Fabricage van een Multiplexed kunstmatige cellulaire communicatie Array

Summary

Dit artikel beschrijft de gedetailleerde methodologie ter voorbereiding van een Multiplexed kunstmatige cellulaire communicatie (MACME)-array voor high-throughput manipulatie van fysische en chemische cues nabootsen in vivo cellulaire microenvironments en aan het identificeren van de optimale cellulaire omgeving voor menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) met eencellige profilering.

Abstract

Cellulaire microenvironments bestaan uit een aantal signalen, zoals groeifactoren, extracellulaire matrices en intercellulaire interacties. Deze signalen zijn goed georkestreerd en cruciaal bij het reguleren van de functies van de cel in een levend systeem. Hoewel een aantal onderzoekers hebben geprobeerd te onderzoeken van de correlatie tussen milieufactoren en gewenste cellulaire functies, er nog veel onbekend. Dit is grotendeels te wijten aan het ontbreken van een juiste methodologie te bootsen zo'n milieu signalen in vitro, gelijktijdig testen met verschillende milieu aanwijzingen op cellen. Wij rapporteren hier, een geïntegreerd platform van microfluidic kanalen en een array van de nanofiber, gevolgd door hoge-eencellige inhoudsanalyse, te onderzoeken van de stamcel fenotypen gewijzigd door verschillende omgevingsfactoren. Om aan te tonen van de toepassing van dit platform, deze studie concentreert zich op de fenotypen van zelf vernieuwen van menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs). Hier presenteren we de procedures van de voorbereiding voor een matrix van de nanofiber en de microfluidic-structuur in de fabricage van een array Multiplexed kunstmatige cellulaire communicatie (MACME). Bovendien de algemene stappen voor de eencellige profiling, cel kleuring met meerdere fluorescente markeringen, meerdere fluorescentie imaging en statistische analyses, worden beschreven.

Introduction

Menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs)^1,2 zelf vernieuwen onbeperkt en onderscheid in verschillende geslachten van weefsel, die kunnen een revolutie Geneesmiddelenontwikkeling, cel-gebaseerde therapieën, weefselkweek en regeneratieve geneeskunde ^{3 , 4 , 5 , 6}. algemene cultuur gerechten en microtiterplaat platen, echter zijn niet ontworpen om precieze cel van de fysische en chemische manipulatie op cellulair niveau met het bereik van nano - tot micro-meters, die een kritische fac....

Protocol

1. fabricage van MACME matrix

Opmerking: Alle materialen en uitrusting worden opgesomd in de tabel van de materialen.

1. Voorbereiding van de maskers voor de array van een nanofiber en een mal voor een microfluidic structuur
   1. Het maken van driedimensionale (3D) beelden van maskers gebruikt voor de nanofiber arrays en mallen voor microfluidic structuren met behulp van 3D-computergraphics softwarepakketten (tabel 1).
      Opmerking: De 3D-beelden worden gelezen of afgedrukt door een 3D-printer. De afgedrukte maskers en schimmel hebben dezelfde afmetingen met 3D-beelden die zijn....

Results

MACME arrays: ontwerp en fabricatie: In combinatie met nanofiber technologie gebruikten we de cultuur van de cel van de microfluidic- en screeningsprocedures van eerder gebruikte om te identificeren van de optimale omstandigheden voor hPSC zelf-vernieuwing of differentiatie^35,36 (Figuur 1) technieken. Dit is zeer geschikt voor het opzetten van robuuste hoge gegevensdoorvoer cel-gebase.......

Discussion

Dit protocol wordt de eerste screeningsmethode om een systeem van de robuuste cultuur voor het onderhoud van gekwalificeerde hPSCs gedemonstreerd. Eerst, beschreven we hoe voor te bereiden op een platform met gevarieerde kunstmatige ECMs en cel dichtheden zaaien met behulp van een microfluidic apparaat geïntegreerd met een nanofiber-serie, de MACME array. Tweede, kwantitatieve beeld-gebaseerde eencellige fenotypering was uitgevoerd⁵⁰ individuele cellulaire resultaten en gedrag veranderd door versc.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polystyrene (PS)	Sigma	#182435	Average Mw: 290,000, average Mn: 130,000
Polymethylglutarimide (PMGI)	MicroChem	G113113
Gelatin (GT)	Sigma	G2625	From porcine skin, type A
Sylgard 184 silicone elastomer kit	Doe Corning Toray	#1064291	PDMS curing agent and silicone elastomer base are components of this kit.
OpenSCAD			This is a free 3D computer graphics software (http://www.openscad.org/) used for designing the mold of the microfluidic device.
AutoCAD 2014	Autodesk		This is a 3D computer graphics software (https://www.autodesk.com/products/autocad/overview) used for design of the mask used on nanofiber-array preparation.
3D printer, AGILISTA-3000	Keyence
UV-curable resin, AR-M2	Keyence		This is used for 3D printing by Agilista.
Acetic acid	Sigma	#338826	≥99.99%
Ethyl acetate	Sigma	#270989	Anhydrous, 99.8%
Tetrahydrofuran (THF)	Sigma	#401757
MSP-30T	Vacuum Device		Magnetron sputtering machine
Nunc OmniTray	Thermo Fisher Scientific	#242811	This is a polystyrene baseplate on which the nanofiber array is created. This plate size is typically 127.7 x 85.5 mm.
Gun-type corona discharge machine	Shinko Electric & Instrumentation	CFG-500	This handy device is used to generate corona for activation of the bottom surface of the PDMS layer at step 1.5 "Assembly of the MACME arrays" in the protocol.
5 mL syringe	Terumo	SS-05SZ
Stainless-steel blunt needle (23-gauge)	Nipro	#2166	Outside diameter and length are 0.6 and 32 mm, respectively.
High-voltage power supply	TechDempaz
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, hydrochloride	Dojindo	W001
N-Hydroxysuccinimide	Sigma	#56480
Matrigel hESC-Qualified Matrix	Corning	#354277	This protein is refered as basement membrane gel matrix in the protocol.
CellAdhere Vitronectin, Human, Solution	STEMCELL Technologies	#07004
TeSR-E8	STEMCELL Technologies	#05940	Feeder-free, xeno-free culture medium for maintenance of human ES and iPS cells
Y-27632	Wako Pure Chemical Industries	#253-00513
TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red	Thermo Fisher Scientific	#12605028	This ia a recombinant trypsin-like protease for dissociation of adherant mammalian cells.
Click-iT EdU Imaging Kit with Alexa Fluor 647 Azides	Thermo Fisher Scientific	C10086	The fluorescent labeling of proliferating cells in on-plate fluorescent staining was performed along the product manual of this kit.
Annexin V, Alexa Fluor 594 conjugate	Thermo Fisher Scientific	A13203
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Thermo Fisher Scientific	D1306
Oct-3/4 Antibody (C-10)	Santa Cruz Biotechnology	sc-5279
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (DyLight 488)	abcam	ab96875	This is a secondary antibody used in on-plate fluorescent cell staining.
ECLIPSE Ti-E	Nikon		This is an inverted fluorescence microscope equipped with a CFI Plan Fluor 4×/0.13 N.A. objective lens (Nikon), CCD camera (ORCA-R2, Hamamatsu), mercury lamp (Intensilight, Nikon), XYZ automated stage (Ti-S-ER motorized stage with encoders, Nikon), and filter cubes for four fluorescence channels (DAPI, GFP HYQ, TRITC, Cy5; Nikon)
NIS-Elements Advanced Research	Nikon		This is a microscope imaging software used for automatic image acquisition.
CellProfiler, Version 2.1.0			This is a free open software for cell image analysis (http://cellprofiler.org/).
R			SOM analysis is performed by kohonen package of this software. This is freely available (https://www.r-project.org/).
Cluster 3.0			This is the open source clustering software (http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm). Unsupervised hierarchical clustering is performed with this software.
Java TreeView			This open source software (http://jtreeview.sourceforge.net/) is used to visualize clustering data as a heatmap and a dendrogram.
H9 human embryonic stem cell	WiCell Stem Cell Bank	WA09