Bepaling van eiwit expressie niveau in gekweekte cellen door immunocytochemie op cel paraffine-ingebedde blokken

Samenvatting

Momenteel is de methode van keuze voor gehaltebepaling eiwit expressie immunefluorescentie kleuring op vaste cellen wanneer morfologische ook noodzakelijk is. Dit protocol gepresenteerd hierin voorziet in een alternatieve methode van immunocytochemie op cel paraffine-ingebedde blokken.

Samenvatting

Immunefluorescentie kleuring is momenteel de methode van keuze voor gehaltebepaling eiwit expressie in celkweek systemen wanneer morfologische ook noodzakelijk is. Het protocol van immunocytochemische kleuring op cel paraffine-ingebedde blokken, hier vermelde is een uitstekend alternatief voor immunefluorescentie kleuring op niet-paraffine-ingebedde vaste cellen. In dit protocol, een paraffine cel blok van HeLa cellen werd opgesteld op basis van de thromboplastin-plasma-methode en immunocytochemie werd uitgevoerd voor de beoordeling van twee markeringen van de proliferatie, CKAP2 en Ki-67. De kernen en cytoplasmatische morfologie van de HeLa cellen werden goed bewaard gebleven in de cel-blok dia's. Tegelijkertijd waren de CKAP2 en Ki-67 kleuring patronen in de immunocytochemie vrij gelijkaardig aan degenen in immunohistochemische kleuring in paraffine kanker weefsels. Met gewijzigde cel-cultuur-voorwaarden, met inbegrip van pre-incubatie van HeLa cellen in serumvrij omstandigheden, kan het effect met behoud van de architectonische informatie worden geëvalueerd. Kortom, is immunocytochemie op cel paraffine-ingebedde blokken een uitstekend alternatief voor immunefluorescentie kleuring.

Inleiding

In de meeste laboratoria, worden paraffine-ingebedde cel blokken niet vaak gebruikt. Integendeel, vaste gekweekte cellen, niet paraffine-ingebedde cellen, zijn werkzaam in subcellular localisatie studies. Voor deze vaste gekweekte cellen, is fluorescentie in plaats van chromogeen gebruikt. Immunefluorescentie kleuring is daarom op dit moment de methode van keuze voor eiwit expressie gehaltebepaling in onderzoek cel culturen¹dienst. Dia's voorbereid immunefluorescentie kleuring, kunnen echter alleen onder immunefluorescentie microscopie, waaruit zou kunnen beelden heel anders dan die vermeld onder vliegtuig microscopie²worden waargenomen. Daarnaast behoud van dia's voor immunefluorescentie kleuring vereist bescherming tegen fel licht en fluorescerende signalen worden zwakker met herhaalde blootstelling voor imaging te wijten aan het verlies van de fluorescent signaal³. Resultaten van immunocytochemie op cel paraffine-ingebedde blokken zijn vrij gelijkaardig aan die van immunohistochemistry op weefsels paraffine-ingebedde⁴, en ze kunnen gemakkelijk worden omgezet in klinische informatie. Immunocytochemie kan dus een uitstekend alternatief. Echter, cel-blok voorbereiding niet populair geweest in fundamenteel onderzoekslaboratoria. In dit protocol, vervolgens cel-blok voorbereiding en immunocytochemische kleuring worden geleverd ter bevordering van het gebruik van deze methode op het gebied van celkweek studies.

Cel-blok voorbereiding en immunocytochemie zijn geen unieke methoden, en zij hebben al van klinische diagnose toegepast op fundamenteel onderzoek^4,5. Hoewel verschillende cel-blok voorbereiding methoden zijn gemeld^4,is⁶ het thromboplastin-plasma methode eenvoudig, rendabel en gemakkelijk aan te passen. Daarom, in het protocol gepresenteerd in deze paper, de thromboplastin-plasma methode^4,5,6,7,8 wordt gebruikt voor bereiding van paraffine-ingebedde cel blokken.

In de huidige studie, werden de gedetailleerde procedures voor het opstellen van thromboplastin-plasma cel blokken en de methode van de immunocytochemie twee proliferatie markeringen in dienst gedemonstreerd. Een marker is cytoskelet-geassocieerde proteïne 2 (CKAP2), die onlangs werd gerapporteerd als een mitotische marker^9,10,11; de andere is Ki-67, die de bekendste proliferatie marker^{12 is}. Het representatieve stelsel is afgebeeld in Figuur 1.

Protocol

Het studie-protocol werd goedgekeurd door de institutionele Review Board National Cancer Center, Korea (NCCNCS-12-630).

1. monstervoorbereiding (30 min)

1. Voor de cultuur van HeLa cellen (CCL-2, ATCC), door 10 mL volledige DMEM medium (foetale runderserum 10%, 1% pen-strep) in een schotel van 100 mm cultuur te gebruiken. Ter voorbereiding van serum-uitgehongerd HeLa cellen, incubeer confluente HeLa cellen in DMEM zonder foetale runderserum 48 uur, zoals wordt beschreven in een eerdere studie¹¹.
2. Als u wilt loskoppelen van de cellen, wassen ze met 2 mL-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), en voeg 2 mL 0,25% EDTA trypsine per 100 mm cultuur schotel. Vervolgens, Incubeer gedurende 2-3 min in een CO₂ incubator bij 37 ° C.
3. Voeg 5 mL van volledige DMEM medium op de cultuur dish deactiveren trypsine en de vrijstaande cellen overbrengen in een tube van 15 mL. Centrifugeer dan de cellen bij 300 x g gedurende 10 minuten om te vormen van een pellet.
4. Verwijder het supernatant en wassen van de pellet tweemaal met 2 mL koude PBS door centrifugeren bij 300 x g gedurende 10 minuten.
5. Na verwijdering van de bovendrijvende substantie, 1 mL 95% ethanol toevoegen aan de cel pellet, en meng de cel pellet met ethanol door vortexing. Houden de vaste cellen op ijs totdat de cel-blok voorbereiding.

2. cel-blok voorbereiding (1 h 30 min)

1. Voor de bereiding van bevroren plasma aliquots, verzamelen EDTA-plasma uit gezonde donor bloed centrifuge op 13.000 x g voor 10 min. verzamelen het supernatant plasma en aliquot 200-400 µL, elk in microfuge buizen. De aliquots bij-80 ° C bewaren tot gebruik. Wanneer het bevroren plasma aliquots klaar bent, halen ze en ontdooien van het plasma door incubatie bij 37 ° C gedurende 5 minuten.
2. Centrifugeer de vaste cellen bij 700 x g gedurende 10 minuten en verwijder het supernatant.
3. Meng de cel pellet met 2 druppels (ongeveer 200 µL) van de plasma, 2 druppels thromboplastin en 2 druppels van 0,025 M calciumchloride. Dan meng ze door pipetteren.
4. Laat het mengsel vormen een cel stollen bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten, zoals weergegeven in figuur 2A. Vervolgens wassen de cel clot met PBS twee keer door gieten en PBS Pipetteer te verwijderen. De representatieve wit cel clot is afgebeeld in figuur 2B.
5. Bevochtig een stuk filtreerpapier met formaline, en wikkel de klonter van de cel met het vooraf bevochtigd koffiefilter. Plaats vervolgens de gestold mengsel met een pincette in een weefsel cassette zoals weergegeven in figuur 2C.
6. Plaats de cassette weefsel in een glazen pot met 50 mL gebufferd formaline (10% formaline in PBS) 's nachts bij 4 ° C voor fixatie van formaline.

3. de weefsels verwerking en paraffine insluiten ('s nachts)

1. Laden van de weefsel cassette met de formaline-vaste cel-clot overnachting in een weefsel processor zoals eerder beschreven¹¹. De verwerking van het weefsel is voor verwijdering van water en conditionering van vaste cellen voorafgaand aan paraffine insluiten. Uitvoeren voor onderzoek zonder weefsel verwerking, het weefsel veredeling zoals aangegeven in tabel 1.
2. Zet op de verwarmde insluiten station, en 60 minuten later, te controleren dat er gesmolten paraffine in de metalen mal daarin is (figuur 2D).
3. Nemen van de opgemaakte cel clot van de weefsel cassette en plaats deze in de gesmolten paraffine binnen de metalen mal.
4. Plaats de nieuwe cassette van het weefsel zonder het deksel in de metalen mal met de cel in het midden van de gesmolten paraffine stollen, en giet meer gesmolten paraffine in het weefsel cassette en op de metalen mal. Dan, laat de paraffine stollen in de koude plaat voor 30-60 seconden.
5. De cassette van het weefsel van de metalen mal scheiden. Het blok van de cel paraffine is dan klaar voor immunocytochemie. De ingesloten cel clot in het blok van paraffine-ingebedde cel wordt aangegeven door de pijl in figuur 2E.

4. voorbereiding van de dia's van immunocytochemie (1 h)

1. Controleren van het gebied voor de cel clot in het blok van de cel paraffine, en het blok van de cel snijd in plakjes met diktes van 3-4 µm gebruikend microtome. Zetten de paraffine secties silane-gecoat glas dia's, zoals aangegeven in figuur 2F.
2. Plaats de sectie dia's in een oven van 37 ° C gedurende 30 minuten om de secties die voldoen aan de dia's.

5. immunocytochemie van cel blokken (6 h)

Opmerking: Voor immunocytochemische kleuring op cel-blok secties, verschillende kits kunnen worden gebruikt (Zie Tabel van materialen). Alle dergelijke kits hebben verschillende gevoeligheden en kenmerken afhankelijk van hun wijzigingen.

1. Incubeer de secties in 50 mL xyleen voor 4 min aan de paraffinize.
2. Incubeer de dia's in 100% ethanol voor 2 min voor uitdroging, en twee keer in ethanol 95%, en in 80% ethanol gedurende 2 minuten. Verwijder vervolgens de ethanol in stromend water gedurende 10 minuten.
3. Voor antigeen ophalen, plaatst u de dia's in een pot met 40 mL Tris-EDTA ophalen buffer, pH 9.0, en kook in een fornuis voor 30 min.
4. De dia's onder stromend water wassen, en hen uit te broeden in ethanol van 95% gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Vervolgens, markeert de cel-kleuring gebied op de dia's met een pen van de Pap voor gemakkelijke identificatie.
5. Wassen van de dia's in een Tris-gebufferde zoutoplossing met 0,2% tween-20 (TBS-T), en uit te broeden in het blok van waterstofperoxide (Zie Tabel van materialen) bij kamertemperatuur gedurende 15 min. enige overblijfsel peroxidase activiteit verwijderen. Vervolgens de dia's in TBS-T wassen drie keer voor elke 2 min.
6. Bereid verdunde antilichaam-oplossing door het verdunnen van primair antilichaam in het blok eiwit (Zie Tabel van materialen). Bijvoorbeeld, de CKAP2 primair antilichaam kan worden verdund 1:100, en de Ki-67 antilichaam 1:500. Vervolgens de dia's in 100 µL van verdunde antilichaam oplossing voor 1 h uit te broeden.
7. Na het wassen in TBS-T vijf keer voor elke 2 min, de dia's in de primair antilichaam enhancer in de kit voor 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker uit te broeden.
8. Na het wassen in TBS-T viermaal voor elke 2 min, voeg 2 druppels HRP polymeer (een secundair antilichaam aangeduid met mierikswortelperoxidase), en de dia's bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten uit te broeden.
9. Na het wassen in TBS-T vijf keer voor elke 2 min, voeg 100 µL van diaminobenzidine (DAB) oplossing (Zie Tabel of Materials), en de dia's gedurende 3 minuten uit te broeden.
10. Na het wassen in TBS-T twee keer, voeg 100 µL van de Haematoxyline oplossing (het mengsel van 100 µL van de haematoxyline en 600 µL van gedistilleerd water), en de dia's voor 1 min uit te broeden.
11. Na het wassen uitdrogen de dia's in TBS-T een keer door broeden in 95% ethanol voor 2 min, eenmaal dompelen in 95% ethanol en dompelen in 100% ethanol twee keer. Vervolgens de dia's in 40 mL xyleen in een glazen pot gedurende 5 minuten uit te broeden.
12. Wanneer de dia's zijn droge van xyleen, mount de respectieve coverslips.
13. Observeer de kleuring patronen met behulp van de lichte microscopie.

Resultaten

In een haematoxyline en-eosine-gebeitste dia uit de cel paraffine-ingebedde blok (figuur 3AB) zijn de meeste van de kernen en het cytoplasma van de cellen intact, suggereert dat de morfologische behoud uitstekend met de huidige protocol is ( Figuur 3A). In de immunocytochemische kleuring, werd positieve CKAP2 kleuring waargenomen in gecondenseerde chromatine, mitotische spindel en cytoplasma (Figuur 4), als eerder gemeld¹⁰. Ki-67 kleuring werd waargenomen in de celkernen, als verwachte (Figuur 4). Alleen de cellen met CKAP2 vlekken in gecondenseerde chromatine mitotische cellen (Zie de pijlen in figuur 4AB) waren. Vele CKAP2-positieve cellen werden getoond in de zeer mitotische HeLa cellen die was opgesteld na een incubatie in volledige medium (figuur 4A). Ter vergelijking waren er weinig CKAP2-positieve cellen in de serum-uitgehongerd HeLa cellen (figuur 4B). Allermeest naar de hoogst mitotische HeLa cellen werden Ki-67 positief (figuur 4C). Productiestappen, bleef het Ki-67-positieve tarief in de serum-uitgehongerd HeLa cellen zo hoog als ~ 50% (Figuur 4 d). Deze resultaten zijn zeer vergelijkbaar zijn met die van een vorige verslag^11, hetgeen suggereert dat CKAP2 een meer betrouwbare proliferatie marker in kankercellen is dan Ki-67.

In slecht voorbereid cel blokken, de kernen zijn gescheiden van het cytoplasma, en er is ook, resultantly, arme morfologische behoud. Langer-dan-'s nachts incubatie van vaste cellen in een koelkast kan zulke slechte resultaten. Een ander belangrijk probleem is dat de cellen niet goed door immunocytochemie, ondanks de uitstekende morfologie worden gekleurd. Dit probleem zich vaker voordoet wanneer de cel clot klein is. De intensiteit van kleuring is meestal onregelmatige zoals weergegeven in figuur 3B; maar wanneer de cel clot groter is, is er veel minder kans op onregelmatige kleuring. Daarom in dit protocol verhoogd we de hoeveelheid plasma, thromboplastin en calciumchloride om te vormen van een grote cel clot.

Figuur 1: cel-blok voorbereiding regeling. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2: voorbeeld van paraffine cel-blok voorbereiding. (A) thromboplastin-plasma cel clot in buis. (B) TP cel clot na het wassen van de PBS. (C) cel clot op filterpapier bevochtigd. (D) weefsel-insluiting station met gesmolten wax. Metalen mal (pijl) houdt gesmolten wax voor stolling. (E) paraffine-ingebedde cel clot (pijl) ingebed in paraffine of paraffine-ingebedde cel blok. (F) dunne paraffine sectie op het middelste deel van een gecoate dia. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 3: voorbereiding van de cel-blok en bevestiging van kwaliteit door de haematoxyline en eosine en immunokleuring. (A) de haematoxyline-en-eosine-gekleurd beeld van HeLa cellen in de sectie van een paraffine-ingebedde cel-blok. (B) onregelmatige kleuring van Ki-67 in immunocytochemie op een slecht voorbereid sectie paraffine-ingebedde cel-block. Schaal bars zijn (A) 100 en (B) 200 μm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 4: immunocytochemische kleuring op cel paraffine-ingebedde blok voor HeLa cellen. (A) CKAP2 kleuring zeer mitotische omstandigheden. (B) CKAP2 kleuring onder voorwaarden serum-uitgehongerd. (C) Ki-67 kleuring zeer mitotische omstandigheden. (D) Ki-67 kleuring onder voorwaarden serum-uitgehongerd. 100 μm schaal balken worden weergegeven. Lijn de pijlpunten uit geven aan CKAP2-positieve cellen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Procedure	Stappen	Oplossing	Tijd/temperatuur
Uitdroging	1	70% alcohol	15 min/RT
	2	80% alcohol	15 min/RT
	3	95% alcohol	15 min/RT
	4	100% alcohol	15 min/RT
Clearing	1	Xyleen	60 min/4 ° C
	2	Xyleen	10 min/RT
	3	Xyleen	10 min/RT
	4	Xyleen	10 min/RT
* RT, kamertemperatuur

Tabel 1. Weefsel veredeling.

Discussie

Immunefluorescentie kleuring op vaste gekweekte cellen is momenteel de methode van keuze voor bepaling van eiwit expressie gehalte in cellen met behoud van morfologische informatie¹. Immunocytochemie op cel paraffine-ingebedde blokken kan echter een uitstekend alternatief. De gedetailleerde procedures voor de bereiding van paraffine-ingebedde cel blokken en immunocytochemie zijn beschreven in dit protocol, en wij hopen dat het de toepassing van immunocytochemie in cel studies kan vergemakkelijken.

Immunocytochemie heeft verschillende voordelen ten opzichte van immunefluorescentie kleuring. Vers gekweekte cellen immunefluorescentie kleuring voor cellen gewoonlijk vereist, maar cel paraffineblokken houdbaar bij kamertemperatuur voor meerdere jaren¹³. Bovendien kunt immunocytochemie op cel blokken intracellulaire expressiepatronen verkennen door gebruik te maken van het zelfde antilichaam gebruikt in routine immunohistochemistry op menselijke weefsels⁴. Bovendien vindt het de veranderingen in eiwitniveaus of posttranslationele modificaties hetzij door cellen met verschillende drugs of onder verschillende cultuur voorwaarden¹¹vooraf aan het broeden.

In tegenstelling tot de voordelen van immunocytochemische kleuring, de voorbereiding van paraffine-ingebedde cel blokken kost tijd en is kostbaar¹⁴. Ook de meeste onderzoekslaboratoria niet veel ervaring in deze techniek, en technische fouten onder dergelijke omstandigheden gelden. De meest voorkomende fouten zijn arme behoud van cel morfologie en arme of onregelmatige immunocytochemische kleuring op de paraffine cel blok secties. Deze en de meeste anderen kunnen worden vermeden door het maken van cel blokken onder de beste omstandigheden van de cel en gebruiken van genoeg oplossing vormen van cel stolsels.

Als een demonstratie van het huidige protocol, cel blokken waren voorbereid op HeLa cellen, en voor twee markeringen van de proliferatie, CKAP2 en Ki-67, zoals eerder gemeld¹¹immunocytochemische kleuring werd uitgevoerd. De cellen werden gemanipuleerd door incubatie in media met en zonder foetale runderserum immunocytochemie, en het effect van serum honger kon worden waargenomen. Deze blokken bereid paraffine-ingebedde cel kunnen worden gebruikt voor een groot aantal antilichamen, omdat veel glijbanen kunnen bereid worden uit een blok van de cel met behulp van alleen een 4-5 µm dik cel-sectie block per dia. Daarom kunnen expressiepatronen overeenkomt met twee verschillende voorwaarden met verscheidene verschillende antilichamen worden geëvalueerd. De immunokleuring patronen voor CKAP2 en Ki-67 in kanker weefsels reeds gemeld^9,10,11,12, en de immunocytochemische kleuring resultaten kan gemakkelijk behandeld worden, omdat de kleuring patronen waren vrij gelijkaardig aan die van immunohistochemistry.

Kortom, kunnen immunocytochemische kleuring op cel paraffineblokken een uitstekend alternatief voor immunefluorescentie kleuring; Bovendien, het kan worden gemakkelijk en betrouwbaar ingezet bij het basisonderzoek voor expressie profilering in cellijnen behoud van morfologische informatie.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
HeLa Cellen	ATCC	HeLa (ATCC CCL-2)
Ki-67 Antilichaam	Thermo Fisher Scientific	RM-9106-S1
Paraffine	Leica	39601006
Xyleen	Fisher SCientific	1330-20-7,100-41-4
Ethenol	GD Chem	DJ16016
Hematoxylinen	Agilent	10118581
DAB Quanto Kit	Thermo Fisher Scientific	TA-125-QHDX, QHCX 170405
Ultravision LP detectie Kit	Thermo Fisher Scientific	PBQ141209, LPB141209, LPH141210	Kit voor immunocytochemie; bevat eiwitblok
TintoRetriever Drukpan	Bio SB Corporation	BSB 7008
Tris-gebufferde zoutoplossing	iNtRON Biotechnology	IBS-BT008
Tween 20	USB Corporation	115106
Tromboplastine	Neoplastin Cl Plus	NC0591432
Tris-EDTA herstelpuffer	Dignostic Biosystem	E625-A
Trypsine EDTA	Thermo Fisher Scientific	25200056
Fetaal bovien serum (FBS)	Hyclone Laboratories Inc	SH30910.03
DMEM	Hyclone Laboratories Inc	SH30243.01
Antibiotic-Antimycotic, 100X	Thermo Fisher Scientific	15240062
Ultra vision peroxide blok H2O2	Thermo Fisher Scientific	02Q141212
Montage Medium	Thermo Fisher Scientific	363313
Pap-Pen	Vector Laboratories	H-4000
Filterpapier	GE Healthcare Life Sciences	1001-0155
Calciumchloride	Sigma-Aldrich	21115-100ml
Fosfaat-gebufferde zoutoplossing	PAA Laboratories	H21-002
Formaline	Daejung	50-00-0
15 ml buis	SPL Life Sciences	50015
weefselverwerkingscassette	Simport	M492-5
100 mm kweekschalen	BD Biosciences	08-772E
Glazen plaat	Muto Pure Chemicals	140712
Dekglas	Marienfeld	2262817
Glazen Zar	Hyunil Lab-Mate	HIP-1027
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Class II Laminar Flow Hood	Thermo Fisher Scientific	1300 series A2
CO2 Incubator	Thermo Fisher Scientific	Series A2
Weefsel Processor	Leica BioSystem	TP1020
Microtoom	Thermo Fisher Scientific	HM340E
Microscoop	Olympus	CX-21
Paraffine inbeddingsstation	Thermo Fisher Scientific	EC 350-1, EC 350-2
Weefsel Sectie Bad (Rond)	CellPath	HCP-JAW-0100-00AEU
Afzuigkap	Hanyang Scientific Equipment Co. Ltd.	FH-150