Een Rat Model van Centrale vermoeidheid met een gewijzigde methode met verscheidene Platform

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol ter invoering van een rat model van Centrale vermoeidheid met behulp van de gewijzigde methode met verscheidene platform (MMPM).

Samenvatting

In dit artikel, introduceerden we een rat model van Centrale vermoeidheid met behulp van de gewijzigde methode met verscheidene platform (MMPM). Het vak meerdere Platform is ontworpen als een watertank met smalle platforms op de bodem. Het model ratten werden gebracht van de tank en stond op de platformen voor 14u (18:00-8:00) per dag voor een opeenvolgende 21 dagen, met een blanco-controlegroep is ingesteld voor contrast. Aan het einde van modellering, ratten in de modelgroep toonde een duidelijke vermoeid uiterlijk. Om te beoordelen van het model, we verschillende gedrags tests uitgevoerd, met inbegrip van het open veld test (OFT), de verhoogde plus doolhof (EPM), en de uitputtende zwemmen (ES)-test. De resultaten toonden dat angst, ruimtelijke cognitie waardevermindering, arme spier prestaties, en geweigerde vrijwilligerswerk gepresenteerd in model ratten bevestigen de diagnose van Centrale vermoeidheid. Wijzigingen van de centrale neurotransmitters ook gecontroleerd op het resultaat. Kortom, het model met succes gesimuleerd centrale vermoeidheid, en toekomstige studie met het model kan helpen onthullen de pathologische mechanisme van de ziekte.

Inleiding

Vermoeidheid is een van de belangrijkste factoren die de gezondheid van de mens¹bedreigen. In de afgelopen decennia verschillende onderzoeken gebleken dat vermoeidheid ook geactiveerd maar centraal gestuurde en altijd gepaard gaan met emotionele en cognitieve stoornissen is. Italiaans fysioloog A. Mosso het woord centrale vermoeidheid²voor het eerst voorgesteld. Het wordt doorgaans gedefinieerd als beperkte vrijwilligerswerk en waardevermindering van de cognitie als gevolg van dysfunctie voor impuls transmission in het centrale zenuwstelsel (CNS)³. Vergeleken met perifere spiervermoeidheid, centrale vermoeidheid legt de nadruk op veranderingen in het centraal zenuwstelsel, alsmede de daaruit voortvloeiende emotionele/gedrags stoornissen, zoals depressie, angst, cognitie bijzondere waardevermindering en geheugenverlies. Een studie toont aan dat vele factoren een centrale vermoeidheid, waaronder overmatige lichaamsbeweging en geestelijke stress heel onmisbaar^{4 zijn}kunnen veroorzaken. Wat betreft de pathogenese verklaren theorieën zoals de tryptofaan-kynurenine traject hypothese⁵ wijzigingen in bepaalde trajecten; meer diepgaande studies zijn echter nog steeds nodig te onthullen van de Auvergne-randapparaat correlaties van Centrale vermoeidheid.

Als het onderliggende mechanisme van Centrale vermoeidheid nog onduidelijk is, is een effectieve diermodel vrij belangrijk voor verder onderzoek. De bestaande vermoeidheid-modellen zijn meestal veroorzaakt door buitensporige oefening, zoals loopbanden⁶ en gewicht-geladen zwemmen⁷, met weinig zorg op psychische factoren. Om te beter simuleren de ontwikkeling van Centrale vermoeidheid, heeft onze fractie een rat-model met de MMPM ontwikkeld. Tijdens het modelleren blijven ratten staan op de smalle perrons in het vak meerdere Platform voor lange uren inclusief deel van de tijd van de slaap. Verschillend van buitensporige oefening modellen, het MMPM-model maakt gebruik van gedeeltelijke slaaptekort als een mentale factor als tegenprestatie voor de complexe pathogenese van Centrale vermoeidheid.

Voor model evaluatie gebruiken we de OFT en EPM tests om te bepalen van angst stemming en vrijwilligerswerk. De ES-test wordt uitgevoerd voor het meten van de prestaties van de perifere spier. Bovendien, we nemen de rat hersenen en detecteren van dopamine (DA) / serotonine (5-HT) inhoud in beide hypothalamuses te observeren de centrale neurotransmitter verschillen.

Het protocol hieronder is ontworpen om centrale vermoeidheid model geïnduceerd door herhaalde lichaamsbeweging en gebrek aan slaap, het nabootsen van een veel voorkomende aandoening in het menselijk leven. Echter, door de duur van het model aan te passen, het kan worden gebruikt op vele andere terreinen, zoals in slaap observatie en stress studies. In de toekomst onderzoek, we hopen dat dit model ontdekken meer CNS veranderingen en hun verbinding met de perifere systeem helpen zal, te onthullen het mechanisme van de pathogenese van Centrale vermoeidheid.

Protocol

Alle dieren waren onderhouden overeenkomstig de richtsnoeren door de Chinese wetgeving inzake de ethische gebruik en verzorging van proefdieren.

1. pre modeling voorbereiding

1. Laboratorium voorbereiding
   1. De UV-lamp voor ten minste 30 minuten vóór het experiment uitvoeren.
   2. Controle van de lab-temperatuur bij de 25 ± 3 ° C, met een relatieve vochtigheid ongeveer 30%.
   3. Zet het licht op 6:00 lab en zwenking op vandoor om 18:00 om een 12/12 uur licht/donker cyclus.
2. Meerdere Platform doos constructie
   1. Construeer een ondoorzichtige kunststof tank zonder een cover van 110 × 60 × 40 cm³.
   2. Repareren van vijftien circulaire platformen (h = 8 cm, d = 6,5 cm) op de bodem van de tank, welke ordelijke verdelen in drie rijen en vijf kolommen. Laat genoeg ruimte tussen elk platform, ongeveer 10 cm tussen kolommen en 13 cm tussen de rijen.
   3. Een loospijp aan de laterale kant van de tank kunt configureren en installeren van een kraan.
   4. Maak een ijzerdraad verrekening dekking voor de tank met een voedsel-vak opknoping op het.
3. Groeperen en huisvesting ratten
   Opmerking: De mannelijke ratten Wistar van 8 weken oud, weegt ongeveer 200-210 g, worden gebruikt in het experiment. De ratten leven in groepen tijdens het modelleren.
   1. Nummer de ratten staart wortels met een viltstift.
   2. Wegen van de ratten, uitgezonderd de uiterst lichte of zware ones, en verdeel de rest willekeurig in de model- en controlegroepen.
   3. Zet de rats zachtjes in de schone kooien en hen toestaan om te acclimatiseren naar het lab voor ten minste 3 dagen. Zorgen voor voldoende water en voedselvoorziening.

2. modellering met MMPM

Opmerking: Het proces begint om 18:00 en eindigt om 8:00 de volgende dag, voor een totaal van 14 h per dag, meer dan 21 dagen. Om te voorkomen storingen factoren, is dezelfde persoon vereist om te leiden van het hele experiment, terwijl het dragen van de dezelfde laboratoriumjas. 10 Wistar ratten worden gebruikt in het experiment.

1. Plaats de tank op een vlakke ondergrond, bijvoorbeeld, de verdieping. Vul de tank met ongeveer 7 cm van warm (25 ± 3 ° C) water, ongeveer 1 cm onder het vlakke platform.
2. Bereiden genoeg eten en drinken voor alle ratten in de tank voor 1 dag. Voedergewassen en water in het voedsel vak zetten en hang het op de cover.
   Opmerking: Sommige slimme ratten leren om te rusten op het vak van voedsel. Zo ja, rijden ze terug in de tank.
3. Het model groep ratten uit de kooi, pak hen door de staart, en leg ze voorzichtig in de tank. Start alle ratten in het water in plaats van de platforms te motiveren hun angst voor water. Zorg ervoor dat elke rat krijgt een platform om op te staan, terwijl de ratten van de controlegroep blijven in hun oorspronkelijke kooien met voldoende voedsel en water.
4. Betrekking hebben op de tank. Toezicht op de rats om te voorkomen dat per ongeluk schade. Als een rat in water voor meer dan 1 h blijft zonder klimmen op het platform, kies het uit de tank en het verwijderen van de test.
5. Na 14u, nemen de rats model uit de tank en hun haar met een droger drogen. Opnieuw markeren de ratten staarten als het verdwijnt. De ratten terug naar hun oorspronkelijke kooien en hen te voorzien van voldoende voedsel en water.
6. Spoel elke hoek van de tank. Één kant van de tank te verheffen en open de kraan om de uitstroom van het afvalwater.
7. Steriliseren van de tank met een 75% ethanol spray en het blootstellen aan het UV-licht.

3. model: Gedrags evaluatietoets

Opmerking: Alle proeven worden uitgevoerd in de gedragsmatige lab. Lawaai en extra licht mogen niet tijdens de proef voorkomen van verstoring. Gebruik, indien mogelijk, de dezelfde persoon of personen om elke test. Een donkere jas en handschoenen zijn vereist voor de erkenning van de grijsschaal in beeldverwerking. Uitvoeren van het OFT eerst als het minste effect op het gedrag van de rat heeft.

1. OFT
   1. Controleer de recorder in het veld openen om te controleren of het correct is aangesloten op het werkstation en heeft betrekking op elke hoek van het vak. Aanpassen van de verlichting te elimineren van schaduwen in het vak.
   2. Verplaats de ratten in de gedragsmatige lab in hun oorspronkelijke kooien. Laten acclimatiseren gedurende ten minste 1 uur vóór de proef.
   3. Reinigen en zuiveren van de doos met 75% ethanol om ervoor te zorgen dat er is geen uitwerpselen of geur links van vorige experiment.
   4. Verwijderen van een rat uit de kooi door de rug en zet het zachtjes in het centrale gedeelte van het vak. Terugtrekken snel wapens uit de doos dus niet te blokkeren het schot.
   5. Input van de rat nummer en beginnen met opnemen. Tellen en registreren van de frequentie van de rat verticale activiteiten, waaronder fokken en klimmen.
   6. Na 5 min, opname stoppen, nemen de rat uit de doos en terugsturen naar de kooi.
   7. Herhaal stap 3.1.3 - 3.1.6 totdat alle ratten klaar met de test bent.
2. EPM
   1. Voer de stappen van het vooraf controleren en acclimatisering wat betreft het OFT (stappen 3.1.1 - 3.1.2).
   2. Verwijderen van een rat uit de kooi door de rug en zet het zachtjes op het deel van de kruising van de twee takken. De rat naar de linkerarm open land en snel verlaten om niet te blokkeren het schot.
   3. Input van de rat nummer en beginnen met opnemen. Tellen en registreren van de frequentie van verschillende arm ingangen. Als de rat uit de doolhof in de test daalt, het oprapen en stuur het terug naar de doolhof. Record gedetailleerde informatie voor data-analyse.
   4. Na 5 min, opname stoppen, nemen de rat uit en terug te sturen naar de kooi.
   5. Verwijderen van de uitwerpselen en veeg de doolhof met 75% ethanol te elimineren van de voormalige rat geur.
   6. Herhaal stap 3.2.2 - 3.2.5 totdat alle ratten klaar met de test bent.
3. ES test
   1. Vul de tank zwemmen (70 × 30 × 110 cm³) met 80 cm van warm (25 ± 3 ° C) water.
      Opmerking: Als er een thermostaat in de tank, moet aan de temperatuur van het water het rond 37 ° C, die vergelijkbaar met de rat lichaamstemperatuur is worden ingesteld. Als dat niet het geval is, het op kamertemperatuur constant te houden het ingesteld.
   2. Maak een belasting voor elke rat met pin trossen en bind het zachtjes op de wortel van de staart. De lading weegt 10% van het gewicht van de rat.
   3. Pak een rat door de staart en gooi het in de tank zwemmen. Als de ratten kruipen of aan de muur vastklampen, hen apart gezet en rijden ze terug in het water.
   4. Timing starten op het moment waarop de rat in het water en stop timing wanneer het uitgeput is gebracht, blijkt dat als de mislukking te worstelen uit water met de mond en neus onder het water voor meer dan 10 s.
      Opmerking: Soms, uitputting en verdrinking optreden plotseling. Zorg ervoor dat u genoeg onderzoekers om te registreren en opslaan van het dier op hetzelfde moment.
   5. Verwijder de uitgeput ratten uit het water zonder onderbreking van anderen. Hun haar droog, opnieuw markeren hun nummers, en stuur ze terug naar de kooi.
   6. Het water in de tank veranderen nadat een groep is voltooid. Nadat alle ratten zijn gedaan, legen van de tank van zwemmen, en schoon en het steriliseren met ethanol en UV-licht.

4. model beoordeling: Centrale Neurotransmitter detectie

1. Anesthetize de rat met intraperitoneale injectie van 10% Chloraalhydraat (3 mL/kg) totdat het onbewuste.
2. Het onthoofden van ratten.
3. Een longitudinale incisie langs de post mediale lijn maken, opent u de schedel aan beide zijden en het blootstellen van de hersenen. Draai de schedel, verwijderen de hersenen en de hersenen zetten met een IJszak.
4. Scheiden en verwijder de hypothalamus, die de diamant-vormige gebied in het centrale deel van de basis van de hersenen met een duidelijke grens met omringende weefsels. Plaats het in een steriele buis en bevriezen met vloeibare stikstof. Bewaar alle monsters in een koelkast-80 ° C.
5. De inhoud van de DA en 5-HT detecteren in de hypothalamus met behulp van krachtige vloeibare chromatografie (HPLC)⁸.

Resultaten

We beschrijven een rat model van Centrale vermoeidheid met behulp van MMPM. 24 Wistar ratten zijn willekeurig verdeeld in de controlegroep en de modelgroep, met 12 ratten in elke groep. De model-apparatuur is ontworpen als een watertank met smalle platforms op de bodem (Figuur 1). Model ratten staan op de perrons voor 14u per dag, met inbegrip van gedeeltelijke slaaptijd, gedurende 21 dagen (Figuur 2).

Discussie

De MMPM is oorspronkelijk ontworpen voor slaap deprivatie⁹. Ratten worden gelanceerd in een watertank met platforms vast op de bodem. Gedreven door de instinctieve angst voor water, ratten blijven staan op de perrons en geen slaap optreedt. De studie toont aan dat verschillende uren van slaaptekort tot verschillende veranderingen in rat gedrag- en stemmingsstoornissen leiden, waaronder erkenning bijzondere waardevermindering¹⁰, negatieve emoties¹¹en ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
multiple platform sleep deprivation water tank	Aanpassing, het wordt geleverd door het neuro-immunologische laboratorium van de Beijing Universiteit voor Chinese Geneeskunde		110cm x 60cm x 40cm. Er zijn 15 kleine plastic platformen aan de onderkant. Het kleine platform is 6,5 cm in diameter en 8 cm hoog
Wistar ratten	Beijing Weitong Lihua Experimenteel Diertechnologie Bedrijf	licentienummer SYXK (Beijing) 2016-0011	Gebruik 32 gezonde mannelijke Wistar ratten, 8 weken oud (200-210 g)
Agilent 1100LC hoogwaardige vloeistofchromatograaf	Agilent	G1379A, G1311A, G1313A, G1316A	G1379A, G1311A type chromatografische pomp, G1313A automatische sampler, G1316A kolom temperatuurkast
DECADE II SDC elektrochemische detector	Nederlands ANTEC bedrijf		glazige koolstofelektrode, Ag/AgCl referentie-elektrode, werkstations (Clarity CHS)
Biofuge Stratos hoge snelheid koelcentrifuge	HERAEUS
VCX130 ultrasoon brekingsinstrument	SONICS
ACS-ZEAS elektronische weegschaal	Phos technologieontwikkeling, Beijing.		Het gewicht van de weegschaal voor ratten kan nauwkeurig tot 0,1g zijn.
Open Field Box	Aanpassing, het wordt geleverd door het neuro-immunologische laboratorium van de Beijing Universiteit voor Chinese Geneeskunde		houten doos van open veld  100 cm bij 100 cm x 40 cm, binnenwand en bodem als de grijs.De bodem is verdeeld in 25 gelijke gebiedsvierkanten, elk 20cm x 20cm, en de 16 roosters langs de buitenwand zijn de externe, en de andere 9 roosters zijn centraal.De camera is gemonteerd boven het midden.
Elevated Plus-maze	Beijing zhongshi dechuang technologie ontwikkelings co. LTD.		De open armen en sluit  armen van het kruis bestaan uit 30cm x 5cm x 15cm, en het centrale gebied is 5cm x 5cm, met een camera gemonteerd boven het centrum en 45cm hoog.
ratten zwememmer.	Zhenhua biologisch instrumentenuitrusting co., LTD. Anhui, China.		Het volume van de plastic trommel is 70cm x 30cm x 110cm, die wordt gebruikt voor zwemmen in ratten.
Thermometer	Shiya instrument co., LTD., changzhou, China.		Controle van watertemperatuur
Kleine waterpomp	Xincheng technologie co., LTD., chengdu, China.		Gebaat voor watertank en zwemgedrag.
Ethovition3.0 gedragssoftware.	Nuldus, Nederland		Meetanalyse van ratten gedrag video's.