbij menselijke materialen (weefsels, lichaamsvloeistoffen). De opleiding is vereist voor alle personeelsleden die werken met menselijke materialen en omvat basic Labor veiligheidstraining, bijvoorbeeld, chemische hygiëne en laboratorium veiligheid, evenals specifieke opleiding inzake biologische veiligheid, gevaarlijke afvalstoffen, en mens door bloed overgedragen ziekteverwekkers. Al het personeel werken met menselijke materialen zijn sterk aanbevolen om Hepatitis B vaccinaties, voorafgaand aan het werken met menselijke materialen. Personeel zijn verplicht te dragen specifieke persoonlijke beschermingsmiddelen tijdens het werken met menselijk materiaal, bijv., een radialis laboratoriumjas en een gezicht schild, en draag handschoenen te allen tijde. Alle werk wordt uitgevoerd in een kabinet bioveiligheid (klasse 2). Alle apparatuur die in contact met menselijk materiaal en ieder afval uit menselijke materialen komt is behandeld om te voorkomen dat besmetting en/of besmetting van personeel. Alle apparatuur en oppervlakken worden schoongemaakt met 10% bleekwater en 75% ethanol na elke procedure waarbij menselijke materialen. Een lekkage met menselijke materialen moet onmiddellijk worden gereinigd. Glaswerk is een gesteriliseerde met autoclaaf na elk gebruik. Afval, met inbegrip van nietgefixeerde menselijk weefsel, is verzameld in een afval zak van gelabelde biohazard en gesteriliseerde met autoclaaf. Scherpe instrumenten worden verzameld in een container van de punctie - en lekvrije aangeduid als biohazardous. Alle afvalstoffen van menselijke materialen worden verwijderd volgens de biologische veiligheidsvoorschriften van de instelling.

Opmerking: Ons laboratorium verkrijgt verse frontale cortex monsters van overleden personen door het centrum van Sanders-Brown op veroudering (IRB #B15-2602-M). Inclusie criteria zijn: inschrijving in het UK-ADC autopsie longitudinale cohortstudie en een Post-Mortem-Interval (PMI) ≤4 h64. Lijkschouwingen volgen een standaard protocol en alle procedures voldoen aan NIH Biospecimen richtsnoeren voor beste praktijken65. Een korte PMI van minder dan 4 h is van hoogste belang om capillaire levensvatbaarheid na isolatie. Zowel vers als diepgevroren weefsel kan worden gebruikt. Als bevriezing nodig is, vers verkregen menselijk hersenweefsel moet schok-ingevroren in vloeibare stikstof en opgeslagen bij-80 ° C. Verse of ontdooide weefsel moet worden opgeslagen in de buffer van de isolatie (zie hieronder) en snel verwerkt. Wij vinden dat 10 g verse menselijk weefsel opbrengsten ongeveer 100 mg van hersenen haarvaten (versgewicht).

1. setup

  1. Voorbereiding van de buffer
    Opmerking: De omvang van de buffer nodig afhankelijk van de hoeveelheid weefsel. Alle volumes van de buffer in de onderstaande voorschriften zijn gebaseerd op 10 g van menselijk hersenweefsel van de cortex.
    1. L geïsoleerd Buffer: 1,5 L Dulbecco van fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS; 2,7 mM KCl, 1,47 mM KH2PO4, 136.9 mM NaCl, 8.1 mM nb2HPO4, 0,9 mM CaCl2, 0.49 mM MgCl2) gebruiken en aan te vullen met 5 mM D-glucose (1,35 g ) en 1 mM natrium pyruvaat (0.165 g). Na toevoeging van glucose en pyruvaat, aangepast aan de pH 7.4 met natriumhydroxide. Afkoelen en bewaar de buffer 4 ° C vóór gebruik.
    2. Bovien serumalbumine (BSA): Voeg 10 g BSA poeder aan 1 L geïsoleerd buffer om een eindconcentratie van de BSA van 1%. Roer langzaam om luchtbellen te vermijden, aanpassen op een pH van 7,4 en bewaren bij 4 ° C's nachts. Onmiddellijk voorafgaand aan het gebruik, voorzichtig roeren; Vermijd bubbels Voorkom albumine denaturatie vormen.
    3. kleurovergang medium dichtheid: Weeg 18 g van de kleurovergang medium dichtheid in een glazen fles en een magnetische roer-balk toe te voegen. Voeg 60 mL isolatie buffer en schud krachtig gedurende 5 min, tot alle poeder is geschorst. Winkel 's nachts bij 4 ° C om het medium dichtheid kleurovergang te ontbinden. Roer gedurende 10 min vlak voor gebruik.
    4. Opslaan van alle buffers bij 4 ° C; Houd alle tools en buffers op ijs tijdens de gehele isolatie-procedure. Roer alle buffers vóór gebruik.
  2. Experimentele opstelling
    1. Monteer de stamper van de Potter-Elvehjem weefsel molen op de elektronische Bovenroerder. Plaats de Potter-Elvehjem weefsel grinder en de Dounce homogenizer met stamper op ijs onder de motorkap. Bereiden van een 300 µm filter maaswijdte (5 x 5 cm2), vouw het tot een kegel, invoegen en koppelen aan een 50 mL Falcon buis met tape (figuur 1A).
    2. Plaats van de aansluitende ringen en cel van de stam filters (porie grootte: 30 µm) op 50 mL Falcon buizen. Biohazardous afval zakken voor te bereiden. Plaats alle benodigde apparatuur in het biosafety kabinet (Zie Tabel van materialen).

2. bereiding van de monsters van de hersenen

Opmerking: Figuur 1A ziet u op de grafiek van de werkstroom van de hieronder beschreven procedure voor de gehele isolatie. Menselijk hersenweefsel kan voortvloeien uit enig deel van de cortex en kan worden gebruikt, vers of bevroren. Bevroren hersenweefsel kan worden ontdooid bij kamertemperatuur (geen buffer; ~ 30 min. voor 10 g). Vergelijkbare om resultaten te bereiken, moet het hersenweefsel worden verkregen uit de dezelfde regio van de hersenen voor elk experiment. Dit protocol is geoptimaliseerd voor vers (PMI < 4 h) menselijke hersenschors die heeft niet bevroren.

  1. Voorbereiding van menselijk hersenweefsel: Document van het gewicht van het hersenweefsel. Alle getallen in het volgende protocol zijn geschikt voor 10 g verse menselijk hersenweefsel. Plaats het hersenweefsel in een petrischaal van 100 mm. Verwijder voorzichtig alle de hersenvliezen met een tang. Gebruik een scalpel afgesneden van de witte stof.
  2. Hakken van het menselijk hersenweefsel: zorgvuldig uitgesneden van het hersenweefsel en het gehakt met een scalpel. Gehakt voor ongeveer 5 minuten (2 – 3 mm stuks). Het hersenweefsel overbrengen in de Potter-Elvehjem weefsel molen. Voeg 30 mL isolatie buffer.
    Opmerking: De stukken gehakt weefsel zijn moeilijk te zien omdat het hersenweefsel in mush door het hakken proces verandert.

3. homogenisering

  1. Potter-Elvehjem weefsel slijper (goedkeuring: 150 – 230 µm): Meng van elk monster met 100 lijnen met een snelheid van de homogenizer van 50 rpm. Het document van de tijd elke 25 lijnen en de totale tijd die nodig is voor 100 slagen. Zie tabel 1 voor een voorgestelde homogenisering protocol; de totale tijd voor homogenisatie van 10 g van menselijke frontale cortex is ongeveer 22 min. Niet roer in de lucht om te voorkomen dat de bubbels.
  2. Dounce homogenizer (goedkeuring: 80-130 µm): het homogenaat overbrengen in een Dounce homogenizer op ijs. Meng de vering met 20 lijnen (~ 6 s/lijn, totaal van ~ 2 min). Vermijd bellen.

4. centrifugeren

  1. De hersenen homogenaat gelijkmatig moeten verdelen in vier 50 mL centrifugeren buizen en document het totale volume van het homogenaat. 50 mL dichtheid kleurovergang buffer verdelen over het centrifugeren buizen (12,5 mL per buis). Gebruik 10 mL voor isolatie buffer te spoelen van de stamper en de homogenizer, en verdelen over de vier centrifugeren buizen (~2.5 mL per buis).
  2. Strak sluit de centrifuge buizen met doppen. Meng de homogenaat kleurovergang medium dichtheid en de buffer door krachtig schudden van de buizen. Centrifugeer bij 5.800 x g gedurende 15 minuten staan bij 4 ° C (vaste hoek rotor); Selecteer de snelheid van een middelgrote vertraging te houden van de pellet gekoppeld aan de buis. Verwijder het supernatant en resuspendeer elke pellet in 2 mL zuiver 1% BSA.

5. filtratie

Opmerking: Om te scheiden van de haarvaten van rode bloedcellen en andere cel puin, verschillende filtratie stappen nodig zijn.

  1. 300 µm mesh: filteren na opnieuw door de pellet te schorten, de opschorting door de Maas 300 µm. Haarvaten zijn gefilterd door de Maas, overwegende dat grotere schepen en grotere hersenen puin op de Maas blijven. De Maas met maximaal 50 mL 1% BSA grondig te wassen. Het negeren van de Maas.
    Opmerking: Deze stap filtratie wist de capillaire schorsing van grotere schepen of brokken van hersenen puin.
  2. 30 µM cel stam filter
    Opmerking: Deze stap filtratie scheidt haarvaten van rode bloedcellen en andere hersenen puin.
    1. Distribueer het capillaire filtraat uit stap 6.1 via de vijf 30 µm cel stam filters (ongeveer 10 mL capillaire filtraat per cel stam filter). Haarvaten zijn tegengehouden door dit filter, overwegende dat de rode bloedcellen, andere afzonderlijke cellen en kleine hersenen puin het filter passeren en verzameld in het filtraat zijn.
    2. Elk filter met 25 mL van de 1% BSA wassen. Daarna giet alle filtraten het zesde filter te verhogen van het rendement. Wassen van elk filter met 50 mL van de 1% BSA; Houd de cel stam filters met die van de haarvaten en negeren het filtraat.

6. capillaire collectie

  1. De filters ondersteboven en wassen van de haarvaten met 50 mL van de 1% BSA voor elk filter in 50 mL buizen. Zachtjes toepassen van druk met het uiteinde van de pipet van een 5 mL-pipet en verplaats het over het filter voor het afwassen van de haarvaten van de hersenen.
  2. Zorg ervoor dat alle haarvaten van de hersenen, vooral vanuit de rand van het filter afwassen. Vermijd bellen omdat dit het proces filtratie bemoeilijkt en de kans op capillaire verlies verhoogt.

7. wassen

  1. Na het verzamelen van de haarvaten, centrifugeren alle monsters bij 1.500 x g gedurende 3 min bij 4 ° C (swingende emmer rotor). Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in ongeveer 3 mL isolatie buffer. Combineer alle geresuspendeerde pellets uit één monster in een conische tube van 15 mL en vullen met isolatie buffer. Centrifugeer nogmaals bij 1.500 x g gedurende 3 min bij 4 ° C en twee keer wassen.
  2. Het document van de capillaire zuiverheid met een microscoop (100 X vergroting) en de camera (figuur 1B).
    Opmerking: De hersenen capillaire opbrengst van 10 g van menselijk hersenweefsel is meestal ongeveer 100 mg. De haarvaten geïsoleerde hersenen kunnen nu worden gebruikt voor experimenten, verwerkt (bv., lysate, membraan isolatie), of flash-bevroren en opgeslagen bij-80 ° C in cryotubes voor een minimum van 6 – 12 maanden (Vermijd meerdere bevriezen-ontdooien cycli).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De isolatie van menselijk hersenweefsel opbrengst een schorsing in menselijke hersenen haarvaten (figuur 1B) verrijkt met kleine hoeveelheden van grotere schepen, rode bloedcellen, andere afzonderlijke cellen en enkele cel puin. Sommige haarvaten zijn vertakt en, in sommige, rode bloedcellen zijn gevangen in de capillaire lumen. Het typische capillair heeft een diameter van 3 – 7 µm en is ongeveer 100-200 µm lang met open lumen; meeste capillaire eindigt zijn...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit protocol beschrijft het isolement van intact en levensvatbare menselijk brein haarvaten van vers weefsel. In dit gedeelte bespreken we in detail de volgende: 1) wijzigingen in het protocol 2) oplossen van veel voorkomende fouten, 3) beperkingen van de techniek, 4) de betekenis van het model met betrekking tot bestaande en alternatieve bloed - hersenbarrière modellen, en 5). mogelijke toepassingen voor geïsoleerde menselijke hersenen haarvaten.

Het protocol hier beschreven is geoptimaliseer...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Wij danken en erkennen van Dr. Peter Nelson en Sonya Anderson in de UK-ADC hersenen weefselbank voor het verstrekken van alle menselijke hersenen weefselmonsters (NIH grant nummer: P30 AG028383 van het National Institute on Aging). Wij danken Matt Hazzard en Tom Dolan, Information Technology Services, academische technologie en de betrokkenheid van de faculteit, Universiteit van Kentucky voor grafische bijstand. Dit project werd ondersteund door subsidie nummer 1R01NS079507 van het nationale Instituut van Neurological Disorders and Stroke (naar B.B.) en nummer 1R01AG039621 van de subsidie van het National Institute on Aging (te A.M.S.H.). De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de officiële standpunten van het National Institute of Neurological Disorders en lijn of het nationale Instituut op veroudering. De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM)
Diamond Grip Plus Latex Handschoenen, Microflex MediumVWR, Radnor, PA, VS32916-636PBM
Wegwerp beschermende laboratoriumjassenVWR, Radnor, PA, VS470146-214PBM; vanwege de aard van het menselijk bronnenmateriaal wordt het aanbevolen om een wegwerp laboratoriumjas te dragen
Gezichtsbescherming, wegwerpbaarThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, VS19460102PBM; vanwege de aard van het menselijk bronnenmateriaal wordt het aanbevolen om een wegwerp gezichtsbescherming te dragen
Veiligheidsmaterialen
Clavies Hoge Temperatuur Autoclaafzakken 8 x 12Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, VS01-815-6
Versi Dry Bench Papier 18" x 20"Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, VS14-206-32om werkgebieden te bedekken
VWR Sharps Container SystemenThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, VS75800-272voor gebruikte scalpels
Bleekmiddel 8,2% Clorox Germicidal 64 oz.UK Supply Center, Lexington, KY, VS323775
Apparatuur
4 °C KoelkastThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, VS13-986-148
Accume BASIC AB15 pH MeterThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, VSAB15
Heidolph RZR 2102 ControlHeidolph, Elk Grove Village, IL, VS501-21024-01-3
Sorvall LEGEND XTR CentrifugeThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, VS75004521
Leica L2 Dissecting MicroscoopLeica Microsystems Inc, Buffalo Grove IL, VSgebruikt om meninges te verwijderen
POLYTRON PT2500 HomogenisatorKinematica AG, Luzern, Zwitserland9158168
Schaal P-403Denver Instrument, Bohemia, NY, VS0191392
Standard mini StirThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, VS1151050
Thermo-Flasks Vloeibare Stikstof DewarThermal Scientific, Mansfiled, TX, VS11-670-4Cgebruikt om het weefsel te bevriezen?
Voyager Pro Analytische WeegschaalOHAUS, Parsippany, NJ, VSVP214CN
ZEISS Axiovert MicroscoopCarl Zeiss, Inc Thornwood, NY, VSgebruikt om geïsoleerde capillairen te controleren
Gereedschap en Glaswerk
Finnpipette II Pipet 1-5 mLThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, VS21377823T1was capillairen af op filter
Finnpipette II Pipet 100-1.000 µLThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, VS21377821T1resuspendeer pellet in BSA
Pipet BoyIntegra, Hudson, NH, VS739658
50 mL Falcon tubes 25/rack - 500/csVWR, Radnor, PA, VS21008-951
EISCO Scalpel BladesThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, VSS95938Com hersenweefsel te snijden
PARAFILMVWR, Radnor, PA, VS52858-000om beker en volumetrische fles af te dekken
Thermo Scientific Finntip Pipet Tips 5 mLThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, VS21-377-304om capillairen af te wassen op filter
60 mL spuit met Luer-LokThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, VSBD309653gebruikt met verbindingsring om capillairen te filteren
Scalpel Handgreep #4Fine Science Tools, Foster City, CA, VS10060-13gebruikt voor snijden
Dumont Pincetten #5Fine Science Tools, Foster City, CA, VS11251-10gebruikt om meninges te verwijderen
Potter-Elvehjem WeefselmolenThomas Scientific, Swedesboro, NJ, VS3431E2550 mL volume, helderheid: 150-230 μm
Dounce HomogenisatorVWR, Radnor PA VS62400-64215 mL volume, helderheid: 80-130 μm
Spectra/Mesh Geweven Filters (300 µm)Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA, VS146424Gebruikt om capillairen suspensie te filteren om eventuele meninges die mogelijk achterblijven te verwijderen
pluriStrainers (porengrootte: 30 µm)pluriSelect Life Science, Leipzig, Duitsland43-50030-03
VerbindingsringpluriSelect Life Science, Leipzig, Duitsland41-50000-03meerdere keren herbruikbaar
1 L Volumetrische Flesvoor bereiding van Isolatie Buffer
1 L Bekervoor bereiding van 1% BSA
Reepjesroerdervoor bereiding van 1% BSA en Ficoll®
Schott Fles (60 mL)voor bereiding van Ficoll®
IJsemmerom alles koud te houden
100 mm Petri schotelvoor het snijden van hersenweefsel
Weefselkweek Cel SchraperVWR, Radnor, PA, VS89260-222om supernatant te verwijderen na centrifugatie
Chemicaliën
BSA Fractie V, A-9647Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, VSA9647-500gbereid in DPBS met Ca2+ & Mg2+ de dag ervoor. Vermijd bellen tijdens de bereiding. Bewaar in de koelkast.

Referenties

  1. Aronica, E., et al. Expression and cellular distribution of multidrug resistance-related proteins in the hippocampus of patients with mesial temporal lobe epilepsy. Epilepsia. 45 (5), 441-451 (2004).
  2. Hartz, A. M., et al. Amyloid-β contributes to blood-brain barrier leakage in transgenic human amyloid precursor protein mice and in humans with cerebral amyloid angiopathy. Stroke. 43 (2), 514-523 (2012).
  3. Hartz, A. M., et al. Aβ40 Reduces P-Glycoprotein at the Blood-Brain Barrier through the Ubiquitin-Proteasome Pathway. J Neurosci. 36 (6), 1930-1941 (2016).
  4. Kassner, A., Merali, Z. Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in Stroke. Stroke. 46 (11), 3310-3315 (2015).
  5. Lauritzen, F., et al. Monocarboxylate transporter 1 is deficient on microvessels in the human epileptogenic hippocampus. Neurobiol Dis. 41 (2), 577-584 (2011).
  6. Tishler, D. M., et al. MDR1 gene expression in brain of patients with medically intractable epilepsy. Epilepsia. 36 (1), 1-6 (1995).
  7. van Assema, D. M., et al. Blood-brain barrier P-glycoprotein function in Alzheimer's disease. Brain. 135 (Pt 1), 181-189 (2012).
  8. Oberoi, R. K., et al. Strategies to improve delivery of anticancer drugs across the blood-brain barrier to treat glioblastoma. Neuro Oncol. 18 (1), 27-36 (2016).
  9. Parrish, K. E., et al. Efflux transporters at the blood-brain barrier limit delivery and efficacy of cyclin-dependent kinase 4/6 inhibitor palbociclib (PD-0332991) in an orthotopic brain tumor model. J Pharmacol Exp Ther. 355 (2), 264-271 (2015).
  10. Thomas, A. A., Brennan, C. W., DeAngelis, L. M., Omuro, A. M. Emerging therapies for glioblastoma. JAMA Neurol. 71 (11), 1437-1444 (2014).
  11. Siakotos, A. N., Rouser, G., Fleische, S. Isolation Of Highly Purified Human And Bovine Brain Endothelial Cells And Nuclei And Their Phospholipid Composition. Lipids. 4 (3), 234-239 (1969).
  12. Goldstein, G. W., Wolinsky, J. S., Csejtey, J., Diamond, I. ISOLATION OF METABOLICALLY ACTIVE CAPILLARIES FROM RAT-BRAIN. Journal of Neurochemistry. 25 (5), 715-717 (1975).
  13. Joo, F., Karnushina, I. A procedure for the isolation of capillaries from rat brain. Cytobios. 8 (29), 41-48 (1973).
  14. Joo, F., Rakonczay, Z., Wollemann, M. Camp-Mediated Regulation Of Permeability In Brain Capillaries. Experientia. 31 (5), 582-584 (1975).
  15. Panula, P., Joo, F., Rechardt, L. EVIDENCE FOR PRESENCE OF VIABLE ENDOTHELIAL CELLS IN CULTURES DERIVED FROM DISSOCIATED RAT-BRAIN. Experientia. 34 (1), 95-97 (1978).
  16. Pardridge, W. M., Eisenberg, J., Yamada, T. Rapid Sequestration And Degradation Of Somatostatin Analogs By Isolated Brain Microvessels. Journal of Neurochemistry. 44 (4), 1178-1184 (1985).
  17. Dallaire, L., Tremblay, L., Beliveau, R. Purification And Characterization Of Metabolically Active Capillaries Of The Blood-Brain-Barrier. Biochemical Journal. 276, 745-752 (1991).
  18. Miller, D. S., et al. Xenobiotic transport across isolated brain microvessels studied by confocal microscopy. Molecular Pharmacology. 58 (6), 1357-1367 (2000).
  19. Bauer, B., Hartz, A. M., Fricker, G., Miller, D. S. Pregnane X receptor up-regulation of P-glycoprotein expression and transport function at the blood-brain barrier. Mol Pharmacol. 66 (3), 413-419 (2004).
  20. Bauer, B., Hartz, A. M., Miller, D. S. Tumor necrosis factor alpha and endothelin-1 increase P-glycoprotein expression and transport activity at the blood-brain barrier. Mol Pharmacol. 71 (3), 667-675 (2007).
  21. Hartz, A. M., Bauer, B., Fricker, G., Miller, D. S. Rapid regulation of P-glycoprotein at the blood-brain barrier by endothelin-1. Mol Pharmacol. 66 (3), 387-394 (2004).
  22. Hartz, A. M., Madole, E. K., Miller, D. S., Bauer, B. Estrogen receptor beta signaling through phosphatase and tensin homolog/phosphoinositide 3-kinase/Akt/glycogen synthase kinase 3 down-regulates blood-brain barrier breast cancer resistance protein. J Pharmacol Exp Ther. 334 (2), 467-476 (2010).
  23. Hartz, A. M., Mahringer, A., Miller, D. S., Bauer, B. 17-β-Estradiol: a powerful modulator of blood-brain barrier BCRP activity. J Cereb Blood Flow Metab. 30 (10), 1742-1755 (2010).
  24. Bauer, B., et al. Coordinated nuclear receptor regulation of the efflux transporter, Mrp2, and the phase-II metabolizing enzyme, GSTpi, at the blood-brain barrier. J Cereb Blood Flow Metab. 28 (6), 1222-1234 (2008).
  25. Bauer, B., et al. In vivo activation of human pregnane X receptor tightens the blood-brain barrier to methadone through P-glycoprotein up-regulation. Mol Pharmacol. 70 (4), 1212-1219 (2006).
  26. Hartz, A. M., Miller, D. S., Bauer, B. Restoring blood-brain barrier P-glycoprotein reduces brain amyloid-beta in a mouse model of Alzheimer's disease. Mol Pharmacol. 77 (5), 715-723 (2010).
  27. Erickson, M. A., Banks, W. A. Blood-brain barrier dysfunction as a cause and consequence of Alzheimer's disease. J Cereb Blood Flow Metab. 33 (10), 1500-1513 (2013).
  28. Marchi, N., et al. Consequences of repeated blood-brain barrier disruption in football players. PLoS One. 8 (3), e56805(2013).
  29. Rempe, R. G., Hartz, A. M., Bauer, B. Matrix metalloproteinases in the brain and blood-brain barrier: Versatile breakers and makers. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (9), 1481-1507 (2016).
  30. van Vliet, E. A., et al. Blood-brain barrier leakage may lead to progression of temporal lobe epilepsy. Brain. 130, 521-534 (2007).
  31. Banks, W. A., et al. Tau Proteins Cross the Blood-Brain Barrier. J Alzheimers Dis. 55 (1), 411-419 (2017).
  32. Chan, G. N., et al. et al. In vivo induction of P-glycoprotein expression at the mouse blood-brain barrier: an intracerebral microdialysis study. J Neurochem. 127 (3), 342-352 (2013).
  33. Mesev, E. V., Miller, D. S., Cannon, R. E. Ceramide 1-Phosphate Increases P-Glycoprotein Transport Activity at the Blood-Brain Barrier via Prostaglandin E2 Signaling. Mol Pharmacol. 91 (4), 373-382 (2017).
  34. Ronaldson, P. T., Demarco, K. M., Sanchez-Covarrubias, L., Solinsky, C. M., Davis, T. P. Transforming growth factor-beta signaling alters substrate permeability and tight junction protein expression at the blood-brain barrier during inflammatory pain. J Cereb Blood Flow Metab. 29 (6), 1084-1098 (2009).
  35. Seelbach, M. J., Brooks, T. A., Egleton, R. D., Davis, T. P. Peripheral inflammatory hyperalgesia modulates morphine delivery to the brain: a role for P-glycoprotein. J Neurochem. 102 (5), 1677-1690 (2007).
  36. Sugiyama, D., et al. Functional characterization of rat brain-specific organic anion transporter (Oatp14) at the blood-brain barrier: high affinity transporter for thyroxine. J Biol Chem. 278 (44), 43489-43495 (2003).
  37. Wang, X., et al. Nrf2 upregulates ATP binding cassette transporter expression and activity at the blood-brain and blood-spinal cord barriers. J Neurosci. 34 (25), 8585-8593 (2014).
  38. Hartz, A. M., et al. P-gp Protein Expression and Transport Activity in Rodent Seizure Models and Human Epilepsy. Mol Pharm. 14 (4), 999-1011 (2017).
  39. Pardridge, W. M., Eisenberg, J., Yamada, T. Rapid sequestration and degradation of somatostatin analogues by isolated brain microvessels. J Neurochem. 44 (4), 1178-1184 (1985).
  40. Goldstein, G. W., Betz, A. L., Bowman, P. D. Use of isolated brain capillaries and cultured endothelial cells to study the blood-brain barrier. Fed Proc. 43 (2), 191-195 (1984).
  41. Pardridge, W. M., Triguero, D., Yang, J., Cancilla, P. A. Comparison of in vitro and in vivo models of drug transcytosis through the blood-brain barrier. J Pharmacol Exp Ther. 253 (2), 884-891 (1990).
  42. Audus, K. L., Bartel, R. L., Hidalgo, I. J., Borchardt, R. T. The use of cultured epithelial and endothelial cells for drug transport and metabolism studies. Pharm Res. 7 (5), 435-451 (1990).
  43. Abbott, N. J., Hughes, C. C., Revest, P. A., Greenwood, J. Development and characterisation of a rat brain capillary endothelial culture: towards an in vitro blood-brain barrier. J Cell Sci. 103 (Pt 1), 23-37 (1992).
  44. Miller, D. S., et al. Xenobiotic transport across isolated brain microvessels studied by confocal microscopy. Mol Pharmacol. 58 (6), 1357-1367 (2000).
  45. Dolgikh, E., et al. QSAR Model of Unbound Brain-to-Plasma Partition Coefficient, Kp,uu,brain: Incorporating P-glycoprotein Efflux as a Variable. J Chem Inf Model. 56 (11), 2225-2233 (2016).
  46. Narayanan, R., Gunturi, S. B. In silico ADME modelling: prediction models for blood-brain barrier permeation using a systematic variable selection method. Bioorg Med Chem. 13 (8), 3017-3028 (2005).
  47. Betz, A. L., Firth, J. A., Goldstein, G. W. Polarity of the blood-brain barrier: distribution of enzymes between the luminal and antiluminal membranes of brain capillary endothelial cells. Brain Res. 192 (1), 17-28 (1980).
  48. Cucullo, L., Hossain, M., Puvenna, V., Marchi, N., Janigro, D. The role of shear stress in Blood-Brain Barrier endothelial physiology. BMC Neurosci. 12, 40(2011).
  49. He, Y., Yao, Y., Tsirka, S. E., Cao, Y. Cell-culture models of the blood-brain barrier. Stroke. 45 (8), 2514-2526 (2014).
  50. Urich, E., Lazic, S. E., Molnos, J., Wells, I., Freskgård, P. O. Transcriptional profiling of human brain endothelial cells reveals key properties crucial for predictive in vitro blood-brain barrier models. PLoS One. 7 (5), e38149(2012).
  51. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (5), 862-890 (2016).
  52. Stebbins, M. J., et al. Differentiation and characterization of human pluripotent stem cell-derived brain microvascular endothelial cells. Methods. 101, 93-102 (2016).
  53. Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (µBBB). Lab Chip. 12 (10), 1784-1792 (2012).
  54. Brown, J. A., et al. Recreating blood-brain barrier physiology and structure on chip: A novel neurovascular microfluidic bioreactor. Biomicrofluidics. 9 (5), 054124(2015).
  55. Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomed Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
  56. Cucullo, L., Hossain, M., Tierney, W., Janigro, D. A new dynamic in vitro modular capillaries-venules modular system: cerebrovascular physiology in a box. BMC Neurosci. 14, 18(2013).
  57. Neuhaus, W., et al. A novel flow based hollow-fiber blood-brain barrier in vitro model with immortalised cell line PBMEC/C1-2. J Biotechnol. 125 (1), 127-141 (2006).
  58. Stanness, K. A., et al. A new model of the blood--brain barrier: co-culture of neuronal, endothelial and glial cells under dynamic conditions. Neuroreport. 10 (18), 3725-3731 (1999).
  59. Ghosh, C., et al. Pattern of P450 expression at the human blood-brain barrier: roles of epileptic condition and laminar flow. Epilepsia. 51 (8), 1408-1417 (2010).
  60. Jeynes, B., Provias, J. An investigation into the role of P-glycoprotein in Alzheimer's disease lesion pathogenesis. Neurosci Lett. 487 (3), 389-393 (2011).
  61. Wijesuriya, H. C., Bullock, J. Y., Faull, R. L., Hladky, S. B., Barrand, M. A. ABC efflux transporters in brain vasculature of Alzheimer's subjects. Brain Res. 1358, 228-238 (2010).
  62. Pekcec, A., et al. Targeting prostaglandin E2 EP1 receptors prevents seizure-associated P-glycoprotein up-regulation. J Pharmacol Exp Ther. 330 (3), 939-947 (2009).
  63. Zibell, G., et al. Prevention of seizure-induced up-regulation of endothelial P-glycoprotein by COX-2 inhibition. Neuropharmacology. 56 (5), 849-855 (2009).
  64. Nelson, P. T., et al. Clinicopathologic correlations in a large Alzheimer disease center autopsy cohort: neuritic plaques and neurofibrillary tangles "do count" when staging disease severity. J Neuropathol Exp Neurol. 66 (12), 1136-1146 (2007).
  65. Vaught, J., et al. The ISBER Best Practices: Insight from the Editors of the Third Edition. Biopreserv Biobank. 10 (2), 76-78 (2012).
  66. Gjedde, A., Kuwabara, H., Hakim, A. M. Reduction of functional capillary density in human brain after stroke. J Cereb Blood Flow Metab. 10 (3), 317-326 (1990).
  67. Karbowski, J. Scaling of brain metabolism and blood flow in relation to capillary and neural scaling. PLoS One. 6 (10), e26709(2011).
  68. Lokkegaard, A., Nyengaard, J. R., West, M. J. Stereological estimates of number and length of capillaries in subdivisions of the human hippocampal region. Hippocampus. 11 (6), 726-740 (2001).
  69. Gerhart, D. Z., Broderius, M. A., Drewes, L. R. Cultured human and canine endothelial cells from brain microvessels. Brain Res Bull. 21 (5), 785-793 (1988).
  70. Tontsch, U., Bauer, H. C. ISOLATION, CHARACTERIZATION, AND LONG-TERM CULTIVATION OF PORCINE AND MURINE CEREBRAL CAPILLARY ENDOTHELIAL-CELLS. Microvascular Research. 37 (2), 148-161 (1989).
  71. Abbott, N. J. Dynamics of CNS barriers: Evolution, differentiation, and modulation. Cellular and Molecular Neurobiology. 25 (1), 5-23 (2005).
  72. Herculano-Houzel, S., Kaas, J. H., de Oliveira-Souza, R. Corticalization of motor control in humans is a consequence of brain scaling in primate evolution. J Comp Neurol. 524 (3), 448-455 (2016).
  73. Pardridge, W. M. Molecular biology of the blood-brain barrier. Mol Biotechnol. 30 (1), 57-70 (2005).
  74. Cirrito, J. R., et al. P-glycoprotein deficiency at the blood-brain barrier increases amyloid-beta deposition in an Alzheimer disease mouse model. J Clin Invest. 115 (11), 3285-3290 (2005).
  75. Rosenberg, G. A., Estrada, E. Y., Dencoff, J. E. Matrix metalloproteinases and TIMPs are associated with blood-brain barrier opening after reperfusion in rat brain. Stroke. 29 (10), 2189-2195 (1998).
  76. van Vliet, E. A., et al. Blood-brain barrier leakage may lead to progression of temporal lobe epilepsy. Brain. 130 (Pt 2), 521-534 (2007).
  77. Kermode, A. G., et al. Breakdown Of The Blood-Brain-Barrier Precedes Symptoms And Other Mri Signs Of New Lesions In Multiple-Sclerosis - Pathogenetic And Clinical Implications. Brain. 113, 1477-1489 (1990).
  78. Shlosberg, D., Benifla, M., Kaufer, D., Friedman, A. Blood-brain barrier breakdown as a therapeutic target in traumatic brain injury. Nat Rev Neurol. 6 (7), 393-403 (2010).
  79. Cecchelli, R., et al. Modelling of the blood-brain barrier in drug discovery and development. Nat Rev Drug Discov. 6 (8), 650-661 (2007).
  80. Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiol Exp (Wars). 71 (1), 113-128 (2011).
  81. Hatherell, K., Couraud, P. O., Romero, I. A., Weksler, B., Pilkington, G. J. Development of a three-dimensional, all-human in vitro model of the blood-brain barrier using mono-, co-, and tri-cultivation Transwell models. J Neurosci Methods. 199 (2), 223-229 (2011).
  82. Rubin, L., et al. A cell culture model of the blood-brain barrier. The Journal of cell biology. 115 (6), 1725-1735 (1991).
  83. Gaillard, P. J., et al. Establishment and functional characterization of an in vitro model of the blood-brain barrier, comprising a co-culture of brain capillary endothelial cells and astrocytes. European journal of pharmaceutical sciences. 12 (3), 215-222 (2001).
  84. Nakagawa, S., et al. A new blood-brain barrier model using primary rat brain endothelial cells, pericytes and astrocytes. Neurochemistry international. 54 (3), 253-263 (2009).
  85. Li, J. Y., Boado, R. J., Pardridge, W. M. Blood-brain barrier genomics. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 21 (1), 61-68 (2001).
  86. Ott, M., Fricker, G., Bauer, B. Pregnane X receptor (PXR) regulates P-glycoprotein at the blood-brain barrier: functional similarities between pig and human PXR. J Pharmacol Exp Ther. 329 (1), 141-149 (2009).
  87. Méresse, S., Delbart, C., Fruchart, J. C., Cecchelli, R. Low-density lipoprotein receptor on endothelium of brain capillaries. Journal of neurochemistry. 53 (2), 340-345 (1989).
  88. Hartz, A. M., Bauer, B., Block, M. L., Hong, J. S., Miller, D. S. Diesel exhaust particles induce oxidative stress, proinflammatory signaling, and P-glycoprotein up-regulation at the blood-brain barrier. FASEB J. 22 (8), 2723-2733 (2008).
  89. Moser, K. V., Reindl, M., Blasig, I., Humpel, C. Brain capillary endothelial cells proliferate in response to NGF, express NGF receptors and secrete NGF after inflammation. Brain research. 1017 (1), 53-60 (2004).
  90. Carrano, A., et al. ATP-binding cassette transporters P-glycoprotein and breast cancer related protein are reduced in capillary cerebral amyloid angiopathy. Neurobiol Aging. 35 (3), 565-575 (2014).
  91. Deane, R., et al. RAGE mediates amyloid-beta peptide transport across the blood-brain barrier and accumulation in brain. Nat Med. 9 (7), 907-913 (2003).
  92. McCaffrey, G., et al. P-glycoprotein trafficking at the blood-brain barrier altered by peripheral inflammatory hyperalgesia. Journal of neurochemistry. 122 (5), 962-975 (2012).
  93. Sanchez del Pino, M. M., Hawkins, R. A., Peterson, D. R. Biochemical discrimination between luminal and abluminal enzyme and transport activities of the blood-brain barrier. J Biol Chem. 270 (25), 14907-14912 (1995).
  94. Agarwal, S., et al. Quantitative proteomics of transporter expression in brain capillary endothelial cells isolated from P-glycoprotein (P-gp), breast cancer resistance protein (Bcrp), and P-gp/Bcrp knockout mice. Drug metabolism and disposition. 40 (6), 1164-1169 (2012).
  95. Kamiie, J., et al. Quantitative atlas of membrane transporter proteins: development and application of a highly sensitive simultaneous LC/MS/MS method combined with novel in-silico peptide selection criteria. Pharmaceutical research. 25 (6), 1469-1483 (2008).
  96. Uchida, Y., et al. Quantitative targeted absolute proteomics of human blood-brain barrier transporters and receptors. Journal of neurochemistry. 117 (2), 333-345 (2011).
  97. Lee, B. -C., Lee, T. -H., Avraham, S., Avraham, H. K. Involvement of the Chemokine Receptor CXCR4 and Its Ligand Stromal Cell-Derived Factor 1α in Breast Cancer Cell Migration Through Human Brain Microvascular Endothelial Cells. Molecular Cancer Research. 2 (6), 327-338 (2004).
  98. Zagzag, D., et al. Hypoxia-inducible factor 1 and VEGF upregulate CXCR4 in glioblastoma: implications for angiogenesis and glioma cell invasion. Lab Invest. 86 (12), 1221-1232 (2006).
  99. Preston, J. E., Hipkiss, A. R., Himsworth, D. T. J., Romero, I. A., Abbott, J. N. Toxic effects of beta-amyloid(25-35) on immortalised rat brain endothelial cell: protection by carnosine, homocarnosine and beta-alanine. Neuroscience Letters. 242 (2), 105-108 (1998).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Isolatie van hersenweefseldichtheidsgradiëntcentrifugatiemechanische homogenisatiefiltratie-assaysbloed-hersenbarrièremenselijke hersencapillairenanalyse van capillaire zuiverheidlekkage-assayslive-cell imaging
Isolatie van cerebrale haarvaten van verse menselijk hersenweefsel
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.