Method Article

Fabricage van een Multiplexed kunstmatige cellulaire communicatie Array

DOI:

10.3791/57377

⸱

September 7th, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Integrated Cell-Material Sciences (WPI-iCeMS), Kyoto University, 2Department of Life Science and Technology, School of Life Science and Technology, Tokyo Institute of Technology, 3Biomaterials Center for Regenerative Medical Engineering, Foundation for Advancement of International Science, 4Faculty of Science and Natural Resources, Universiti Malaysia Sabah, 5Institute for Chemical Research, Kyoto University, 6Ecole Normale Supérieure

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel beschrijft de gedetailleerde methodologie ter voorbereiding van een Multiplexed kunstmatige cellulaire communicatie (MACME)-array voor high-throughput manipulatie van fysische en chemische cues nabootsen in vivo cellulaire microenvironments en aan het identificeren van de optimale cellulaire omgeving voor menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) met eencellige profilering.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cellulaire microenvironments bestaan uit een aantal signalen, zoals groeifactoren, extracellulaire matrices en intercellulaire interacties. Deze signalen zijn goed georkestreerd en cruciaal bij het reguleren van de functies van de cel in een levend systeem. Hoewel een aantal onderzoekers hebben geprobeerd te onderzoeken van de correlatie tussen milieufactoren en gewenste cellulaire functies, er nog veel onbekend. Dit is grotendeels te wijten aan het ontbreken van een juiste methodologie te bootsen zo'n milieu signalen in vitro, gelijktijdig testen met verschillende milieu aanwijzingen op cellen. Wij rapporteren hier, een geïntegreerd platform van microfluidic kanalen en een array van de nanofiber, gevolgd door hoge-eencellige inhoudsanalyse, te onderzoeken van de stamcel fenotypen gewijzigd door verschillende omgevingsfactoren. Om aan te tonen van de toepassing van dit platform, deze studie concentreert zich op de fenotypen van zelf vernieuwen van menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs). Hier presenteren we de procedures van de voorbereiding voor een matrix van de nanofiber en de microfluidic-structuur in de fabricage van een array Multiplexed kunstmatige cellulaire communicatie (MACME). Bovendien de algemene stappen voor de eencellige profiling, cel kleuring met meerdere fluorescente markeringen, meerdere fluorescentie imaging en statistische analyses, worden beschreven.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs)1,2 zelf vernieuwen onbeperkt en onderscheid in verschillende geslachten van weefsel, die kunnen een revolutie Geneesmiddelenontwikkeling, cel-gebaseerde therapieën, weefselkweek en regeneratieve geneeskunde 3 , 4 , 5 , 6. algemene cultuur gerechten en microtiterplaat platen, echter zijn niet ontworpen om precieze cel van de fysische en chemische manipulatie op cellulair niveau met het bereik van nano - tot micro-meters, die een kritische factor voor cellulaire expansie is, zelf-vernieuwing en differentiatie. Om aan te pakken dit nadeel, hebben studies onderzocht de rol van cellulaire microenvironments bij het reguleren van de cel-lot besluiten en cel functies4. In de afgelopen jaren zijn een toenemend aantal studies uitgevoerd om te reconstrueren van cellulaire microenvironments in vitro7,8. Nano - en micro-fabricage processen hebben deze microenvironments door de manipulatie van chemische9,10,11,12,13, vastgesteld 14,,15,16,17 en fysieke18,19,20 milieu signalen. Tot nu toe waren er geen meldingen te systematisch onderzoeken van de onderliggende mechanismen van chemische en fysische milieu signalen op cel-lot besluiten en functies binnen een enkel platform.

Hier introduceren we een strategie gebaseerd op eenvoudig ontwerpprincipes om een robuuste screening platform (Figuur 1). Eerst beschrijven we de procedure van de ontwikkeling van een geïntegreerd platform voor het maken van de veelzijdige, kunstmatige cellulaire microenvironments met behulp van een nanofiber array en een microfluidic structuur: de Multiplexed kunstmatige cellulaire communicatie (MACME) matrix (Figuur 1A en 2A). De nanofiber array heeft 12 verschillende microenvironments in wisselende combinaties van nanofiber materialen en dichtheden. Electrospinning werd gebruikt om nanofibers te fabriceren. De nanofiber materialen, zoals polystyreen (PS)21, polymethylglutarimide (PMGI)22en gelatine (GT)23, werden ontworpen voor het testen van hun chemische eigenschappen, die later nog van invloed kunnen zijn op cel adhesie en het onderhoud van pluripotent ( Figuur 2B). Nanofiber dichtheden waren gevarieerd door het veranderen van electrospinning tijd en de geproduceerde nanofibers werden gedefinieerd volgens hun dichtheid (niet gefinisht, met D = XLow/Low/Mid/High). De microfluidic structuur bestaat uit Polydimethylsiloxaan (PDMS) 48 celkweek kamers, die kunnen worden geplaatst langs de standaard afmetingen van de 96-Wells-microplate herbergen. PDMS is een biocompatibel en gas-inwisselbaar polymeer gewoonlijk gebruikt voor het fabriceren van microfluidic apparaten24. Elk kanaal van de microfluidic werd ontworpen om 700-µm breed en 8.4-mm lang en had twee inhammen aan de randen (tabel 1). De kamers hadden verschillende hoogtes (250, 500 en 1000 µm) te manipuleren van de eerste cel-zaaien dichtheden (0.3 en 0.6 1,2 × 105 cellen/cm2), die met overleven, proliferatie en differentiatie van hPSCs25 correleren kunnen (Figuur 2C). Het aantal cellen zaadjes in een kamer is evenredig met de dichtheid van de kolom boven de vloer van de kamer, en dus de eerste cel zaaien dichtheid werd gecontroleerd door de invoering van de dezelfde celsuspensie in cultuur kamers met verschillende hoogtes. Alle zenders werden ontworpen om ≥ 250-µm hoge26 om te minimaliseren van de effecten van lage-zuurstof-spanning27 en schuifspanning28 op de cellen. Kanaal hoogten van 250, 500 en 1000 µm hier hierna afgekort als XCD met X = Low, Mid, en hoog, respectievelijk. De omgevingen met verschillende nanofiber dichtheden en eerste cel-zaaien dichtheden waren afgekort als "Material_NF density_Cell dichtheid" (bijvoorbeeld, GT_HighNF_HighCD: een milieu gekenmerkt door high-density GT nanofibers en hoge initiële cel-zaaien dichtheid).

Vervolgens beschrijven we hoe eencellige analyses voor het systematisch onderzoek naar cel gedrag in reactie op milieu-factoren (Figuur 1B) uitvoeren. Als een bewijs-van-concept geïdentificeerd we de optimale cellulaire omgeving voor hPSC zelf-vernieuwing, dat is een belangrijke functie voor hPSC onderhoud (Figuur 1B)29. Beeld-gebaseerde cytometry, gevolgd door statistische analyses, zorgt voor kwantitatieve interpretatie van individuele cellulaire fenotypische reacties op cellulaire omgevingen. Onder een verscheidenheid van cellulaire functies biedt dit Witboek een gedetailleerde procedure ter identificatie van de optimale voorwaarden voor het behoud van hPSC zelf-vernieuwing.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. fabricage van MACME matrix

Opmerking: Alle materialen en uitrusting worden opgesomd in de tabel van de materialen.

  1. Voorbereiding van de maskers voor de array van een nanofiber en een mal voor een microfluidic structuur
    1. Het maken van driedimensionale (3D) beelden van maskers gebruikt voor de nanofiber arrays en mallen voor microfluidic structuren met behulp van 3D-computergraphics softwarepakketten (tabel 1).
      Opmerking: De 3D-beelden worden gelezen of afgedrukt door een 3D-printer. De afgedrukte maskers en schimmel hebben dezelfde afmetingen met 3D-beelden die zijn gedefinieerd met behulp van de grafische software bij stap 1.1.1.
    2. Maskers en een schimmel die op basis van deze ontwerpen met behulp van een 3D-printer afdrukken.
      Opmerking: In dit protocol was een 3D-printer van de inkt-jet-achtige met UV-uithardende hars gebruikte30. De printerresolutie was 635 × 400 dpi en 15 µm in X, Y en Z, respectievelijk de werkelijke X, Y resolutie was echter ongeveer vier keer lager.
  2. Nanofiber-matrix voorbereiding (Figuur 3A)
    1. Polymeeroplossingen voorbereiden op electrospinning.
      1. Verdun 13% PMGI vloeistof met tetrahydrofuraan door 9% (m/v)22.
      2. Los 0.08 g PS (aantalgemiddeld molecuulgewicht (Mn): 130.000) in THF:dimethylformamide (1:1 volumeverhouding)21, en THF:dimethylformamide om het volume tot de uiteindelijke 1 mL (8% (m/v) PS oplossing) toe te voegen.
      3. Los 0,1 g GT in water: acetic acid: ethylacetaat (1:1.6:2.1 volumeverhouding), en voeg water: acetic acid: ethylacetaat toe zodat het volume tot de uiteindelijke 1 mL (10% (m/v) GT-oplossing) als beschreven23,31.
    2. Gebruiken van een magnetron sputteren machine, een platina laagje storten met een dikte van 5-nm op een polystyreen (PS) basisplaat (127.7 × 85,5 mm), die als een kathode in het electrospinning-setup fungeert.
    3. Laad elke polymeeroplossing in een 5-mL injectiespuit voorzien van een 23-G roestvrij staal botte naald.
    4. Plaats en anker de spuit met de naald op een spuitpomp met 12 cm naast de verzamelaar van het electrospinning-apparaat.
    5. De naald van de spuit verbinden met een hoog-voltage power supply en ingesteld om te passen tot en met 11 kV.
    6. Stelt het pompen tarief van 0,2 mL/h.
    7. Houd de temperatuur en vochtigheid op 30 ° C en < 30% (v/v).
    8. Zet het masker op de basisplaat voorbereid op stap 1.2.2.
    9. Fabriceren nanofibers op de basisplaat door de gaatjes van masker met verschillende dichtheden door het veranderen van de electrospinning tijd (bijvoorbeeld 20, 60, 90 en 180 s).
    10. Verwijder het masker van de basisplaat.
      Opmerking. Ethanol kan worden gespoten op de electrospun GT nanofibers voordat u het masker Voorkom peeling uit GT nanofibers samen met het masker verwijdert.
    11. Herhaal stap 1.2.4-1.2.10 tot de voltooiingvan nanofiber-matrix fabricage.
    12. Plaats de nanofiber array in een exsiccator bij 25 ° C voor 16 h tot het resterende oplosmiddel te verdampen.
    13. Crosslink GT nanofibers met 0,2 M 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) en 0.2 M N-hydroxysuccinimide (NHS) in ethanol bij 25 ° C gedurende 4 h23.
    14. Spoel GT nanofibers tweemaal met 99,5% (v/v) ethanol en droog met een vacuüm bij 25 ° C voor 16 h.
  3. Vervaardiging van microfluidic structuren (Figuur 3B)
    1. Meng 2 g PDMS genezen agent en 20 g voor PDMS base (1:10 gewicht verhouding; Pre-PDMS). 24
    2. Giet het mengsel van de pre-PDMS op de mal vervaardigd in stap 1.2.
    3. Ambtshalve gas het pre-PDMS mengsel in een exsiccator gedurende 30 minuten.
    4. Het genezen van het pre-PDMS mengsel in een oven bij 65 ° C gedurende 16 h.
  4. Montage van MACME arrays (Figuur 3B)
    1. De structuur van de PDMS genezen bij stap 1.3.4 van de schimmel en schoon met 70% (v/v) ethanol afschilferen.
    2. Traktatie atmosferische corona kwijting aan de onderzijde van het PDMS structuur32.
      Opmerking: In dit protocol, wordt de corona geloosd op het gehele oppervlak een laag 3 of 4 keer met een "Handy" corona kwijting apparaat. Zuurstof plasma behandeling werd vervangen door atmosferische corona kwijting te wijzigen van de oppervlakte hechting.
    3. De PDMS structuur met de nanofiber array snel monteren.
    4. Oven-bak bij 65° C gedurende 2 dagen.

2. laden hESCs in MACME Array

  1. Voor de routinematige cultuur van H9 menselijke embryonale stamcellen (hESCs), handhaven cellen in xeno-vrij chemisch welbepaald kweekmedium voor hPSC onderhoud33 aangevuld met 10 µM Y-27632 ROCK remmer34 (hPSC medium genoemd) in een celkweek voor 35-mm schotel bedekt met kelder membraan gel matrix (MG).
  2. Passage cellen elke 4 tot en met 7 dagen met behulp van een recombinant trypsine-achtige proteaseremmers toegediend krijgen.
  3. Een MACME matrix met 99,5% ethanol, steriliseren in laden in de kamers gedurende 10 minuten en verwijder de ethanol. Herhaal deze stap 3 keer.
  4. 12 µL van MG, 10 µg/mL vitronectin (viool), introduceren en 0,1% (g/v) GT in besturingselement cultuur kamers, en de kamers bij 37 ° C gedurende 1 h jas hen op de oppervlakken van de kamer uit te broeden.
    Opmerking: In dit protocol, MG, VN en GT uitgekozen als referentie eiwitten voor cel adhesie en cultuur. Omdat MG en VN standaard celkweek-matrices gebruikt zijn voor het behoud van hPSC zelf-vernieuwing, worden ze gebruikt als positieve controle; tweedimensionale GT coating (2DGT) of niet-coating (NC) werden gebruikt als negatieve controles.
  5. Voorverwarmde hPSC medium in alle kamers van MACME matrix introduceren. Incubeer de kamers gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
  6. Wassen H9 hESC gekweekt op een 35-mm schotel met DPBS, 0,5 mL van een recombinant trypsine-achtige protease toevoegen aan de schotel en Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 minuut en zorgvuldig alleen het supernatant gemengd met protease gecombineerd.
    Opmerking: Bij de aspiratie stap, de cellen niet losgekoppeld.
  7. Onmiddellijk toevoegen hPSC medium, zachtjes afzien van het medium tegen het oppervlak van de schotel herhaaldelijk te distantiëren van de cellen en de vrijstaande cellen overbrengen in een conische buis 15 mL.
  8. Centrifugeer bij 200 x g voor 3 min. Aspirate het supernatant en opschorten van cellen in een voorverwarmde hPSC medium.
  9. 12 µL van de celsuspensie (1,2 × 106 cellen/mL) in elke kamer van microfluidic te introduceren.
    Opmerking: Cellen kennismaken met één kamer van een andere met behulp van een micropipet. Omdat het aantal cellen zaadjes aan kamers evenredig met de dichtheid van de kolom boven de vloer van de kamer is, kan de eerste cel-zaaien dichtheid worden gecontroleerd hoewel monsters van dezelfde celsuspensie werden gebruikt. Zorgen pipetteren voorzichtig wordt gedaan. Verwijder overtollige medium uit de kamers via een stick van katoen-tipped na het laden. De MACME matrix is compatibel met zowel gebruikte laboratorium pipetten en geautomatiseerde Pipetteer systemen, en het vereist geen speciale apparatuur.
  10. Elke 12 h en cultuur hPSC medium wijzigen voor 4 dagen.
    Opmerking: Constante volumes van het medium (1.6, 3.2 en 6,4 µL) worden bijgehouden met behulp van de kamers van verschillende grootte. De cellen van de cultuur onder een rusttoestand om te minimaliseren van shear stress met uitzondering van de uitwisseling van de cel kweekmedium35,36.

3. kwantitatieve eencellige profilering

  1. Op-plaat fluorescerende cel kleuring
    Opmerking:     voor het analyseren van fenotypische veranderingen van het hPSCs zelf te vernieuwen, dit protocol geselecteerd drie belangrijke fenotypische markeringen voor dit protocol: OCT4, 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU), en Annexine V, voor het meten van de status van pluripotent, proliferatie, en apoptose , respectievelijk (Figuur 2b). 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) wordt gebruikt voor het identificeren van celkernen. OCT4 is één van de kritische transcriptiefactoren van pluripotent.
    1. Incubeer H9 hESCs in MACME matrices in hPSC medium aangevuld met 10 µM EdU alkyn bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
    2. Vlek na het wassen met Annexine-bindende buffer (10 mM HEPES (pH 7.4), 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl2), de cellen met een oranje-belichting fluorescerende kleurstof-Annexine V-conjugaat bij 20 ° C gedurende 15 minuten.
    3. Los van de cellen in PBS met 4% (v/v) paraformaldehyde bij 20 ° C gedurende 15 minuten en spoel tweemaal op cellen met PBS.
    4. Permeabilize cellen met behulp van PBS met 0,3% (v/v) Triton X-100 bij 20 ° C voor 16 h.
      Opmerking: Paraformaldehyde verzwakt de band tussen een kunststof grondplaat en een PDMS microfluidic structuur. Het detachement van de PDMS laag uit de array bij stap 3.2.1 kan dus ook worden uitgevoerd direct na deze stap.
    5. Incubeer de cellen in Tris gebaseerde reactie buffer met een rood-fluorescerende kleurstof azide bij 20 ° C gedurende 30 minuten.
    6. Incubeer de cellen in de blokkeerbuffer (PBS met 5% (v/v) normale geit serum, 5% (v/v) normale ezel serum, 3% (m/v) bovien serumalbumine, 0,1% (v/v) Tween-20 en 0,1% (g/v) N-dodecyl-β-D-maltoside) bij 4 ° C voor 16 h.
    7. Incubeer in PBS met 0,5% (v/v) Triton X-100 oplossing en menselijke OCT3/4 antilichaam (muis IgG) bij 4 ° C voor 16 h.
    8. Incubeer in blokkeerbuffer met groen-fluorescerende kleurstof-geëtiketteerden ezel-antimuis IgG (H + L) bij 37 ° C gedurende 60 minuten.
    9. Incubeer in PBS met DAPI bij 20 ° C gedurende 30 minuten.
    10. PBS-DAPI vervangen door PBS.
    11. De matrix van de MACME bij 4 ° C tot Beeldacquisitie behouden.
  2. Beeld van de overname (Figuur 4)
    1. Afschilferen van de PDMS microfluidic structuur van de MACME array.
    2. Verwijder de resterende PBS uit de MACME matrix, 90%(v/v) glycerol in PBS toepassen op de cellen en plaats van coverslips over de gekleurde cellen.
    3. Stel de plaat ondersteboven op het podium van een omgekeerde fluorescentie Microscoop.
    4. 12-bits kleurenafbeeldingen automatisch met behulp van alle gemotoriseerde onderdelen (toneel, filters, sluitertijd en focus systemen), die werden gecontroleerd door een Microscoop beeldbewerkingssoftware te verwerven.
      Opmerking. In dit protocol blootstelling tijden zijn aangepast om in de buurt van maximale intensiteitswaarden bereiken (hoogste intensiteit van de pixel: 4096), maar geen verzadiging, voor elke afbeelding, DAPI, OCT4, Annexine V en EdU.
  3. Computer-geleide beeldverwerking en fluorescentie signaal kwantificering (Figuur 5)
    Opmerking:     de volgende cel beeldanalyse wordt uitgevoerd op basis van een eerder beschreven methode37.
    1. Kleurenafbeeldingen omzetten in grijswaarden.
    2. Een enkele drempelwaarde voor elke afbeelding DAPI berekenen met de methode Otsu en classificeren van pixels boven de drempel als voorgrond en hieronder als achtergrond. Zorg ervoor dat de voorgrond waarde komt met de fluorescerende intensiteit van de DAPI overeen.
      Opmerking: De analyse van de installatiekopie bevat 5 stappen; identificatie van primaire objecten in de DAPI beelden, identificatie van secundaire objecten in OCT4, Annexine V en EdU beelden, respectievelijk, en meting van de intensiteit van het object. Figuur 3 biedt de beelden van de grafische gebruikersinterface (GUI) op de instelling van de beeldverwerking.
    3. De fluorescerende intensiteiten van OCT4 en EdU op elke afbeelding te meten.
    4. De regio gekleurd met Annexine V met de voortplanting methode identificeren en kwantificeren van de fluorescerende intensiteit.
  4. 3.4. statistische analyse te visualiseren van individuele cellulaire fenotypen op eencellige imaging
    1. Normaliseren de input fluorescerende intensiteiten van iedere fenotypische markeerdraad door centreren en schalen van deze variabelen om hen gelijk gewicht.
    2. Zelf-organiserende kaart (SOM) analyses uit te voeren met behulp van een software-omgeving voor statistische berekeningen en afbeeldingen zoals beschreven door eerdere studies38,39.
      1. 25 SOM knooppunten maken met kenmerkende vier "codebook vectoren," overeenkomt met de fluorescerende intensiteiten van vier markeringen, DAPI, EdU, V Annexine en OCT4.
      2. Afzonderlijke cellen in elke communicatie toewijzen aan een "winnende" (meest vergelijkbaar) knooppunt, en plot als cel frequentie, volgens welke de codebook vectoren van het winnende knooppunt worden bijgewerkt met behulp van een gewogen gemiddelde, waar het gewicht is het tarief leren (hier, 0.05 als standaard).
        Opmerking: Gegevens van kamers met minder dan 1000 cellen omdat datasets met een paar cellen niet statistisch relevante SOM resultaten verstrekten weglaten.
    3. Ongecontroleerde hiërarchische clustering met de waarden van de SOM-knooppunt met behulp van de methode van de gemiddelde-koppeling op basis van Pearson correlatie met een clustering software40uitvoeren
    4. De clustering gegevens renderen in dendrogram en heatmap beziet41.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MACME arrays: ontwerp en fabricatie: In combinatie met nanofiber technologie gebruikten we de cultuur van de cel van de microfluidic- en screeningsprocedures van eerder gebruikte om te identificeren van de optimale omstandigheden voor hPSC zelf-vernieuwing of differentiatie35,36 (Figuur 1) technieken. Dit is zeer geschikt voor het opzetten van robuuste hoge gegevensdoorvoer cel-gebase...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol wordt de eerste screeningsmethode om een systeem van de robuuste cultuur voor het onderhoud van gekwalificeerde hPSCs gedemonstreerd. Eerst, beschreven we hoe voor te bereiden op een platform met gevarieerde kunstmatige ECMs en cel dichtheden zaaien met behulp van een microfluidic apparaat geïntegreerd met een nanofiber-serie, de MACME array. Tweede, kwantitatieve beeld-gebaseerde eencellige fenotypering was uitgevoerd50 individuele cellulaire resultaten en gedrag veranderd door versc...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We bedanken Prof. N. Nakatsuji op iCeMS, de Universiteit van Kyoto, voor het verstrekken van menselijke ES-cellen. Wij danken ook Prof. A. Maruyama aan Tokyo Institute of Technology voor zijn ondersteuning bij het gebruik van de atomaire kracht Microscoop. Financiering was gulle wijze aangeboden door de vereniging van Japan voor de promotie van wetenschap (JSPS; 22350104, 23681028, 25886006 en 24656502); financiering werd ook verstrekt door de nieuwe energie en industriële technologie ontwikkeling organisatie (NEDO) en de Terumo Life Science Foundation. De WPI-iCeMS wordt ondersteund door de World Premier International Research Centrum initiatief (WPI), het ministerie van onderwijs, cultuur, sport, wetenschap en technologie (MEXT), Japan. Een deel van dit werk werd gesteund door de Kyoto Universiteit nanotechnologie Hub en het AIST Nano-Processing Facility in "Nanotechnologie Platform Project" gesponsord door MEXT, Japan.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Polystyrene (PS)Sigma#182435Gemiddeld Mw: 290.000, gemiddeld Mn: 130.000
Polymethylglutarimide (PMGI)MicroChemG113113
Gelatine (GT)SigmaG2625Van varkenshuid, type A
Sylgard 184 silicone elastomer kitDoe Corning Toray#1064291PDMS-hardingsmiddel en siliconenelastomeerbasis zijn componenten van dit kit.
OpenSCADDit is een gratis 3D-computersoftware (http://www.openscad.org/) die wordt gebruikt voor het ontwerpen van de mal van het microfluïdische apparaat.
AutoCAD 2014AutodeskDit is een 3D-computersoftware (https://www.autodesk.com/products/autocad/overview) die wordt gebruikt voor het ontwerp van het masker dat wordt gebruikt bij de bereiding van nanofiber-array.
3D-printer, AGILISTA-3000Keyence
UV-hardende hars, AR-M2KeyenceDit wordt gebruikt voor 3D-printen door Agilista.
AzijnzuurSigma#338826≥99,99%
EthylacetaatSigma#270989Watervrij, 99,8%
Tetrahydrofuraan (THF)Sigma#401757
MSP-30TVacuum DeviceMagnetron sputtering machine
Nunc OmniTrayThermo Fisher Scientific#242811Dit is een polystyreen-basisplaat waarop het nanofiber-array wordt gemaakt. Deze plaatmaat is meestal 127,7 x 85,5 mm. 
Corona-ontladingsapparaat van het type gunShinko Electric & InstrumentationCFG-500Dit handige apparaat wordt gebruikt om corona te genereren voor activering van de onderkant van de PDMS-laag in stap 1.5 "Samenstelling van de MACME-arrays" in het protocol.
5 mL spuitTerumoSS-05SZ
Blunt naald van roestvrij staal (23-gauge)Nipro#2166Buitendiameter en lengte zijn respectievelijk 0,6 en 32 mm.
HoogspanningsvoedingTechDempaz
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, hydrochlorideDojindoW001
N-HydroxysuccinimideSigma#56480
Matrigel hESC-Qualified MatrixCorning#354277Dit eiwit wordt aangeduid als basement membrane gel matrix in het protocol.
CellAdhere Vitronectin, Human, SolutionSTEMCELL Technologies#07004
TeSR-E8STEMCELL Technologies#05940Feeder-free, xeno-free kweekmedium voor onderhoud van humane ES- en iPS-cellen
Y-27632Wako Pure Chemical Industries#253-00513
TrypLE Express Enzyme (1X), fenolroodThermo Fisher Scientific#12605028Dit is een recombinant trypsin-achtig protease voor dissociatie van adherante zoogdiercellen.
Click-iT EdU Imaging Kit met Alexa Fluor 647 AzideThermo Fisher ScientificC10086De fluorescente markering van proliferatieve cellen in fluorescente bekleuring op de plaat werd uitgevoerd volgens de producthandleiding van dit kit.
Annexin V, Alexa Fluor 594-conjugaatThermo Fisher ScientificA13203
4',6-diamidino-2-fenylindole (DAPI)Thermo Fisher ScientificD1306
Oct-3/4 Antilichaam (C-10)Santa Cruz Biotechnologysc-5279
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (DyLight 488)abcamab96875Dit is een secundair antilichaam dat wordt gebruikt bij fluorescente celkleuring op de plaat.
ECLIPSE Ti-ENikonDit is een omgekeerde fluorescentiemicroscoop uitgerust met een CFI Plan Fluor 4×/0.13 N.A. objectieflens (Nikon), CCD-camera (ORCA-R2, Hamamatsu), kwiklamp (Intensilight, Nikon), XYZ geautomatiseerd stage (Ti-S-ER gemotoriseerde stage met encoders, Nikon) en filterkubussen voor vier fluorescentiekanalen (DAPI, GFP HYQ, TRITC, Cy5; Nikon)
NIS-Elements Advanced ResearchNikonDit is een microscoopbeeldsoftware die wordt gebruikt voor automatische beeldverwerving.
CellProfiler, versie 2.1.0Dit is een gratis open software voor celbeeldanalyse (http://cellprofiler.org/).
RSOM-analyse wordt uitgevoerd door het kohonen-pakket van deze software. Dit is vrij beschikbaar (https://www.r-project.org/).
Cluster 3.0Dit is de open source clusteringsoftware (http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm). Onbegeleide hiërarchische clustering wordt uitgevoerd met deze software.
Java TreeViewDeze open source software (http://jtreeview.sourceforge.net/) wordt gebruikt om clusteringgegevens te visualiseren als een heatmap en een dendrograam.
H9 menselijke embryonale stamcelWiCell Stem Cell BankWA09

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  2. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  3. Ameen, C., et al. Human embryonic stem cells: Current technologies and emerging industrial applications. Crit Rev Oncol Hematol. 65 (1), 54-80 (2008).
  4. Nishikawa, S., Goldstein, R. A., Nierras, C. R. The promise of human induced pluripotent stem cells for research and therapy. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (9), 725-729 (2008).
  5. Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481 (7381), 295-305 (2012).
  6. Sartipy, P., Bjorquist, P., Strehl, R., Hyllner, J. The application of human embryonic stem cell technologies to drug discovery. Drug Discovery Today. 12 (17-18), 688-699 (2007).
  7. Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. Growth factors, matrices, and forces combine and control stem cells. Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).
  8. Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9 (4), 239-252 (2009).
  9. Danhier, F., Feron, O., Preat, V. To exploit the tumor microenvironment: Passive and active tumor targeting of nanocarriers for anti-cancer drug delivery. J Control Release. 148 (2), 135-146 (2010).
  10. Murphy, W. L., McDevitt, T. C., Engler, A. J. Materials as stem cell regulators. Nat Mater. 13 (6), 547-557 (2014).
  11. Patel, A. K., et al. A defined synthetic substrate for serum-free culture of human stem cell derived cardiomyocytes with improved functional maturity identified using combinatorial materials microarrays. Biomaterials. 61, 257-265 (2015).
  12. Zhang, R., et al. A thermoresponsive and chemically defined hydrogel for long-term culture of human embryonic stem cells. Nat Commun. 4, (2013).
  13. Anderson, D. G., Putnam, D., Lavik, E. B., Mahmood, T. A., Langer, R. Biomaterial microarrays: rapid, microscale screening of polymer-cell interaction. Biomaterials. 26 (23), 4892-4897 (2005).
  14. Celiz, A. D., et al. Discovery of a Novel Polymer for Human Pluripotent Stem Cell Expansion and Multilineage Differentiation. Adv Mater. 27 (27), 4006-4012 (2015).
  15. Hansen, A., et al. High-Density Polymer Microarrays: Identifying Synthetic Polymers that Control Human Embryonic Stem Cell Growth. Adv Healthcare Mater. 3 (6), 848-853 (2014).
  16. Mei, Y., et al. A high throughput micro-array system of polymer surfaces for the manipulation of primary pancreatic islet cells. Biomaterials. 31 (34), 8989-8995 (2010).
  17. Saha, K., et al. Surface-engineered substrates for improved human pluripotent stem cell culture under fully defined conditions. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (46), 18714-18719 (2011).
  18. Bettinger, C. J., Langer, R., Borenstein, J. T. Engineering substrate topography at the micro- and nanoscale to control cell function. Angew Chem Int Ed Engl. 48 (30), 5406-5415 (2009).
  19. McMurray, R. J., et al. Nanoscale surfaces for the long-term maintenance of mesenchymal stem cell phenotype and multipotency. Nat Mater. 10 (8), 637-644 (2011).
  20. Sun, Y., Jallerat, Q., Szymanski, J. M., Feinberg, A. W. Conformal nanopatterning of extracellular matrix proteins onto topographically complex surfaces. Nat Methods. 12 (2), 134-136 (2015).
  21. Nitanan, T., et al. Effects of processing parameters on morphology of electrospun polystyrene nanofibers. Korean J Chem Eng. 29 (2), 173-181 (2012).
  22. Liu, L., et al. Chemically-defined scaffolds created with electrospun synthetic nanofibers to maintain mouse embryonic stem cell culture under feeder-free conditions. Biotechnol Lett. 34 (10), 1951-1957 (2012).
  23. Liu, L., et al. Nanofibrous gelatin substrates for long-term expansion of human pluripotent stem cells. Biomaterials. 35 (24), 6259-6267 (2014).
  24. Kamei, K., et al. Phenotypic and transcriptional modulation of human pluripotent stem cells induced by nano/microfabrication materials. Adv Healthcare Mater. 2 (2), 287-291 (2013).
  25. Peerani, R., et al. Niche-mediated control of human embryonic stem cell self-renewal and differentiation. EMBO J. 26 (22), 4744-4755 (2007).
  26. Yamamoto, K., et al. Fluid shear stress induces differentiation of Flk-1-positive embryonic stem cells into vascular endothelial cells in vitro. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 288 (4), 1915-1924 (2005).
  27. Charati, S. G., Stern, S. A. Diffusion of gases in silicone polymers: Molecular dynamics simulations. Macromolecules. 31 (16), 5529-5535 (1998).
  28. Prado-Lopez, S., et al. Hypoxia promotes efficient differentiation of human embryonic stem cells to functional endothelium. Stem Cells. 28 (3), 407-418 (2010).
  29. Yanagihara, K., et al. Prediction of Differentiation Tendency Toward Hepatocytes from Gene Expression in Undifferentiated Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cells and Development. 25 (24), 1884-1897 (2016).
  30. Kamei, K., et al. 3D printing of soft lithography mold for rapid production of polydimethylsiloxane-based microfluidic devices for cell stimulation with concentration gradients. Biomed Microdevices. 17 (2), (2015).
  31. Song, J. H., Kim, H. E., Kim, H. W. Production of electrospun gelatin nanofiber by water-based co-solvent approach. J Mater Sci Mater Med. 19 (1), 95-102 (2008).
  32. Owen, M. J., Smith, P. J. Plasma Treatment of Polydimethylsiloxane. J Adhes Sci Technol. 8 (10), 1063-1075 (1994).
  33. Chen, G. K., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Methods. 8 (5), 424-476 (2011).
  34. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
  35. Kamei, K., et al. An integrated microfluidic culture device for quantitative analysis of human embryonic stem cells. Lab Chip. 9 (4), 555-563 (2009).
  36. Kamei, K., et al. Microfluidic image cytometry for quantitative single-cell profiling of human pluripotent stem cells in chemically defined conditions. Lab Chip. 10 (9), 1113-1119 (2010).
  37. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), 100(2006).
  38. Kohonen, T. Self-Organized Formation of Topologically Correct Feature Maps. Biol Cybern. 43 (1), 59-69 (1982).
  39. Wehrens, R., Buydens, L. M. C. Self- and super-organizing maps in R: The kohonen package. J Stat Softw. 21 (5), 1-19 (2007).
  40. Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., Botstein, D. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (25), 14863-14868 (1998).
  41. Saldanha, A. J. Java Treeview--extensible visualization of microarray data. Bioinformatics. 20 (17), 3246-3248 (2004).
  42. Du, G. S., Fang, Q., den Toonder, J. M. J. Microfluidics for cell-based high throughput screening platformsd-A review. Anal Chim Acta. 903, 36-50 (2016).
  43. Huang, S. B., et al. An integrated microfluidic cell culture system for high-throughput perfusion three-dimensional cell culture-based assays: effect of cell culture model on the results of chemosensitivity assays dagger. Lab Chip. 13 (6), 1133-1143 (2013).
  44. Wang, B. L., et al. Microfluidic high-throughput culturing of single cells for selection based on extracellular metabolite production or consumption. Nat Biotechnol. 32 (5), 473(2014).
  45. Becker, K. A., et al. Self-renewal of human embryonic stem cells is supported by a shortened G1 cell cycle phase. J Cell Physiol. 209 (3), 883-893 (2006).
  46. Neganova, I., Lako, M. G1 to S phase cell cycle transition in somatic and embryonic stem cells. J Anat. 213 (1), 30-44 (2008).
  47. Fox, V., et al. Cell-cell signaling through NOTCH regulates human embryonic stem cell proliferation. Stem Cells. 26 (3), 715-723 (2008).
  48. Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 19 (10), 971-974 (2001).
  49. Kamei, K., et al. Microfluidic-Nanofiber Hybrid Array for Screening of Cellular Microenvironments. Small. 13 (18), (2017).
  50. Sun, J., et al. A Microfluidic Platform for Systems Pathology: Multiparameter Single-Cell Signaling Measurements of Clinical Brain Tumor Specimens. Cancer Res. 70 (15), 6128-6138 (2010).
  51. Theunissen, T. W., Jaenisch, R. Molecular Control of Induced Pluripotency. Cell Stem Cell. 14 (6), 720-734 (2014).
  52. Yoo, H. S., Kim, T. G., Park, T. G. Surface-functionalized electrospun nanofibers for tissue engineering and drug delivery. Adv Drug Del Rev. 61 (12), 1033-1042 (2009).
  53. Dixon, J. E., et al. Combined hydrogels that switch human pluripotent stem cells from self-renewal to differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (15), 5580-5585 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment ArrayNanofiber Array FabricationMicrofluidic Structure AssemblyElectrospinning ProcessStem Cell PhenotypingSingle Cell ProfilingFluorescence ImagingSOM AnalysishPSC Self RenewalPDMS Molding

Related Articles