Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Beoordeling van Plasma coagulatie op leverweefsel in een grote diermodel In Vivo

8.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/57355

⸱

4 augustus 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, University of Bonn, 2Institute for Laboratory Animal Science & Experimental Surgery, RWTH Aachen University, 3Department of Anesthesiology, RWTH Aachen University

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol om te beoordelen experimenteel plasma coagulatie in leverweefsel in vivo. In een varkens model, microcirculatie wordt onderzocht door laser Doppler coagulatie diepte wordt gemeten histologisch, temperatuur op coagulatie site door infrarood thermometer en thermografische camera en koker afdichten effect is gedocumenteerd door barstdruk experimenten.

Samenvatting

Plasma coagulatie als een vorm van elektrocauterisatie wordt gebruikt in de lever chirurgie decennialang te verzegelen het grote lever snijvlak geconstateerd na grote hepatectomy ter voorkoming van bloeduitstortingen in een later stadium. De exacte gevolgen van plasma coagulatie op leverweefsel zijn alleen slecht onderzocht. In onze varkens model, kunnen de bloedstolling effecten dicht bij de klinische toepassing worden onderzocht. Een gecombineerde laser Doppler debietmeter en spectrofotometer documenten microcirculatie verandert tijdens coagulatie op 8 mm weefsel diepte noninvasively, kwantificeerbare voorlichting over hemostase buiten de subjectieve klinische indruk. De temperatuur op coagulatie site is beoordeeld met een infrarood thermometer voorafgaande en post stolling en met een thermografische camera tijdens coagulatie, een meting van de temperatuur van de lichtbundel is niet mogelijk vanwege de hogere drempel van de apparaten. De diepte van stolling microscopisch wordt gemeten op Haematoxyline/eosine gekleurd secties na kalibratie met een object micrometer en geeft een exacte informatie over de macht instelling-stolling diepte-relatie. De afdichtende werking wordt onderzocht op de galwegen, want het is niet mogelijk voor een plasma coagulator voor het afdichten van grotere bloedvaten. Burst druk experimenten worden uitgevoerd die op transplanteren organen uitsluiten van bloeddruk gerelateerde effecten.

Inleiding

Argon plasma coagulatie (APC) is een veelgebruikt instrument in de abdominale chirurgie voor meer dan drie decennia1,2. Het is een standaard techniek voor het bereiken van de secundaire hemostase na grote hepatectomy door het afdichten van de lever oppervlak gesneden om te voorkomen dat latere bloeduitstortingen3. Plasma coagulatie is een gespecialiseerde vorm van radiofrequentie elektrocauterisatie, die de elektrische energie door middel van een boog geïoniseerd gas levert. Biedt monopolaire elektrothermische hemostase en heeft deze noncontact techniek het voordeel van de elektrode te houden aan de weefsel4voorkomen. De lichtbundel geïoniseerd gas automatisch is gericht op het gebied van de laagste elektrische weerstand en is wendde zich af wanneer weerstand als gevolg van uitdroging tot andere gebieden nog niet verdroogde stijgt. Dit levert een uniforme beperkte diepte van stolling5,6. Factoren die het effect van de stolling beïnvloeden zijn de activeren tijd, de instelling van het vermogen van het apparaat van de stolling en de afstand van de sonde naar het weefsel. Helium is een ander draaggas, die kan worden gebruikt voor plasma coagulatie7. De nieuwste klinische studies geconcentreerd op klinische resultaten in plaats van histologische en functionele bevindingen3,8,9, terwijl experimentele studies gericht op in vitro onderzoeken10 of experimenten op geïsoleerde geperfundeerd organen11.

Het onderliggende protocol maakt de studie van de effecten van plasma coagulatie in een grote diermodel dicht bij de klinische toepassing met behulp van menselijke standaarduitrusting op varkens: microcirculatie noninvasively wordt beoordeeld door een laser Doppler debietmeter en spectrofotometer, die een klinische standaardhulpmiddel voor deze indicatie12,13 is. Temperatuurveranderingen tijdens coagulatie worden gecontroleerd met een infrarood thermometer en een thermografische camera. De diepte van stolling wordt gemeten op histologische Haematoxyline/eosine gekleurd secties na de oogst van weefselmonsters. Voor de vergelijking met andere middelen voor secundaire hemostase, worden burst druk experimenten uitgevoerd. In tegenstelling tot de eerder beschreven technieken14, worden deze uitgevoerd op transplanteren van organen uit te sluiten van bloeddruk gerelateerde effecten. Naast de beschreven onderzoek naar de lokale effecten van plasma coagulatie, kan standaard bloedonderzoek ook worden ondernomen in de varkens model.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Regels beheerst door Duitse wetgeving voor dierproeven, alsmede de beginselen van Laboratory Animal Care (National Institutes of Health publicatie ed. 8, 2011) werden gevolgd. Officiële toestemming wordt verleend van de gouvernementele dierenverzorgers kantoor (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen, Recklinghausen, Duitsland).

1. dieren

  1. Het gebruik van vrouwelijke Duitse landras varkens (onder de 25-30 kilo) in open kooien gehuisvest.
  2. Gebruik 5 dieren per groep (argon en helium).
  3. Toestaan dat de dieren om te acclimatiseren aan de omgeving voor ten minste één week voor de experimenten. Snelle dieren gedurende 24 uur vóór de operatie met gratis toegang tot water.

2. anesthesie

  1. Premedicate de dieren met een intramusculaire injectie van atropine (0,1 mg/kg BW), ketamine (15 mg/kg lichaamsgewicht [BW]) en xylazine (10 mg/kg BW) 10 minuten vóór de inductie van de anesthesie.
  2. Perifeer veneuze toegang is opgericht door plaatsing van een 22-gauge canule in een ader van het oor.
  3. Induceren narcose door i.v. injectie van propofol 2 mg/kg lichaamsgewicht.
  4. Plaats het dier in de liggende positie en het uitvoeren van een longitudinaal huid incisie in de jugular groef over een lengte van 2 cm. Locate ader door de botte voorbereiding van het subcutane weefsel. Invoegen canule, vervolgens Seldinger draad.
  5. Intrekken van de canule en 14 Fr. katheter via de begeleidingskabel invoegen. Intrekken van begeleidingskabel. Katheter verbinden met de uitbreiding en fixeren van de katheter door een riem of een hechtdraad.
  6. Trek de tong en rechte Laryngoscoop invoegen. Gebruik het puntje van de Laryngoscoop te trekken beneden het strotklepje. Plaats de buis door de stembanden. Plaats van manchet onder glottis en opblazen.
  7. Ventileer met 40% zuurstof op 20-26 adem/min en een ademhalingsvolume van 10 ml/kg te houden van de einde-getijde gedeeltelijke koolstofdioxide spanning tussen 36 en 42 mm Hg.
  8. Handhaven van anesthesie met Isofluraan bij een concentratie van 1-1,5% en fentanyl bij een concentratie van 3-4 µg/kg/h.
  9. Leveren van Ringer's lactaat oplossing met een initiële snelheid van 4 mL/kg/h, en verhogen na de laparotomie aan een constante infusiesnelheid van 8 mL/kg/h.

3. chirurgie en Plasma Coagulation

  1. Plaats het dier in een liggende positie op een standaard chirurgische tafel.
  2. Desinfecteren van de huid door het toepassen van een standaard chirurgische ontsmettingsmiddel (2-Propanol 45 g/100 g, 1-Propanol 10 g / 100g, Bifenyl-2-ol 0,2 g/100 g) met een chirurgische doekje voor 3 keer.
  3. Uitvoeren van een laparotomie breed middellijn van de xiphoid process naar het schaambeen met een scalpel en chirurgische OPROLMECHANISMEN installeren.
  4. Schakel het apparaat plasma coagulatie, argon of helium gasfles, afhankelijk van het gebruikte dragergas open. Gasstroom te selecteren coagulatie 3 L/min. uitgangsvermogen apparaat desgewenst aanpassen.
    Opmerking: Beide edelgassen, Argon of Helium, kan worden gebruikt voor plasma coagulatie. Stolling effecten zijn vergelijkbaar. Zie referentie7 voor meer informatie.
  5. Plasma coagulatie op de linker lever kwab als eerder beschreven7uitvoeren. Gebruik een titanium mal (vierkante diafragma 1 x 1 cm2) op de standaardisering van de stolling zone. Coaguleren voor 5 s met een sonde-afstand van 1 cm. De coagulations met verschillende energie-instellingen kunnen worden uitgevoerd naast een korte afstand tussen de coagulations van 5 mm (Figuur 1).
  6. Voor het oogsten van de lever, verdeel alle ligamenteuze verbindingen aan de lever. Isoleren en verdeel de hepatische stam boven de superieure duodenale flexure lange delen van portal ader en Galgang verlaten. Verdeel de holle ader boven en onder de lever en het orgel op te halen.
  7. Na de oogst van de lever, waren de varkens euthanized door i.v. toediening van 0.16 g/kg BW pentobarbital.
  8. Resect voor de uitbarsting druk experimenten, de helft van de linker mediale lever kwab met een scherpe schaar. Plasma-coaguleren van de cut oppervlakte (100W uitgangsvermogen) of verzegelen het snijvlak met fibrine sealant (Figuur 2).

4. de microcirculatie meting

Opmerking: Laser Doppler spectroscopie kunt bepalen bloedstroom in weefsel door het meten van de Doppler shift veroorzaakt door het verkeer van erytrocyten. Het signaal van de Laser correleert met het aantal bewegende erytrocyten. Laser Doppler spectroscopie in klinische gebruik (bijvoorbeeld transplantatie geneeskunde) en heeft al meerdere malen15gevalideerd.

  1. Zet de laser Doppler debietmeter en een spectrofotometer. Gebruik een platte sonde.
  2. Neem basislijnmetingen voor stroom en snelheid. Opslaan of Let op de waardes.
  3. Stolling zoals beschreven onder 3.5 uitvoeren
  4. Plaats de vlakke sonde op de sites van de stolling en maatregel flow en snelheid. Nogmaals, opslaan of opmerking waarden.
  5. Herhaal voor alle instellingen van de macht van het coagulator apparaat.

5. de temperatuurmeting

  1. Schakel het systeem op (thermografische camera, laptop en infrarood thermometer) en laat het lopen voor ten minste 1 uur vóór het uitvoeren van metingen.
  2. Focus aanpassen en frame weergeven op de thermografische camera op de stolling-site. Infrarood sequenties kunnen worden opgespoord met de ruimtelijke resolutie van 1024 x 768 pixels met de resolutie van een temperatuur groter dan 20 mK. Rekening, die de regio van coagulatie en het omringende weefsel — beïnvloed door warmteoverdracht — bevindt zich in het midden van de weergave.
    Opmerking: Het moet zoveel pixels van het frame bevatten mogelijk voor een optimale ruimtelijke resolutie.
  3. Record coagulatie proces met de plasma-coagulator van de lever ondergrond met de thermografische camera over een periode van 2-min.
  4. Analyseren van afbeeldingsreeksen met de software van de analyse van de thermografie: definiëren van gebieden van belang.
    Opmerking: Software berekent de loop van de overeenkomstige gemiddelde temperatuur na verloop van tijd.

6. coagulatie diepte meting

  1. Oogst de linker mediale lever kwab met een scherpe schaar.
  2. Accijnzen de coagulatie sites met 1 cm dikte. Snijd in 3 mm dik longitudinale segmenten voor verdere verwerking.
  3. Fix weefselsteekproeven bij 4 ° C's nachts met neutrale 10% gebufferd formaline. Verwarm paraffine 2 ° C boven het smeltpunt en insluiten van segmenten. Proces 's nachts.
  4. De Haematoxyline/eosine-kleuring uitvoeren
    1. Deparaffinize en hydrateren het weefsel door vervolgens dompelen in 2 x xyleen, 100% ethanol (EtOH), 95% EtOH, 70% EtOH, gedeïoniseerd H2O voor elke 2 min.
    2. Vlek het weefsel monster met Meyers Haematoxyline oplossing gedurende 3 minuten.
    3. Nu spoel in leidingwater voor 5 min.
    4. Vlek het weefsel met eosine oplossing gedurende 3 minuten.
    5. Spoel in 2 x EtOH 95% en vervolgens xyleen gedurende 3 minuten elke. Monteer met de standaard montage medium.
  5. Schakel het systeem in (Microscoop aangesloten camera, beeldbewerkingssoftware). Bekijk alle secties met 40 X vergroting.
  6. Neem een foto van een object micrometer bij een vergroting van 40 X. Druk op de knop Herkalibreren in het venster doelstellingen. Selecteer Handmatige kalibratie. Trek een lijn op de micrometer afbeelding van 100 µm. Enter 0,1 mm in het dialoogvenster en druk op OK.
  7. Lengte in de weergave selecteren > analyse besturingselementen > venster aantekeningen en metingen. Meten van de lever oppervlak tot aan de marge van de stolling met de muis. Opmerking het resultaat of exporteren. Herhaal de meting op een andere locatie op dezelfde dia..
    Opmerking: Coagulatie diepte kan gemakkelijk worden onderscheiden van de normale lever weefsel door de scherpe marge tussen de normale hepatocyte koorden en de zone van necrose met gekrompen cytoplasma, pyknotische kernen en bloeding zones.
  8. Berekent gemiddelde uit twee metingen.

7. de meting van de druk van de burst

  1. Schakel het systeem in (automatische pompen, druk meter). De lever monsters volgens de stap 3.7 voor te bereiden.
    Opmerking: Gebruik twee parallelle pompen aangesloten via een 3-weg-afsluiter. De maximale druk van 1 500 mm Hg niet kan worden verkregen met een enkele pomp.
  2. Portal vein, gemeenschappelijke hepatische slagader en gal duct isoleren met een schaar in de haptische stam. Portal vein klem met een pincet overholt en afbinden met een monofil hechtdraad 4-0. Gemeenschappelijke hepatische slagader een pincet overholt klem en afbinden met een monofil hechtdraad 4-0.
  3. Ch-16 katheter in de Galgang invoegen en afbinden met een 2-0 zijde hechtdraad. De katheter verbinden met de automatische pompen, 3-weg afsluiter installeren met druk meter (Figuur 3).
  4. Vul de spuit perfusie met zoutoplossing.
  5. Automatische pompen met een snelheid van de levering van 99 mL/h beginnen.
  6. Lever gesneden oppervlak en druk meter voor lekkage en record barstdruk controleren.
    Opmerking: Voor eenvoudiger erkenning van lekkage, patent blauw kan worden toegevoegd aan saline (2 mL patent blauw + 18 mL zoutoplossing). Het is makkelijker om te observeren barstdruk door merken de tijd van het verlies van druk op de druk meter.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Microcirculatie: Met behulp van het diagnostisch apparaat voor hemostase na plasma coagulatie kan worden aangetoond door wijzigingen van de microcirculatie. Capillaire bloed stroom (weergegeven als willekeurige eenheden (AU)) daalt van de waarde van een basislijn van 142.7 ± 76.08 AU tot 57.78 ± 49.57 AU op 25 W apparaat uitgangsvermogen, 48.5 ± 7,26 AU 50 W en 5.04 ± 1.31 AU bij 100 W (Figuur 4).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Knaagdier modellen voor lever chirurgie vastgesteld voor een lange tijd-16. Niettemin, grote dierlijke modellen bieden bepaalde voordelen: geen microchirurgische apparatuur nodig is als standaard operatieve uitrusting voor de mens kan worden toegepast, chirurgische technieken vergelijkbaar met klinische gebruik zijn en standaard klinische evaluatiemethoden kunnen overgedragen aan de experimenten. Standaard klinische tests van het bloed kan bijvoorbeeld worden uitgevoerd zonder de behoefte aan spec...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs hebben geen bevestigingen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Xylazine 20 mg/mLVetoquinol GmbHXylapan
Ketamine 100 mg/mLCeva GmbHCeva Ketamine Injection
Atropine 100 mg / 10 mLDr. Franz Köhler Chemie GmbHAtropinsulfat Köhler 100mg Amp.
PropofolFresenius Kabi GmbHPropofol 1% MCT Fresenius
FentanylKG Rotexmedica GmbHFentanyl 0,5mg Rotexmedica
IsofluraneAbbot GmbHForene 100% (V/V) 250 mL
Ringer's lactate solutionBaxter Deutschland GmbHnatrium 131mmol/l, kalium 5 mmol/l, calcium 2 mmol/l, chloride 111 mmol/l, lactaat 29 mmol/l
Chirurgisch ontsmettingsmiddelSchülke & Mayr GmbHKodan Tinktur forte gekleurd 1l 104804
Gemotoriseerd microscoopNikon Instruments EuropeEclipse TE2000-E
MicroscoopcameraNikon Instruments EuropeDigitalsight DS-Qi1Mc
BeeldvormingssoftwareNikon Instruments EuropeNIS elements Vers. 4.40
PlasmacoagulatorSöring GmbHCPC-1000
ArgongasLinde AGArgon 4.8 
HeliumgasLinde AGHelium 4.8
O2CLEA Medizintechnik GmbHO2C Version 1212met LF-2 of LF-3 sonde
InfraroodthermometerVoltcraftVOLTCRAFT IR 260-8S
Thermografische cameraInfraTec GmbHVarioCAM HD head 820
Thermografische analysesoftwareInfraTec GmbHIRBIS 3
Mayer's Hematoxyline-oplossingMerck 1.09249
Eosine-oplossingVWR International GmbHMerck 1.09844
Rollerpomp Masterflex L/S easy LoadCole-Parmer Instrument Companymodel 7518-10
PerfusiepompenB. Braun Melsungen AGPerfusor secura FT
Digitaal drukmeterGreisinger electronicGMH 3161
Perfusie-spuit, 50 mLB. Braun Melsungen AGREF 8728810 F
Perfusielijn, Type IV Standaard, PVC Luer lockB. Braun Melsungen AGREF 8722960
3-weg stopkraan, Dicofix C35CB. Braun Melsungen AGREF 16494 C
Zijde 2-0. 3 metrischResorbaREF H5F
Vicryl 4-0 SutupakEthiconV1224H
NaCl 0,9 %B. Braun Melsungen AG

Referenties

  1. Link, W. J., Incropera, F. P., Glover, J. L. A plasma scalpel: comparison of tissue damage and wound healing with electrosurgical and steel scalpels. ArchSurg. 111, 392-397 (1976).
  2. Kwon, A. H., Inui, H., Kamiyama, Y. Successful laparoscopic haemostasis using an argon beam coagulator for blunt traumatic splenic injury. EurJSurg. 167, 316-318 (2001).
  3. Frilling, A., et al. Effectiveness of a new carrier-bound fibrin sealant versus argon beamer as haemostatic agent during liver resection: a randomised prospective trial. Langenbecks ArchSurg. 390, 114-120 (2005).
  4. Raiser, J., Zenker, M. Argon plasma coagulation for open surgical and endoscopic applications: state of the art. J Phys Appl Phys. 39 (16), 3520-3523 (2006).
  5. Farin, G., Grund, K. E. Technology of argon plasma coagulation with particular regard to endoscopic applications. EndoscSurgAllied Technol. 2, 71-77 (1994).
  6. Grund, K. E. Argon plasma coagulation (APC): ballyhoo or breakthrough? Endoscopy. 29, 196-198 (1997).
  7. Glowka, T. R., Standop, J., Paschenda, P., Czaplik, M., Kalff, J. C., Tolba, R. H. Argon and helium plasma coagulation of porcine liver tissue. J Int Med Res. , (2017).
  8. Dowling, R. D., Ochoa, J., Yousem, S. A., Peitzman, A., Udekwu, A. O. Argon beam coagulation is superior to conventional techniques in repair of experimental splenic injury. JTrauma. 31, 717-720 (1991).
  9. Go, P. M., Goodman, G. R., Bruhn, E. W., Hunter, J. G. The argon beam coagulator provides rapid hemostasis of experimental hepatic and splenic hemorrhage in anticoagulated dogs. JTrauma. 31, 1294-1300 (1991).
  10. Brand, C. U., Blum, A., Schlegel, A., Farin, G., Garbe, C. Application of argon plasma coagulation in skin surgery. Dermatology. 197, 152-157 (1998).
  11. Carus, T., Rackebrandt, K. Collateral tissue damage by several types of coagulation (monopolar, bipolar, cold plasma and ultrasonic) in a minimally invasive, perfused liver model. ISRNSurg. , 518924(2011).
  12. Bludau, M., Vallbohmer, D., Gutschow, C., Holscher, A. H., Schroder, W. Quantitative measurement of gastric mucosal microcirculation using a combined laser Doppler flowmeter and spectrophotometer. DisEsophagus. , (2008).
  13. Beckert, S., Witte, M. B., Konigsrainer, A., Coerper, S. The impact of the Micro-Lightguide O2C for the quantification of tissue ischemia in diabetic foot ulcers. Diabetes Care. 27, 2863-2867 (2004).
  14. Erdogan, D., de Graaf, W., van Gulik, T. M. Adhesive strength of fibrinogen-coated collagen patch or liquid fibrin sealant in an experimental liver resection model in pigs. Eur Surg Res Eur Chir Forsch Rech Chir Eur. 41 (3), 298-302 (2008).
  15. Knobloch, K., et al. Microcirculation of the sternum following harvesting of the left internal mammary artery. ThoracCardiovascSurg. 51, 255-259 (2003).
  16. Kanzler, S., et al. Recommendation for severity assessment following liver resection and liver transplantation in rats: Part I. Lab Anim. 50 (6), 459-467 (2016).
  17. Pehböck, D., Dietrich, H., Klima, G., Paal, P., Lindner, K. H., Wenzel, V. Anesthesia in swine optimizing a laboratory model to optimize translational research. Anaesthesist. 64 (1), 65-70 (2015).
  18. Nykonenko, A., Vávra, P., Zonča, P. Anatomic Peculiarities of Pig and Human Liver. Exp Clin Transplant Off J Middle East Soc Organ Transplant. 15 (1), 21-26 (2017).
  19. Fechner, G., von Pezold, J., Luzar, O., Hauser, S., Tolba, R. H., Müller, S. C. Modified spectrometry (O2C device) of intraoperative microperfusion predicts organ function after kidney transplantation: a pilot study. Transplant Proc. 41 (9), 3575-3579 (2009).
  20. Patterson, E. J., Scudamore, C. H., Owen, D. A., Nagy, A. G., Buczkowski, A. K. Radiofrequency ablation of porcine liver in vivo: effects of blood flow and treatment time on lesion size. AnnSurg. 227, 559-565 (1998).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Laser Doppler flowmetrieinfraroodthermografieburstsdrukmetinghematoxyline eosin kleuringargon helium coagulatiemonitoring van de microcirculatieafsluiting van de galgang
Beoordeling van Plasma coagulatie op leverweefsel in een grote diermodel In Vivo
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.